Summary
Ici nous décrivons deux méthodes non-invasives pour commander chroniquement l'activité neuronale utilisant la chimiogénétique chez les souris. Des gouttes d'oeil ont été employées pour livrer le clozapine-N-oxyde (CNO) quotidiennement. Nous décrivons également deux méthodes pour l'administration prolongée de CNO dans l'eau potable. Ces stratégies de contrôle neuronal chronique nécessitent une intervention minimale réduisant le stress des animaux.
Abstract
Les stratégies chimiogénétiques sont apparues comme des outils fiables pour le contrôle à distance de l'activité neuronale. Parmi ceux-ci, les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) sont devenus l'approche chimiogénétique la plus populaire utilisée dans les neurosciences modernes. La plupart des études fournissent le ligand clozapine-N-oxyde (CNO) à l'aide d'une seule injection intrapéritonéale, qui convient à l'activation/inhibition aigue de la population neuronale ciblée. Il n'existe cependant que quelques exemples de stratégies de modulation chronique des neurones contrôlés par DREADD, dont la majorité reposent sur l'utilisation de systèmes d'administration nécessitant une intervention chirurgicale. Ici, nous élargissons sur deux stratégies non-invasives pour fournir le CNO ligand pour manipuler chroniquement la population neurale chez les souris. CNO a été administré soit en utilisant répétitif (quotidiennement) des gouttes oculaires, ou chroniquement à travers l'eau potable de l'animal. Ces paradigmes non invasifs se traduisent par une activation robuste des récepteurs de concepteur qui ont persisté tout au long des traitements CNO. Les méthodes décrites ici offrent des alternatives pour le contrôle chronique DREADD-négocié de l'activité neuronale et peuvent être utiles pour des expériences conçues pour évaluer le comportement chez les animaux en mouvement libre, en se concentrant sur les méthodes de livraison CNO moins invasives.
Introduction
Les progrès techniques dans le domaine des neurosciences ont permis aux scientifiques d'identifier et de contrôler précisément l'activité de certaines populations neuronales1. Cela a contribué à mieux comprendre la base des circuits neuronaux et leur impact sur le comportement animal, ainsi que, la révision des dogmes établis2,3. Parmi ces nouveaux outils, les stratégies optogénétiques et chimiogénétiques ont eu un impact profond non seulement sur la qualité des découvertes, mais aussi sur la façon dont les expériences sont conçues et conçues4. Dans le présent manuscrit, nous nous concentrons sur les stratégies chimiogénétiques pour contrôler l'activation des neurones par l'intermédiaire de stratégies de récepteur-ligand modifiées. Les récepteurs de concepteur exclusivement activés par les drogues de concepteur (DREADDs) représentent l'un des outils chimiogènes les plus populaires pour le contrôle à distance de l'activité neuronale, tel qu'examiné par Roth 20165. Les DREADD utilisent des récepteurs d'acétylcholine muscarinique modifiés qui sont spécifiquement activés par un ligand inerte, clozapine-N-oxyde (CNO)6.
La plupart des études utilisent CNO administré par injections intrapéritonéales (i.p.), qui contrôle efficacement la posologie et le moment de l'activation des récepteurs modifiés d'une manière aigue. Cependant, lorsque l'activation dREADD répétitive ou chronique est nécessaire, l'utilisation de multiples injections i.p. devient irréalisable. Pour résoudre ce problème, différentes stratégies pour la livraison chronique de CNO ont été rapportées, y compris les minipompes implantées7 et les cannulas intracrâniennes8,9. À des degrés différents, toutes ces stratégies causent le stress et la douleur des animaux10, et nécessitent une intervention chirurgicale qui pourrait également avoir un impact direct sur les réponses comportementales à tester11. Ici, nous décrivons trois stratégies non-invasives pour l'administration chronique de CNO.
