Summary
هنا نقوم بوصف طريقتين غير الغازية للسيطرة المزمنة على النشاط العصبي باستخدام علم الوراثة الكيميائية في الفئران. واستخدمت قطرات العين لتسليم كلوزابين-N-أكسيد (CNO) يوميا. كما نقوم بوصف طريقتين لإطالة فترة إدارة CNO في مياه الشرب. هذه الاستراتيجيات للسيطرة العصبية المزمنة تتطلب الحد الأدنى من التدخل الحد من الإجهاد الحيوانات.
Abstract
وقد ظهرت استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية كأدوات موثوق بها للتحكم عن بعد في النشاط العصبي. من بين هذه, مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) أصبحت النهج الأكثر شعبية علم الالوراثة الكيميائية المستخدمة في علم الأعصاب الحديثة. معظم الدراسات تقديم كلوزابين-N-أكسيد ليجاند (CNO) باستخدام حقن واحد داخل اقابي، وهو مناسب لتنشيط / تثبيط حاد من السكان الخلايا العصبية المستهدفة. ومع ذلك، لا يوجد سوى عدد قليل من الأمثلة على استراتيجيات التشكيل المزمن للخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD، ومعظمها يعتمد على استخدام أنظمة التسليم التي تتطلب التدخل الجراحي. هنا، ونحن توسيع على اثنين من الاستراتيجيات غير الغازية لتقديم CNO ligand للتلاعب المزمن السكان العصبية في الفئران. كان يتم إعطاء CNO إما باستخدام قطرات العين المتكررة (اليومية)، أو بشكل مزمن من خلال مياه الشرب في الحيوان. هذه النماذج غير الغازية تؤدي إلى تنشيط قوي لمستقبلات المصمم التي استمرت في جميع أنحاء العلاجات CNO. الطرق الموصوفة هنا توفر بدائل للسيطرة المزمنة بوساطة DREADD من النشاط العصبي، وقد تكون مفيدة للتجارب المصممة لتقييم السلوك في الحيوانات المتحركة بحرية، مع التركيز على أساليب التسليم CNO أقل الغازية.
Introduction
وقد سمحت التطورات التقنية في مجال علم الأعصاب العلماء لتحديد ومراقبة نشاط مجموعات معينة من الخلايا العصبية1. وقد ساهم هذا في فهم أفضل لأساس الدوائر العصبية وتأثيرها على السلوك الحيواني، وكذلك، مراجعة العقائد الراسخة2،3. ومن بين هذه الأدوات الجديدة، كان للاستراتيجيات الوراثية البصرية والكيميائية تأثير عميق ليس فقط على نوعية الاكتشافات ولكن أيضا على الطريقة التي يتم بها تصور التجارب وتصميمها4. في هذه المخطوطة، نركز على استراتيجيات علم الوراثة الكيميائية للسيطرة على تنشيط الخلايا العصبية من خلال استراتيجيات مستقبلات ligand هندسية. مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) تمثل واحدة من الأدوات الكيميائية الوراثية الأكثر شعبية للتحكم عن بعد من النشاط العصبي, كما استعرض روث 20165. DREADDs الاستفادة المعدلة مستقبلات أستيل موسكارينيالتي يتم تفعيلها على وجه التحديد من قبل ليجانت خاملة, كلوزابين-N-أكسيد (CNO)6.
معظم الدراسات استخدام CNO تدار عن طريق الحقن داخل اقاب (i.p.) ، والتي تسيطر بشكل فعال على الجرعة وتوقيت تنشيط مستقبلات هندسية بطريقة حادة. ومع ذلك، عندما يكون التنشيط DREADD المتكررة أو المزمنة مطلوبة، يصبح استخدام حقن i.p. متعددة غير ممكن. لمعالجة هذه المسألة، تم الإبلاغ عن استراتيجيات مختلفة لتسليم CNO المزمن، بما في ذلك المضخات الصغيرة المزروعة7 والقنية داخل الجمجمة8،9. إلى درجات مختلفة، كل هذه الاستراتيجيات تسبب الإجهاد والألم الحيوانات10،وتتطلب التدخل الجراحي الذي يمكن أن يكون له أيضا تأثير مباشر على الاستجابات السلوكية ليتم اختبارها11. هنا، ونحن نصف ثلاث استراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO المزمنة.
