Summary
Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.
Abstract
Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.
Introduction
Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales1. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñanlosexperimentos 4. En el presente manuscrito, nos centramos en estrategias quimiogenéticas para controlar la activación de las neuronas a través de estrategias de receptor-ligand diseñadas. Los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADD) representan una de las herramientas quimiogenéticas más populares para el control remoto de la actividad neuronal, según lo revisado por Roth 20165. Los DREADD utilizan receptores de acetilcolina muscarínicos modificados que son activados específicamente por un ligando inerte, clozapina-N-óxido (CNO)6.
La mayoría de los estudios utilizan CNO administrado por inyecciones intraperitoneales (i.p.), que controla eficazmente la dosis y el momento de la activación de receptores diseñados de una manera aguda. Sin embargo, cuando se requiere activación repetitiva o crónica DREADD, el uso de múltiples inyecciones de i.p. se vuelve inviable. Para abordar este problema, se han reportado diferentes estrategias para la entrega crónica de CNO, incluyendo minibombas implantadas7 y cánulas intracraneales8,9. En diferentes grados, todas estas estrategias causan el estrés y el dolor de los animales10,y requieren una intervención quirúrgica que también podría tener un impacto directo en las respuestas conductuales que se probarán11. Aquí, describimos tres estrategias no invasivas para el parto crónico de CNO.
Para ello, los ratones fueron inyectados estereotaxicamente en el hipocampo con un virus asociado a adeno (AAV) que codifica una versión de ingeniería del receptor muscarínico M3 excitatorio (hM3Dq) que cuando se activa por el ligando CNO conduce a la cocción en forma de ráfaga de neuronas6. Anteriormente se demostró que una sola gota ocular que contiene CNO puede efectivamente obtener una activación robusta de las neuronas que expresan DREADD12. Aquí describimos un método modificado para la entrega repetitiva de gotas para los ojos. Para lograr un control crónico y sostenido de los receptores de diseño, a continuación describimos una estrategia no invasiva para entregar CNO a ratones a través del agua potable. Por último, describimos un paradigma alternativo para la entrega de CNO en agua potable durante una ventana de tiempo restringida. La actividad locomotora de los ratones, así como el comportamiento de beber y el consumo de soluciones calóricas dulces, se limitan principalmente a la porción oscura del ciclo de luz/oscuridad13,14. Por lo tanto, adoptamos un protocolo basado en la preferencia del ratón por la sacarosa. Mediante la medición de la inducción del gen inmediato-temprano c-Fos en células infectadas por AAV, como una lectura para la activación neuronal12,15, encontramos que estas estrategias de administración de CNO activan de forma robusta las neuronas controladas por DREADD en Duraciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el número de animales utilizados.
1. Inyecciones de virus asociados a los adenos en el hipocampo
NOTA: Los ratones machos de tipo salvaje de fondo mixto (híbrido B6/129 F1, de 3 meses de edad) fueron inyectados estereotaxically con un AAV que codifica el receptor muscarínico M3 (hM3Dq) en el hipocampo. Durante todo el experimento, los ratones fueron de una sola casa, bajo una luz regular de 12 h: 12 h ciclo oscuro (T24), con acceso a alimentos y agua ad libitum.
- Antes de realizar cirugías estereotaxicas, limpie y esterilice el marco estereotaxico y todos los instrumentos necesarios.
NOTA: Las cortinas quirúrgicas se pueden utilizar para mantener un campo estéril y reducir la pérdida de calor del ratón. - Anestetizar profundamente el ratón usando isoflurano. Para ello, primero ajuste el medidor de flujo de oxígeno a aproximadamente 1,5 L/ min, y luego ajuste el vaporizador de isoflurano a aproximadamente 3-5% para la inducción y aproximadamente 1-3% para el mantenimiento.