À cette fin, des souris ont été injectées stéréotaxiquement dans l'hippocampe avec un virus adéno-associé (AAV) codant une version machinée du récepteur muscarinique M3 excitateur (hM3Dq) qui, lorsqu'il est activé par le ligand CNO conduit à l'éclatement-comme le tir de neurones6. Il a été précédemment montré qu'une seule goutte d'oeil contenant CNO peut effectivement susciter une activation robuste des neurones DREADD-exprimant12. Ici nous décrivons une méthode modifiée pour la livraison répétitive des gouttes d'oeil. Pour obtenir un contrôle chronique et durable des récepteurs de concepteur, nous décrivons ensuite une stratégie non invasive pour livrer CNO aux souris par l'eau potable. Enfin, nous décrivons un paradigme alternatif pour la livraison de CNO dans l'eau potable au cours d'une fenêtre de temps restreint. L'activité locomotrice des souris, ainsi que le comportement de consommation et la consommation de solutions caloriques douces, sont la plupart du temps limitées à la partie foncée du cycle lumière/obscurité13,14. Par conséquent, nous avons adopté un protocole basé sur la préférence de la souris pour le saccharose. En mesurant l'induction du gène c-Fos immédiat-précoce dans les cellules infectées par l'AAV, comme une lecture pour l'activation neuronale12,15, nous avons constaté que ces stratégies de livraison CNO activent vigoureusement les neurones contrôlés par DREADD sur étendu Durées.
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Protocol
Tous les animaux ont été manipulés conformément aux lignes directrices des Comités de soins et d'utilisation des animaux de l'Institut national de la santé mentale (NIMH). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et le nombre d'animaux utilisés.
1. Injections de virus associées à l'adéno dans l'hippocampe
REMARQUE: Des souris mâles sauvages de type de fond mélangé (B6/129 F1 hybride, 3 mois) étaient pour stéréotaxément injecté avec un AAV codant le récepteur muscarinic de M3 (hM3Dq) dans l'hippocampe. Pendant toute l'expérience, les souris ont été unifamiliales, sous une lumière régulière de 12 h : cycle de 12 h sombre (T24), avec accès à la nourriture et à l'eau ad libitum.
- Avant d'effectuer des chirurgies stéréotaxiques, nettoyez et stérilisez le cadre stéréotaxique et tous les instruments nécessaires.
REMARQUE : Des rideaux chirurgicaux pourraient être utilisés pour maintenir un champ stérile et réduire la perte de chaleur de la souris. - Anesthésiez profondément la souris à l'aide d'isoflurane. Pour ce faire, ajustez d'abord le débit mètre d'oxygène à environ 1,5 L/min, puis ajustez le vaporisateur d'isoflurane à environ 3-5% pour l'induction et environ 1-3% pour l'entretien.
- Pour s'assurer que l'animal est complètement inconscient, pincez la patte de la souris; l'animal est correctement anesthésié lorsque la réponse hésitante à pincer est absente.
- Placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la stabilité de la température corporelle de la souris.
- Raser le haut de la tête et fixer la tête de la souris au cadre stéréotaxique. Ensuite, appliquez un lubrifiant protecteur oculaire sur les yeux, nettoyez la surface en frottant avec de l'iode povidone et 70% d'éthanol, et exposez le crâne à l'aide d'un scalpel stérile.
- Calibrer le cadre au point bregma, puis percer à une coordonnées médiales-latérales de 2,9 mm et une coordonnées antérieure-postérieure -2,7 mm pour cibler l'hippocampe.
REMARQUE : Si une autre cible cérébrale doit être injectée, déterminez les coordonnées souhaitées pour l'injection à l'aide de l'atlas de souris Paxinos et Franklin16. - Une fois que le cerveau est exposé, injecter unilatéralement 90 nL de l'AAV à la profondeur dorsal-ventral de -3,0 mm dans l'hippocampe à l'aide d'un micro-injecteur et tiré pipettes microcapillaires (Figure 1A).
REMARQUE: Voir tableau des matériaux pour le taquet de AAV utilisé dans cette expérience. Pour d'autres zones du cerveau, ajuster le volume d'injection AAV au besoin. - À la fin de l'intervention chirurgicale, fermez l'incision avec des sutures en nylon et appliquez des antibiotiques topiques sur le site de la plaie.
- Administrer les analgésiques (buprénorphine, 0,1 mg/kg) de façon systémique immédiatement après la chirurgie, et 4-6 heures après.