لهذا الغرض، تم حقن الفئران مجسما في الحصين مع فيروس الأيدينو المرتبطة (AAV) ترميز نسخة هندسية من مستقبلات موسكارينيك M3 المحفزة (hM3Dq) أنه عند تفعيلها من قبل CNO ligand يؤدي إلى إطلاق النار مثل انفجار الخلايا العصبية6. وقد تبين سابقا أن قطرة عين واحدة تحتوي على CNO يمكن أن تثير بشكل فعال تفعيل قوي من الخلايا العصبية التي تعبر عن DREADD12. هنا نقوم بوصف طريقة معدلة للتسليم المتكرر لقطرات العين. لتحقيق السيطرة المزمنة والمستدامة على مستقبلات المصمم، ونحن نوصف المقبل استراتيجية غير الغازية لتسليم CNO للفئران من خلال مياه الشرب. وأخيراً، نقوم بوصف نموذج بديل لتقديم CNO في مياه الشرب خلال فترة زمنية محدودة. الفئران النشاط الحركي، فضلا عن سلوك الشرب واستهلاك حلول السعرات الحرارية الحلوة، وتقتصر في الغالب على الجزء المظلم من دورة الضوء / الظلام13،14. لذلك، اعتمدنا بروتوكول على أساس تفضيل الماوس للسكروز. من خلال قياس تحريض الجينات الفورية في وقت مبكر ج-فوس في الخلايا المصابة AAV, كقراءة لتنشيط الخلايا العصبية12,15, وجدنا أن هذه الاستراتيجيات تسليم CNO تنشيط بقوة الخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD على مدى تمديد المدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجان رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للمعهد الوطني للصحة العقلية . وقد بُذلت جميع الجهود للتقليل إلى أدنى حد من الألم وعدد الحيوانات المستخدمة.
1- حقن الفيروس المرتبطبة بأدينو في الحصين
ملاحظة: كانت الفئران الذكور من النوع البري من خلفية مختلطة (B6/129 F1 الهجين، 3 أشهر من العمر) لحقن مجسمة مع AAV ترميز مستقبلات Mus3 muscarinic (hM3Dq) في الحصين. خلال التجربة بأكملها، كانت الفئران واحدة في السكن، تحت ضوء 12 ساعة العادية: 12 ساعة دورة مظلمة (T24)، مع الوصول إلى الغذاء والماء ad libitum.
- قبل إجراء العمليات الجراحية المجسمة، تنظيف وتعقيم الإطار stereotaxic وجميع الأدوات اللازمة.
ملاحظة: يمكن استخدام الستائر الجراحية للحفاظ على حقل معقم والحد من فقدان حرارة الماوس. - تخدير عميق للماوس باستخدام isoflurane. للقيام بذلك، أولا ضبط مقياس تدفق الأكسجين إلى ما يقرب من 1.5 لتر / دقيقة، ومن ثم ضبط المرذاذ isoflurane إلى ما يقرب من 3-5٪ للحث وحوالي 1-3٪ للصيانة.
- للتأكد من أن الحيوان فاقد الوعي تماما ، قرصة مخلب الماوس. يتم التخدير الحيوان بشكل صحيح عندما يكون الرد على تراجع قرصة غائبة.
- وضع الماوس على لوحة التدفئة للحفاظ على استقرار درجة حرارة الجسم الماوس.
- اُبِري الجزء العلوي من الرأس وأصلح رأس الفأر ة إلى الإطار المجسم. ثم، وتطبيق زيوت التشحيم واقية العين على العينين، وتنظيف السطح عن طريق تنقية مع اليود البوفيدون والإيثانول 70٪، وفضح الجمجمة باستخدام مشرط معقمة.
- معايرة الإطار إلى نقطة بريجما، ثم حفر في إحداثيات وسيطية جانبية من 2.9 ملم وإحداثيات أمامية الخلفية -2.7 ملم لاستهداف الحصين.
ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى حقن هدف الدماغ الأخرى، حدد الإحداثيات المطلوبة للحقن باستخدام أطلس الماوس Paxinos وفرانكلين16. - بمجرد أن يتعرض الدماغ، حقن من جانب واحد 90 نمل من AAV في عمق الظهرية البطنية من -3.0 ملم في الحصين باستخدام حقن دقيق وسحبت ماصة microcapillary (الشكل1A).
ملاحظة: راجع جدول المواد للاطلاع على titer AAV المستخدم في هذه التجربة. لمناطق الدماغ الأخرى، وضبط حجم AAV من الحقن حسب الحاجة. - في نهاية العملية الجراحية، أغلق الشق بغرز النايلون وطبق المضادات الحيوية الموضعية على موقع الجرح.