- Para asegurarse de que el animal está completamente inconsciente, pellizque la pata del ratón; el animal se anestesia adecuadamente cuando la respuesta estremezante al pellizcar está ausente.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la estabilidad de la temperatura corporal del ratón.
- Afeitar la parte superior de la cabeza y fijar la cabeza del ratón al marco estereotaxico. Luego, aplicar lubricante protector ocular en los ojos, limpiar la superficie frotando con povidona-yodo y 70% de etanol, y exponer el cráneo usando un bisturí estéril.
- Calibrar el marco al punto bregma, luego perforar en una coordenada medial-lateral de 2,9 mm y una coordenada anterior-posterior -2,7 mm para apuntar al hipocampo.
NOTA: Si es necesario inyectar otro objetivo cerebral, determine las coordenadas deseadas para la inyección utilizando el atlas de ratón Paxinos y Franklin16. - Una vez que el cerebro está expuesto, inyectar unilateralmente 90 nL del AAV a la profundidad dorsal-ventral de -3,0 mm en el hipocampo utilizando un microinyector y pipetas microcapilares extraídas (Figura1A).
NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para el valorador de AAV utilizado en este experimento. Para otras áreas del cerebro, ajuste el volumen AAV de la inyección según sea necesario. - Al final del procedimiento quirúrgico, cierre la incisión con suturas de nylon y aplique antibióticos tópicos en el sitio de la herida.
- Administrar analgésicos (buprenorfina, 0,1 mg/kg) sistémicamente inmediatamente después de la cirugía, y 4-6 horas después.
- A partir de 4 semanas después de la inyección, someten a los ratones a cualquiera de los paradigmas descritos en la siguiente sección para controlar crónicamente las neuronas que expresan el receptor excitatorio de diseño.
2. Entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos
- Aclimatar a los animales a manipular desalizando cada ratón 3 minutos al día durante 3-4 días antes de la administración de gotas para los ojos.
- Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9% (solución en stock: 5 mg de CNO/ml). Mantener la solución refrigerada a 4oC.
- Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento para determinar la cantidad de CNO que se entregará. Utilice 1-3 l de gota (por ojo) para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg de peso corporal.
NOTA: Por ejemplo, un ratón de 20 g debe recibir gotas oculares bilaterales (2 l cada una). - Entregar las gotas oculares durante la fase inactiva (ligera) de los ratones, 2 h antes de que las luces se apaguen (hora dezeitgeber (ZT) 10). En los casos en que el CNO deba administrarse durante la fase activa (oscura) de los ratones, asegúrese de la presencia de luz roja tenue para un manejo adecuado de los animales.
NOTA: Se deben tomar precauciones para evitar interrumpir el ciclo circadiano (y claro/oscuro) de los animales experimentales.- Con una micropipeta P10, cargue la cantidad requerida (1-3 l) de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg.
NOTA: Utilice una punta de pipeta nueva y estéril para cada gota para los ojos. En este conjunto de experimentos, se realizaron gotas oculares bilaterales de CNO; sin embargo, si se requiere una concentración más baja de CNO, también se podrían aplicar gotas oculares unilaterales. - Inmovilizar el ratón a través de scruff.
- Expulse lentamente la solución hasta que se forme una gota estable en la punta de la pipeta.
- Lleve cuidadosamente la gota cerca de la córnea del ojo del ratón hasta que se entregue la solución. La punta de la pipeta nunca debe ponerse en contacto con el ojo del ratón.
- Suelte el ratón, colocándolo de nuevo en su jaula de casa.
- Con una micropipeta P10, cargue la cantidad requerida (1-3 l) de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg.
- Repita este procedimiento todos los días durante 5 días.
NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales. - Para experimentos de control, utilice ratones inyectados con AAV/DREADD sometidos a tratamiento falso (gotas para los ojos que contengan solo solución salina) y ratones inyectados con un vector vacío (por ejemplo, AAV/mCherry) expuestos al protocolo cNO-drops descrito.