- Commençant 4 semaines après injection, soumettez des souris à n'importe lequel des paradigmes décrits dans la section suivante aux neurones de contrôle chronique exprimant le récepteur excitateur de concepteur.
2. Livraison répétitive de CNO utilisant des gouttes pour les yeux
- Acclimater les animaux à la manipulation en frottant chaque souris 3 min par jour pendant 3-4 jours avant l'administration de gouttes pour les yeux.
- Dissoudre clozapine-N-oxyde (CNO, 5 mg) dans 1 ml de solution saline stérile de 0,9 % (solution de stock : 5 mg CNO/mL). Conserver la solution au réfrigérateur à 4 oC.
- Pesez chaque souris avant de commencer l'expérience pour déterminer la quantité de CNO à livrer. Utilisez une goutte de 1 à 3 l (par œil) pour obtenir un poids corporel de 1,0 mg de CNO/kg.
REMARQUE : Par exemple, une souris de 20 g devrait recevoir des gouttes oculaires bilatérales (2 ll chacune). - Délivrer les gouttes pour les yeux pendant la phase inactive (légère) des souris, 2 h avant que les lumières s'éteignent(zeitgeber time (ZT) 10). Dans les cas où le CNO doit être livré pendant la phase active (sombre) des souris, assurez-vous la présence d'une lumière rouge faible pour une bonne manipulation des animaux.
REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour éviter de perturber le cycle circadien (et léger/sombre) des animaux expérimentaux.- À l'aide d'une micropipette P10, chargez la quantité requise (1-3 l) de la solution CNO pour atteindre 1,0 mg CNO/kg.
REMARQUE : Utilisez une nouvelle pointe de pipette stérile pour chaque goutte pour les yeux. Dans cet ensemble d'expériences, des gouttes oculaires bilatérales de CNO ont été exécutées ; cependant, si une concentration plus faible de CNO est exigée, des gouttes unilatérales d'oeil pourraient également être appliquées. - Immobiliser la souris par des éraflures.
- Expulser lentement la solution jusqu'à ce qu'une gouttelette stable se forme sur la pointe de la pipette.
- Amener soigneusement la gouttelette près de la cornée de l'œil de la souris jusqu'à ce que la solution soit livrée. La pointe de la pipette ne doit jamais entrer en contact avec l'œil de la souris.
- Relâchez la souris, la remettant dans sa cage d'origine.
- À l'aide d'une micropipette P10, chargez la quantité requise (1-3 l) de la solution CNO pour atteindre 1,0 mg CNO/kg.
- Répétez cette procédure tous les jours pendant 5 jours.
REMARQUE : Cette durée peut être ajustée selon les exigences expérimentales. - Pour les expériences de contrôle, utilisez des souris à injection AAV/DREADD soumises à un traitement fictif (gouttes oculaires contenant uniquement une solution saline) et des souris injectées avec un vecteur vide (p. ex. AAV/mCherry) exposées au protocole cNO décrit de gouttes oculaires.
3. Traitement chronique cNO administré par l'eau potable
- Faire de petites bouteilles à l'aide de tubes coniques de 50 ml (plastiques) et de becs d'arrêt en caoutchouc; couvrir de papier d'aluminium pour éviter tout effet à médiation légère sur la stabilité du CNO.
- Trois jours avant de commencer avec le traitement CNO, remplacer les bouteilles d'eau régulières par de petites bouteilles, contenant 10 ml d'eau régulière, pour permettre aux souris de s'acclimater à eux. Fixez les bouteilles dans les cages à l'aide de ruban adhésif.
- Mesurez la consommation quotidienne d'eau pour chaque souris.
- Pesez chaque souris avant de commencer l'expérience.
- Dissoudre clozapine-N-oxyde (CNO, 5 mg) dans 1 ml de solution saline stérile de 0,9%. Réfrigérer la solution de bouillon à 4 oC.
- Utilisez le poids corporel et la quantité moyenne d'eau consommée pour définir la concentration de la solution CNO pour atteindre 1,0 mg CNO/ kg (poids corporel).