- إدارة المسكنات (البوبرينورفين، 0.1 ملغ / كغ) بشكل منهجي مباشرة بعد الجراحة، وبعد 4-6 ساعات.
- ابتداء من 4 أسابيع بعد الحقن، والفئران موضوع إلى أي من النماذج الموصوفة في القسم التالي للسيطرة المزمنة الخلايا العصبية التعبير عن مستقبلات الإثارة مصمم.
2. تكرار CNO التسليم باستخدام قطرات العين
- تكييف الحيوانات للتعامل مع كل ماوس 3 دقائق يوميا لمدة 3-4 أيام قبل إعطاء قطرات العين.
- حل Clozapine-N-أكسيد (CNO، 5 ملغ) في 1 مل من محلول ملحي معقم 0.9٪ (حل الأوراق المالية: 5 ملغ CNO / مل). حافظ على المحلول مبردًا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- وزن كل فأر قبل بدء التجربة لتحديد كمية CNO ليتم تسليمها. استخدام 1-3 ميكرولتر قطرة (لكل عين) لتحقيق 1.0 ملغ CNO / كجم من وزن الجسم.
ملاحظة: على سبيل المثال، يجب أن يتلقى ماوس 20 غرام قطرات العين الثنائية (2 ميكرولتر لكل منهما). - تسليم قطرات العين خلال مرحلة غير نشطة (خفيفة) من الفئران، 2 ح قبل أضواء إيقاف (وقتzeitgeber (ZT) 10). في الحالات التي تحتاج فيها CNO إلى تسليمها خلال المرحلة النشطة (المظلمة) من الفئران، وضمان وجود ضوء أحمر خافت للتعامل السليم مع الحيوانات.
ملاحظة: ينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب تعطيل دورة circadian (والضوء / الظلام) من الحيوانات التجريبية.- باستخدام P10 micropipette، تحميل الكمية المطلوبة (1-3 درجة مئوية) من محلول CNO لتحقيق 1.0 ملغ CNO / كجم.
ملاحظة: استخدم طرف ماصة جديد ومعقم لكل قطرة عين. في هذه المجموعة من التجارب، تم إجراء قطرات العين الثنائية من CNO. ومع ذلك، إذا كان هناك حاجة إلى تركيز أقل CNO، يمكن أيضا تطبيق قطرات العين من جانب واحد. - تعطيل الماوس عن طريق scruff.
- طرد الحل ببطء حتى أشكال قطرات مستقرة على طرف ماصة.
- قم بتقريب القطرة بعناية من القرنية في عين الفأر حتى يتم تسليم الحل. يجب أن تلميح الماصة أبدا الاتصال عين الماوس.
- حرر الفأر، وضعه مرة أخرى في قفصمنزله.
- باستخدام P10 micropipette، تحميل الكمية المطلوبة (1-3 درجة مئوية) من محلول CNO لتحقيق 1.0 ملغ CNO / كجم.
- كرر هذا الإجراء كل يوم لمدة 5 أيام.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه المدة وفقًا للمتطلبات التجريبية. - بالنسبة لتجارب التحكم، استخدم الفئران المحقونة AAV/DREADD التي تخضع لعلاج صوري (قطرات العين التي تحتوي على محلول ملحي فقط)، والفئران التي يتم حقنها بمتجه فارغ (على سبيل المثال، AAV/mCherry) المعرضة لبروتوكول قطرات العين CNO الموصوفة.
3. المعالجة المزمنة CNO تسليمها من خلال مياه الشرب
- جعل زجاجات صغيرة باستخدام 50 مل (البلاستيك) أنابيب مخروطية والمطاط سدادة صنبور؛ تغطية مع رقائق الألومنيوم لتجنب أي آثار بوساطة خفيفة على استقرار CNO.
- قبل ثلاثة أيام من البدء بمعالجة CNO، استبدل زجاجات المياه العادية بزجاجات صغيرة تحتوي على 10 مل من المياه العادية، للسماح للفئران بالتكيف معها. تأمين الزجاجات إلى أقفاص باستخدام الشريط.
- قياس الاستهلاك اليومي للمياه لكل فأرة.
- وزن كل ماوس قبل بدء التجربة.