3. Tratamiento crónico de CNO entregado a través del agua potable
- Hacer botellas pequeñas usando tubos cónicos de 50 ml (plástico) y boquillas de tapón de goma; cubierta con papel de aluminio para evitar efectos mediados por la luz sobre la estabilidad de La CNO.
- Tres días antes de comenzar con el tratamiento de CNO, sustituya las botellas de agua regulares por botellas pequeñas, que contengan 10 ml de agua regular, para permitir que los ratones se aclimaten a ellas. Fije las botellas a las jaulas con cinta adhesiva.
- Mida el consumo diario de agua para cada ratón.
- Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.
- Disolver clozapina-N-óxido (CNO, 5 mg) en 1 ml de solución salina estéril al 0,9%. Refrigerar la solución de stock a 4oC.
- Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua consumida para definir la concentración de solución CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
NOTA: Los ratones machoadultos adultos (20 g de peso corporal) consumen 5 ml de agua al día (Figura2A). Por lo tanto, para lograr una concentración de CNO de 1 mg de CNO/kg, se debe añadir 6,4 l de solución de cno a un volumen final de 8 ml de agua (concentración final: 4 g de CNO/ml). Por lo tanto, la dosis de CNO para un animal de 20 g que bebe 5 ml de agua al día da como resultado 1 mg de CNO/kg. - Determinar la dosis óptima de CNO que muestra la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO mediante el ensayo de un rango de concentraciones. Realice un análisis de respuesta a la dosis para determinar la dosis óptima de CNO para el método de agua potable.
NOTA: Se probaron las siguientes dosis de CNO para este experimento: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml y salina. Se probó por primera vez 1,0 mg de CNO/kg, basándose en protocolos i.p. y de gotas para los ojos. - En el día 1, llenar la botella con 8 ml de agua regular y añadir la cantidad requerida de CNO.
NOTA: Esta cantidad de agua es suficiente para 24 horas de acceso al agua ad libitum para un ratón macho adulto. En caso de que se utilicen otras especies de roedores, primero mida la cantidad de agua consumida diariamente para determinar el volumen necesario. - Controlar la salud de los animales a lo largo del protocolo para asegurarse de que no hay efectos secundarios adversos causados por el consumo de agua + CNO.
- Después de 24 h, sustituya las botellas por agua dulce + solución de CNO. Registre el volumen consumido durante el día anterior.
- Deseche el agua + la solución CNO que no se consumió en los contenedores de residuos. Deseche las botellas de plástico y sustituya los tapones de goma todos los días, después de desinfectarlos de acuerdo con las directrices de las instalaciones para animales.
NOTA: No mezcle residuos acuosos con disolventes orgánicos. Póngase en contacto con el Servicio de Eliminación De Productos Químicos para obtener instrucciones sobre el almacenamiento y la recogida. - Sustituya las botellas a la misma hora todos los días durante 5 días.
NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales. - Incluya grupos de control, como se describe en el paso 2.6.
4. Tratamiento restringido de CNO con preferencia de ratones por sacarosa
- 3 días antes de comenzar con el tratamiento con CNO, coloque una botella pequeña que contenga 10 ml de agua + 1% de sacarosa en la jaula, preferiblemente lejos de la botella de agua original.
NOTA: Utilice las mismas botellas pequeñas descritas en el paso 3.1. - Exponer a los animales al agua + 1% sacarosa durante la última porción de su fase activa (ZT 18 – 24). Después de esta exposición, retire la botella con agua + sacarosa de la jaula.
NOTA: Se podrían utilizar diferentes ventanas de tiempo de entrega de CNO. Además, los ratones podrían colocarse bajo un ciclo invertido de luz/oscuridad, donde el inicio de la luz se produce en las horas de la noche para facilitar la entrega de CNO. - Mida el consumo diario de agua + 1% de sacarosa para cada ratón.
- Pesar cada ratón antes de iniciar el experimento.