REMARQUE : Les souris mâles adultes (20 g de poids corporel) consomment 5 ml d'eau par jour (figure 2A). Par conséquent, pour atteindre une concentration de CNO de 1 mg CNO/kg, 6,4 OL de solution de stock CNO doivent être ajoutés à un volume final de 8 ml d'eau (concentration finale : 4 g CNO/mL). Ainsi, la dose de CNO pour un animal de 20 g qui boit 5 ml d'eau par jour donne 1 mg de CNO/kg. - Déterminer la dose optimale de CNO qui affiche l'efficacité maximale avec une concentration minimale de CNO en testant une gamme de concentrations. Effectuez une analyse de réponse de dose pour déterminer la dose optimale de CNO pour la méthode d'eau potable.
REMARQUE : Les doses suivantes de CNO ont été examinées pour cette expérience : 1,0 mg/mL, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL et saline. 1,0 mg CNO/kg a été testé pour la première fois, basé sur des protocoles i.p. et eye-drops. - Le jour 1, remplissez la bouteille avec 8 ml d'eau ordinaire et ajoutez la quantité requise de CNO.
REMARQUE: Cette quantité d'eau est suffisante pour 24 h d'accès à l'eau ad libitum pour une souris mâle adulte. Dans le cas où d'autres espèces de rongeurs sont utilisées, d'abord mesurer la quantité d'eau consommée quotidiennement pour déterminer le volume nécessaire. - Surveiller la santé des animaux tout au long du protocole pour s'assurer qu'il n'y a pas d'effets secondaires indésirables causés par la consommation d'eau et de CNO.
- Après 24 h, remplacer les bouteilles par de l'eau douce et une solution CNO. Enregistrez le volume consommé la veille.
- Disposer de la solution CNO d'eau et de CNO qui n'a pas été consommée dans des conteneurs à déchets. Jetez les bouteilles en plastique et remplacez les bouchons en caoutchouc tous les jours, après les avoir aseptisés selon les directives de l'installation animale.
REMARQUE : Ne mélangez pas les déchets aqueux avec des solvants organiques. Communiquez avec le Service d'élimination des produits chimiques pour obtenir des instructions sur l'entreposage et le ramassage. - Remplacer les bouteilles à la même heure tous les jours pendant 5 jours.
REMARQUE : Cette durée peut être ajustée selon les exigences expérimentales. - Inclure les groupes témoins, tel que décrit à l'étape 2.6.
4. Traitement CNO restreint utilisant la préférence des souris pour le saccharose
- 3 jours avant de commencer avec le traitement CNO, placez une petite bouteille contenant 10 ml d'eau - 1% de saccharose sur la cage, de préférence loin de la bouteille d'eau d'origine.
REMARQUE : Utilisez les mêmes petites bouteilles décrites à l'étape 3.1. - Exposer les animaux à l'eau : 1 % de saccharose pendant la dernière partie de leur phase active (ZT 18 à 24). Après cette exposition, retirer la bouteille avec de l'eau et du saccharose de la cage.
REMARQUE : Différentes fenêtres temporelles de la livraison CNO pourraient être utilisées. En outre, les souris pourraient être placées sous un cycle de lumière/obscurité inversée, où l'onentend la lumière se produit dans les heures du soir pour faciliter l'accouchement par L'ONC. - Mesurer la consommation quotidienne d'eau de 1 % de saccharose pour chaque souris.
- Pesez chaque souris avant de commencer l'expérience.
- Utilisez le poids corporel et la quantité moyenne d'eau consommée par 1 % pour déterminer la dose de solution CNO pour atteindre 1,0 mg CNO/kg (poids corporel).
REMARQUE : La dose optimale de CNO qui affiche l'efficacité maximale avec une concentration minimale de CNO devrait être testée, comme expliqué à l'étape 3.6. - Le jour 1, remplissez les bouteilles de 5 ml d'eau, 1 % de saccharose et cNO (1 mg CNO/Kg) et placez-les sur la cage (toujours au même endroit) pendant la fenêtre temporelle déterminée.