- حل Clozapine-N-أكسيد (CNO، 5 ملغ) في 1 مل من محلول ملحي معقمة 0.9٪. يُحفظ حل المخزون في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- استخدام وزن الجسم ومتوسط كمية المياه المستهلكة لتحديد تركيز محلول CNO لتحقيق 1.0 ملغ CNO / كجم (وزن الجسم).
ملاحظة: الفئران الذكور البالغين (~ 20 غرام من وزن الجسم) تستهلك ~ 5 مل من الماء يوميا (الشكل2A). ولذلك، لتحقيق تركيز CNO من 1 ملغ CNO / كجم، 6.4 ميكرولتر من محلول مخزون CNO ينبغي أن تضاف إلى حجم نهائي من 8 مل من الماء (التركيز النهائي: 4 ميكروغرام CNO / مل). وهكذا، فإن جرعة CNO ل20 غرام الحيوان الذي يشرب 5 مل المياه يوميا النتائج في 1 ملغ CNO / كجم. - تحديد الجرعة المثلى CNO التي تعرض أقصى قدر من الفعالية مع الحد الأدنى من تركيز CNO عن طريق اختبار مجموعة من التركيزات. إجراء تحليل استجابة الجرعة لتحديد الجرعة المثلى CNO لطريقة مياه الشرب.
ملاحظة: تم اختبار جرعات CNO التالية لهذه التجربة: 1.0 ملغ / مل، 0.5 ملغ / مل، 0.25 ملغ / مل، 0.1 ملغ / مل، والمالحة. تم اختبار 1.0 ملغ CNO/ كجم لأول مرة، استنادا ً إلى بروتوكولات i.p. وقطرات العين. - في اليوم 1، ملء زجاجة مع 8 مل من الماء العادي وإضافة الكمية المطلوبة من CNO.
ملاحظة: هذه الكمية من الماء كافية ل24 ساعة من الوصول إلى المياه libitum الإعلان للماوس الذكور الكبار. في حالة استخدام أنواع القوارض الأخرى، أولا قياس كمية المياه المستهلكة يوميا لتحديد الحجم المطلوب. - مراقبة صحة الحيوانات في جميع أنحاء البروتوكول لضمان عدم وجود آثار جانبية سلبية الناجمة عن المياه + استهلاك CNO.
- بعد 24 ساعة، استبدال الزجاجات مع المياه العذبة + CNO الحل. تسجيل وحدة التخزين المستهلكة خلال اليوم السابق.
- التخلص من المياه + CNO الحل الذي لم يستهلك في حاويات النفايات. تجاهل الزجاجات البلاستيكية واستبدال سدادات المطاط كل يوم، بعد تعقيمها وفقا للمبادئ التوجيهية مرفق الحيوان.
ملاحظة: لا تخلط النفايات المائية مع المذيبات العضوية. اتصل بخدمة التخلص من المواد الكيميائية للحصول على تعليمات للتخزين والاستلام. - استبدال الزجاجات في نفس الوقت كل يوم لمدة 5 أيام.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه المدة وفقًا للمتطلبات التجريبية. - تضمين مجموعات التحكم كما هو موضح في الخطوة 2.6.
4. العلاج المقيد CNO باستخدام تفضيل الفئران للسكروز
- قبل 3 أيام من البدء بعلاج CNO، ضع زجاجة صغيرة تحتوي على 10 مل من الماء + 1٪ من السكروز على القفص، ويفضل أن يكون بعيدا عن زجاجة المياه الأصلية.
ملاحظة: استخدام نفس الزجاجات الصغيرة الموضحة في الخطوة 3.1. - تعريض الحيوانات للماء + 1٪ السكروز خلال الجزء الأخير من مرحلتها النشطة (ZT 18 - 24). بعد هذا التعرض، وإزالة زجاجة مع الماء + السكروز من القفص.
ملاحظة: يمكن استخدام إطارات زمنية مختلفة من تسليم CNO. بالإضافة إلى ذلك، يمكن وضع الفئران تحت دورة ضوء/ظلام مقلوبة، حيث يحدث ظهور الضوء في ساعات المساء لتسهيل تسليم CNO. - قياس المياه اليومية + 1٪ استهلاك السكروز لكل ماوس.
- وزن كل ماوس قبل بدء التجربة.
- استخدام وزن الجسم ومتوسط كمية المياه + 1٪ السكروز المستهلكة لتحديد جرعة محلول CNO لتحقيق 1.0 ملغ CNO / كجم (وزن الجسم).