- Utilice el peso corporal y la cantidad media de agua + 1% de sacarosa consumida para determinar la dosis de solución de CNO para alcanzar 1,0 mg de CNO/kg (peso corporal).
NOTA: Se debe probar la dosis óptima de CNO que muestre la máxima eficacia con una concentración mínima de CNO, como se explica en el paso 3.6. - En el día 1, llenar botellas con 5 ml de agua + 1% sacarosa + CNO (1 mg de CNO / Kg) y colocarlas en la jaula (siempre en el mismo lugar) durante la ventana de tiempo determinada.
- Al final de la ventana de tiempo restringido, retire las botellas y mida la cantidad de agua + sacarosa + CNO consumida.
NOTA: Los materiales y soluciones se desinfectan o descartan como se describió anteriormente en el paso 3.11. - Repita este procedimiento todos los días durante 5 días.
NOTA: Esta duración se puede ajustar según los requisitos experimentales. - Incluya un grupo de control, como se describe en el paso 2.6.
5. Análisis de datos
- Ratones perfundidos por vía intracardial con 4% de paraformaldehído (PFA) 2 o 6 h después de recibir la última gota ocular CNO repetitiva (5o día). Cuando CNO se entregue a través de agua potable, sustituya CNO + agua por agua al final de la fase activa del ratón y, a continuación, percoe el ratón después de 2 o 6 h de acceso post-CNO.
NOTA: Si la exposición a la luz podría afectar a la inducción de c-Fos en el área de interés, mantenga a los ratones en constante oscuridad durante el último día de los experimentos y antes de la perfusión. - Disecciona cuidadosamente el cerebro y sumérgete en una solución de PFA al 4% durante 9-12h.
- Después de la fijación de la PFA, crioproteger el tejido cerebral usando una solución de sacarosa 30% (esperar hasta que el cerebro se hunde), luego seccionar el cerebro usando un criostato.
- Transfiera las secciones del cerebro coronal (35 m) en una solución que contenga 1x PBS, albúmina sérica 10% bovina y 0,3% De Tritón X-100 durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones cerebrales con una solución de anticuerpos anti-c-Fos (1:2500) a 4 oC durante la noche con agitación constante.
- Después de 3 lavados de 5 min cada uno con una solución que contiene 1x PBS y 0.3% Triton X-100, incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado Alexa (1:500) solución para 1 h a temperatura ambiente lejos de la luz y con agitación constante.
- Obtenga imágenes digitales utilizando un microscopio confocal. Ensamble y procese imágenes capturadas con un software de edición y análisis de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop).
- Para el análisis de datos, esboce y mida el área infectada por AAV (células mCherry(+)) utilizando el software ImageJ, y cuantifique el número de células c-Fos(+) dentro de esta región para obtener el número de celdas activadas por área. Combinar los resultados obtenidos a partir de 3 secciones separadas por animal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Observamos que la administración repetitiva de CNO utilizando gotas para los ojos provocó una inducción robusta de la expresión c-Fos en la mayoría de las neuronas infectadas (Figura1C),lo que muestra que la eficacia de la administración de CNO se mantiene durante la exposición repetitiva. Además, se observó una inducción significativa de c-Fos en muestras recogidas 2 h después del tratamiento con CNO, en comparación con las muestras obtenidas 6 h después de la exposición a CNO (Figuras1D-E),lo que demuestra que los cambios inducidos por la CNO dependen del tiempo.
Luego medimos la eficacia del tratamiento crónico de CNO suministrado a través del agua potable. Observamos que el consumo diario de agua + CNO no fue significativamente diferente en comparación con el volumen total de agua regular consumida (Figura2A). Del mismo modo, la cantidad de agua + 1% sacarosa consumida durante la noche (ventana de tiempo de 6 h) no se vio afectada por la adición de CNO (Figura2B). Además, no se encontraron diferencias en el consumo diario (5 días) tanto de agua + CNO (Figura2C)como de agua + sacarosa + CNO (Figura2D)a lo largo del experimento para todos los animales.