- À la fin de la fenêtre de temps restreint, retirez les bouteilles et mesurez la quantité d'eau , le saccharose et le CNO consommé.
REMARQUE : Les matériaux et les solutions sont désinfectés ou jetés comme décrit précédemment à l'étape 3.11. - Répétez cette procédure tous les jours pendant 5 jours.
REMARQUE : Cette durée peut être ajustée selon les exigences expérimentales. - Inclure un groupe témoin, tel que décrit à l'étape 2.6.
5. Analyse des données
- Perfuse souris intracardially avec 4% paraformaldehyde (PFA) soit 2 ou 6 h après avoir reçu le dernier répétitif (5ème jour) CNO eye-drop. Lorsque le CNO est livré par l'eau potable, remplacez l'eau CNO par de l'eau à la fin de la phase active de la souris, puis perflez la souris après un accès post-CNO de 2 ou 6 h.
REMARQUE : Si l'exposition à la lumière pouvait affecter l'induction du c-Fos dans la zone d'intérêt, gardez les souris dans l'obscurité constante pendant le dernier jour des expériences, et avant la perfusion. - Disséquez soigneusement le cerveau dehors et submergez dans la solution de PFA de 4% pendant 9-12h.
- Après fixation de PFA, cryoprotégez le tissu cérébral à l'aide d'une solution de saccharose de 30 % (attendez que le cerveau coule), puis sectionnez le cerveau à l'aide d'un cryostat.
- Transférer les sections du cerveau coronal (35 m) dans une solution contenant 1x PBS, 10% d'albumine de sérum bovin et 0,3% De Triton X-100 pour 1 h à température ambiante.
- Incuber les sections du cerveau avec une solution d'anticorps anti-c-Fos (1:2500) à 4 oC pendant la nuit avec une agitation constante.
- Après 3 lavages de 5 min chacun avec une solution contenant 1x PBS et 0,3% Triton X-100, incuber les échantillons avec un anticorps secondaire conjugué Alexa (1:500) solution pour 1 h à température ambiante loin de la lumière et avec une agitation constante.
- Obtenir des images numériques à l'aide d'un microscope confocal. Assembler et traiter les images capturées à l'égard d'un logiciel d'édition et d'analyse de photos (p. ex., Adobe Photoshop).
- Pour l'analyse des données, découpez et mesurez la zone infectée par l'AAV (cellules MCherry(MCherry) à l'aide du logiciel ImageJ, et quantifiez le nombre de cellules c-Fos (MD) dans cette région pour obtenir le nombre de cellules activées par zone. Combinez les résultats obtenus à partir de 3 sections distinctes par animal.
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Representative Results
Nous avons observé que la livraison répétitive de CNO utilisant des gouttes d'oeil a suscité une induction robuste de l'expression de c-Fos dans la plupart des neurones infectés (figure 1C),montrant que l'efficacité de la livraison de CNO est soutenue pendant l'exposition répétitive. En outre, une induction significative de c-Fos a été observée dans les échantillons prélevés 2 h après le traitement CNO, par rapport aux échantillons obtenus 6 h après l'exposition au CNO (Figures 1D-E), démontrant que les changements induits par CNO sont dépendants du temps.
Nous avons ensuite mesuré l'efficacité du traitement chronique CNO administré par l'eau potable. Nous avons observé que la consommation quotidienne d'eau et d'ONC n'était pas significativement différente par rapport au volume total d'eau ordinaire consommée (figure 2A). De même, la quantité d'eau consommée par 1 % de saccharose pendant la nuit (6 h de fenêtre de temps) n'a pas été affectée par l'ajout de CNO (figure 2B). De plus, aucune différence dans la consommation quotidienne (5 jours) de l'eau , de l'ONC (figure 2C) et de l'eau, du saccharose et du CNO (figure2D)n'a été constatée tout au long de l'expérience pour tous les animaux.
Semblable à ce que nous avons trouvé utilisant CNO eye-drops, l'induction robuste de c-Fos a été observée après 2 h mais pas 6 h sur l'accès CNO (Figures 2E-F).
Enfin, nous avons mesuré la réponse dose de CNO ajouté à l'eau potable. Pour ce faire, les souris ont été exposées aux doses suivantes de CNO : 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, saline. Dans tous les cas, les animaux ont été perfus 2 h après l'exposition cNO. Nous avons constaté qu'il existe un seuil clair d'efficacité pour le CNO, où une faible dose de CNO (0,1 mg/mL) n'entraîne pas l'activation du c-Fos par rapport au contrôle salin, tandis que des doses plus élevées (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL et 1,0 mg/mL) ont induit une induction robuste et similaire de c-Fos ( Figure 2G).
Figure 1 : Livraison répétitive de CNO à l'aide de gouttes pour les yeux. (A) AAV/hM3Dq-mCherry a été injecté stéréotaxiquement dans l'hippocampe des souris mâles adultes (3 mois). (B) Quatre semaines après l'injection, CNO a été administré à l'aide de gouttes oculaires une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Une dose de 1,0 mg CNO/kg a été utilisée. (C) Enfin, des souris ont été sacrifiées, et le tissu cérébral a été testé pour l'immunoréactivité c-Fos (verte) dans la zone infectée par l'AAV (cellules mCherry-positives, rouge). Une section coronale représentative du site d'injection et l'activation c-Fos à médiation CNO est montrée. (D) Le nombre de cellules positives c-Fos dans la zone infectée par l'AAV a été mesuré chez des souris qui ont été perfusées de 2 ou 6 h après la dernière administration du CNO. Les données sont moyennes ' SEM. 'p 'lt; 0.001; par le t-test de l'étudiant (n - 2-3 souris). (E) Des images représentatives pour les deux groupes sont affichées. Barre d'échelle: 100 m S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Traitement chronique de l'ONC administré par l'eau potable. (A) Aucune différence dans la consommation totale de liquide n'a été observée entre les animaux témoins (eau) ou traités (eau et CNO, dose : 1,0 mg CNO/kg). Les données sont moyennes - SEM (n 13-14 souris). (B) De même, aucune différence significative n'a été observée dans le volume d'eau consommé à 1 % de saccharose (pendant une fenêtre de 6 h), après l'ajout de CNO (1,0 mg/ Kg). Les données sont moyennes - SEM (n ' 5 souris). (C) La consommation quotidienne d'eau et de CNO (1,0 mg/kg) pour les souris individuelles est montrée. Aucune différence dans la consommation quotidienne n'a été observée. Les données sont moyennes - SEM (n ' 5 souris). (D) La consommation quotidienne de liquide (pendant une fenêtre de temps de 6 h) de 1 % de saccharose et de CNO (1,0 mg/kg) pour les souris individuelles est montrée. Aucune différence dans la consommation quotidienne n'a été observée. Les données sont moyennes ' SEM (n ' 3 souris). (E) 2 ou 6 h après la dernière administration de CNO, des souris ont été sacrifiées, et le nombre de cellules positives de c-Fos a été quantifié dans la zone AAV-infectée. Les données sont moyennes ' SEM. 'p 'lt; 0.001; par le t-test de l'étudiant (n ' 5 souris). (F) Des sections coronales cérébrales ont été testées pour l'immunoréactivité c-Fos (verte) dans la région infectée par l'AAV (cellules positives, rouge). Des images représentatives sont affichées. (G) Quatre doses de CNO ont été administrées (0,1, 0,25, 0,5 et 1,0 mg CNO/kg), et l'induction c-Fos a été mesurée. Les données sont moyennes ' SEM. 'p 'lt; 0.001; par ANOVA, suivi du test de Tukey (n ' 2 souris). Barre d'échelle: 100 m S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
DREADDs ont émergé comme une approche populaire et efficace pour manipuler à distance l'activité neuronale17. La conception de stratégies alternatives pour la livraison de CNO augmentera largement le spectre des options disponibles pour des paramètres expérimentaux spécifiques. En outre, les stratégies non invasives pour la livraison de CNO minimisent toute mauvaise interprétation potentielle des résultats en réduisant les effets secondaires indésirables qui peuvent avoir un impact direct sur la santé de l'animal. Ici, nous avons décrit deux stratégies non invasives pour la livraison de CNO qui confèrent une activation robuste des DREADDs (hM3Dq) et offrent un large éventail de possibilités. En outre, nous croyons que les protocoles décrits ici pourraient également être utiles pour différentes variantes dREADD pour la manipulation neuronale, y compris les récepteurs muscariniques ou opioïdes génétiquement modifiés.