Similar a lo que encontramos usando gotas para los ojos CNO, se observó una inducción robusta de c-Fos después de 2 h pero no 6 h sobre el acceso CNO (Figuras2E-F).
Finalmente, medimos la respuesta de dosis de CNO añadida al agua potable. Para ello, los ratones estuvieron expuestos a las siguientes dosis de CNO: 1,0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,1 mg/ml, salina. En todos los casos, los animales fueron perfundidos 2 h después de la exposición a CNO. Encontramos que existe un umbral claro de eficacia para la CNO, donde una dosis baja de CNO (0,1 mg/ml) no provoca la activación de c-Fos en comparación con el control de la salina, mientras que dosis más altas (0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml y 1,0 mg/ml) inducidas por una inducción c-Fos robusta y similar ( Figura 2G).
Figura 1: Entrega repetitiva de CNO con gotas para los ojos. (A) AAV/hM3Dq-mCherry se inyectó estereotaxically en el hipocampo de ratones machoadultos adultos (3 meses de edad). (B) Cuatro semanas después de la inyección, CNO se administró con gotas para los ojos una vez al día durante 5 días consecutivos. Se utilizó una dosis de 1,0 mg de CNO/kg. (C) Finalmente, los ratones fueron sacrificados, y el tejido cerebral se probó para detectar la inmunoreactividad c-Fos (verde) en la zona infectada por el AAV (células positivas de MCherry, rojo). Se muestra una sección coronal representativa del lugar de inyección y la activación c-Fos mediada por CNO. (D) El número de células positivas c-Fos en el área infectada por AAV se midió en ratones que se perfundieron 2 o 6 h después de la última administración de CNO. Los datos son medios: SEM. ***p < 0,001; por la prueba t del estudiante (n 2-3 ratones). (E) Se muestran imágenes representativas para los dos grupos. Barra de escala: 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tratamiento crónico de CNO suministrado a través del agua potable. (A) No se observaron diferencias en el consumo total de líquidos entre animales de control (agua) o tratados (agua + CNO, dosis: 1,0 mg de CNO/kg). Los datos son medios: SEM (n.o 13-14 ratones). (B) Del mismo modo, no se observaron diferencias significativas en el volumen de agua + 1 % de sacarosa consumida (durante una ventana de tiempo de 6 horas), después de añadir CNO (1,0 mg/Kg). Los datos son medios: SEM (n 5 ratones). (C) Se muestra el consumo diario de agua + CNO (1,0 mg/kg) para ratones individuales. No se observaron diferencias en el consumo diario. Los datos son medios: SEM (n 5 ratones). (D) Se muestra el consumo diario de líquido (durante una ventana de tiempo de 6 horas) de 1% de sacarosa + CNO (1,0 mg/kg) para ratones individuales. No se observaron diferencias en el consumo diario. Los datos son medios: SEM (n 3 ratones). (E) 2 o 6 h después de la última administración de CNO, los ratones fueron sacrificados y el número de células positivas c-Fos se cuantificó en el área infectada por AAV. Los datos son medios: SEM. ***p < 0,001; por la prueba t del estudiante (n 5 ratones). (F) Las secciones coronales cerebrales se analizaron para detectar la inmunoreactividad c-Fos (verde) en la región infectada por AAV (células positivas de MCherry, rojo). Se muestran imágenes representativas. (G) Se administraron cuatro dosis de CNO (0,1, 0,25, 0,5 y 1,0 mg de CNO/kg), y se midió la inducción de c-Fos. Los datos son medios: SEM. ***p < 0,001; por ANOVA, seguido de la prueba de Tukey (n 2 ratones). Barra de escala: 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente la salud del animal. Aquí, describimos dos estrategias no invasivas para la entrega de CNO que confieren una activación robusta de DREADD (hM3Dq) y ofrecen un amplio espectro de posibilidades. Además, creemos que los protocolos descritos aquí también podrían ser útiles para diferentes variantes DREADD para la manipulación neuronal, incluyendo receptores muscarínicos u opioides genéticamente.
La administración de CNO mediante gotas para los ojos repetitivas representa una alternativa indolora a las inyecciones de CNO intraperitoneales repetitivas, al tiempo que preserva el poder para controlar con precisión la dosis y el tiempo de la administración de CNO. Por lo tanto, se recomienda utilizar este protocolo cuando se requiere la activación repetitiva de DREADD. Las gotas para los ojos también son la opción menos costosa para la entrega de CNO, particularmente en comparación con el protocolo que utiliza CNO añadido al agua potable. La CNO suministrada a través del agua potable, por otro lado, confiere una activación crónica y sostenida de DREADDS, evitando cualquier manejo del ratón. Es importante mencionar que este protocolo carece de control preciso sobre el tiempo de entrega de CNO. Una tercera alternativa, el acceso restringido en el tiempo a una solución de sacarosa que contiene CNO, combina las ventajas de ambos protocolos discutidos anteriormente. Esta estrategia es al mismo tiempo no invasiva, repetitiva y fácil de realizar. Además, ofrece un mejor control del tiempo de entrega de CNO en comparación con el acceso de 24 horas al agua con CNO. Una advertencia de este enfoque es que sólo se puede utilizar durante la fase activa de los animales. Recomendamos utilizar ambas estrategias que impliquen CNO en agua potable en combinación con cámaras infrarrojas o un sistema de lame-o-meter para obtener información temporal precisa sobre el consumo de CNO y, por lo tanto, la activación DREADD.
Se notificaron previamente efectos duraderos conferidos por CNO suministrado a través del agua potable. Hemos aplicado con éxito un tratamiento crónico de CNO (5 g/ml) durante 14 días consecutivos15 para evaluar las consecuencias conductuales de la activación tónica de un circuito talamo-cortical implicado en el control del estado de ánimo. Alternativamente, cNO proporcionado en el agua potable a una concentración de 40 mg/L se ha utilizado para modular crónicamente la actividad de las neuronas serotonérgicas del núcleo del raphe dorsal18,mientras que la función de las células pancreáticas se controló utilizando CNO a una concentración de 0,25 mg/ml de agua19. Combinados, estos resultados sugieren que se pueden ajustar diferentes concentraciones de CNO para controlar eficazmente los DREADD. Aquí, encontramos que diferentes dosis de CNO añadido según el agua potable provocaron una activación similar c-Fos, lo que sugiere que se debe realizar un análisis de dosis-respuesta para definir la dosis de CNO más baja y eficaz requerida. Estudios recientes han demostrado que la CNO no es totalmente farmacológicamente inerte20; además, también se demostró que la activación in vivo de los DREADD está mediada por la clozapina metabolito CNO, que tiene varios objetivos endógenos21. Por lo tanto, los autores sugieren el uso de dosis subumbrales de clozapina, en lugar de altas dosis de CNO. Aunque no hemos evaluado la eficacia de la clozapina en los métodos descritos, encontramos que la concentración de CNO podría reducirse sin reducir significativamente la activación neuronal, y por lo tanto, minimizar los efectos secundarios causados por la CNO a la clozapina Conversión.
En resumen, las estrategias presentadas aquí representan esquemas potenciales para la entrega de CNO que se pueden adaptar fácilmente a una variedad de diseños experimentales. Se concibieron como estrategias no invasivas que pueden ser útiles para la activación repetitiva o crónica mediada por CNO de las neuronas controladas por DREADD, reduciendo el impacto de la entrega de CNO en el comportamiento animal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros del Instituto Nacional de Salud Mental (ZIA MH002964-02). Nos gustaría agradecer el apoyo del NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