La livraison de CNO utilisant des gouttes oculaires répétitives représente une alternative indolore aux injections intrapéritonéales répétitives de CNO tout en préservant le pouvoir de commander avec précision la posologie et le moment de la livraison de CNO. Par conséquent, nous vous recommandons d'utiliser ce protocole lorsque l'activation dREADD répétitive est nécessaire. Les gouttes pour les yeux sont également l'option la moins coûteuse pour la livraison de CNO, en particulier par rapport au protocole utilisant CNO ajouté à l'eau potable. CNO livré par l'eau potable, d'autre part, confère une activation chronique et soutenue de DREADDS, en évitant toute manipulation de la souris. Il est important de mentionner que ce protocole n'a pas de contrôle précis sur le moment de la livraison de CNO. Une troisième alternative, l'accès limité dans le temps à une solution de saccharose contenant CNO, combine des avantages des deux protocoles précédemment discutés. Cette stratégie est à la fois non invasive, répétitive et facile à exécuter. En outre, il offre un meilleur contrôle du calendrier de livraison CNO par rapport à l'accès de 24 h à l'eau avec CNO. Une mise en garde de cette approche est qu'elle ne peut être utilisée que pendant la phase active des animaux. Nous recommandons d'utiliser les deux stratégies impliquant CNO dans l'eau potable en combinaison avec des caméras infrarouges ou un système de lick-o-mètre pour obtenir des informations temporelles précises sur la consommation de CNO et, par conséquent, l'activation DREADD.
Des effets à long terme conférés par CNO livrés par l'eau potable ont été précédemment rapportés. Nous avons appliqué avec succès un traitement chronique de CNO (5 'g/mL) pendant 14 jours consécutifs15 pour évaluer les conséquences comportementales de l'activation tonique d'un circuit thalamo-cortical impliqué dans le contrôle d'humeur. Alternativement, CNO fourni dans l'eau potable à une concentration de 40 mg/L a été utilisé pour moduler chroniquement l'activité des neurones sérotoninergiques du noyau de raphe dorsal18, tandis que la fonction des cellules pancréatiques a été contrôlée en utilisant CNO à une concentration de 0,25 mg/mL d'eau19. Combinés, ces résultats suggèrent que différentes concentrations de CNO peuvent être réglées pour contrôler efficacement les DREADD. Ici, nous avons constaté que différentes doses de CNO ajoutées à l'eau potable ont suscité une activation similaire de c-Fos, suggérant qu'une analyse dose-réponse devrait être effectuée pour définir la dose la plus basse et efficace de CNO exigée. Des études récentes ont montré que CNO n'est pas entièrement pharmacologiquement inerte20; en outre, il a également été démontré que l'activation in vivo des DREADD est médiée par la clozapine métabolite CNO, qui a plusieurs cibles endogènes21. Par conséquent, les auteurs suggèrent d'utiliser des doses de sous-seuil de clozapine, au lieu de fortes doses de CNO. Bien que nous n'ayons pas évalué l'efficacité de la clozapine dans les méthodes décrites, nous avons constaté que la concentration de CNO pourrait être réduite sans réduire de manière significative l'activation neuronale, et donc, minimisant des effets secondaires provoqués par le CNO-à-clozapine conversion.
En résumé, les stratégies présentées ici représentent des schémas potentiels pour la livraison de CNO qui peuvent être facilement adaptés à une variété de conceptions expérimentales. Ils ont été conçus comme des stratégies non invasives qui peuvent être utiles pour l'activation répétitive ou chronique cNO-négociée des neurones DREADD-contrôlés, réduisant l'impact de la livraison de CNO sur le comportement animal.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par le programme de recherche intra-muros de l'Institut national de santé mentale (ZIA MH002964-02). Nous tenons à remercier le soutien du NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
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