ملاحظة: ينبغي اختبار الجرعة المثلى CNO التي تعرض أقصى فعالية مع الحد الأدنى من تركيز CNO، كما هو موضح في الخطوة 3.6. - في اليوم 1، ملء زجاجات مع 5 مل من الماء + 1٪ السكروز + CNO (1 ملغ CNO / كلغ) ووضعها على القفص (دائما في نفس الموقع) خلال الإطار الزمني المحدد.
- في نهاية الإطار الزمني المقيد، قم بإزالة الزجاجات وقياس كمية الماء + السكروز + CNO المستهلكة.
ملاحظة: يتم تعقيم المواد والحلول أو تجاهلها كما هو موضح مسبقًا في الخطوة 3.11. - كرر هذا الإجراء كل يوم لمدة 5 أيام.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه المدة وفقًا للمتطلبات التجريبية. - تضمين مجموعة تحكم كما هو موضح في الخطوة 2.6.
5 - تحليل البيانات
- الفئران perfuse داخل cardially مع 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) إما 2 أو 6 ساعة بعد تلقي المتكررة الأخيرة (اليوم الخامس) CNO قطرة العين. عندما يتم تسليم CNO من خلال مياه الشرب، واستبدال CNO + الماء بالماء في نهاية المرحلة النشطة للماوس، ثم perfuse الماوس بعد 2 أو 6 ساعة بعد وصول CNO.
ملاحظة: إذا كان التعرض للضوء يمكن أن يؤثر على الحث c-Fos في منطقة الاهتمام، والحفاظ على الفئران في الظلام المستمر خلال اليوم الأخير من التجارب، وقبل التسريب. - تشريح بعناية الدماغ وغمر في حل PFA 4٪ ل9-12h.
- بعد تثبيت PFA، cryoprotect أنسجة الدماغ باستخدام محلول السكروز 30٪ (انتظر حتى المصارف الدماغ)، ثم قسم الدماغ باستخدام cryostat.
- نقل أقسام الدماغ الإكليلي (35 درجة مئوية) إلى حل يحتوي على 1X PBS، 10٪ ألبوم المصل البقري، و 0.3٪ تريتون X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان أقسام الدماغ مع المضادة لC-فوس (1:2500) حل الأجسام المضادة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع التحريض المستمر.
- بعد 3 غسولات من 5 دقائق لكل منها مع حل يحتوي على 1X PBS و 0.3٪ تريتون X-100، واحتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية الملتصقة اليكسا (1:500) حل ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء ومع التحريض المستمر.
- الحصول على الصور الرقمية باستخدام المجهر البؤري. تجميع الصور الملتقطة ومعالجتها باستخدام برنامج تحرير وتحليل الصور (على سبيل المثال، Adobe Photoshop).
- لتحليل البيانات، قم بمخطط وقياس المنطقة المصابة بـ AAV (خلايا mCherry(+) باستخدام برنامج ImageJ، وتحديد عدد خلايا c-Fos(+) داخل هذه المنطقة للحصول على عدد الخلايا المنشطة لكل منطقة. الجمع بين النتائج التي تم الحصول عليها من 3 أقسام منفصلة لكل الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاحظنا أن التسليم المتكرر CNO باستخدام قطرات العين أثار تحريض قوي من التعبير c-Fos في معظم الخلايا العصبية المصابة (الشكل1C)،مما يدل على أن فعالية تسليم CNO تستمر خلال التعرض المتكرر. وعلاوة على ذلك، لوحظ تحريض كبير من c-Fos في العينات التي تم جمعها 2 ساعة بعد العلاج CNO، مقارنة مع العينات التي تم الحصول عليها 6 ح بعد التعرض CNO (الأشكال1D-E)،مما يدل على أن التغيرات التي يسببها CNO تعتمد على الوقت.
ثم قمنا بقياس فعالية المعالجة المزمنة CNO التي يتم تسليمها من خلال مياه الشرب. لاحظنا أن الاستهلاك اليومي للمياه + CNO لم يكن مختلفا ً بشكل كبير مقارنة بالحجم الإجمالي للمياه العادية المستهلكة (الشكل2A). وبالمثل، فإن كمية الماء + 1٪ السكروز المستهلكة خلال الليل (6 ح نافذة زمنية) لم تتأثر بإضافة CNO (الشكل2B). وعلاوة على ذلك، لم يتم العثور على أي اختلافات في الاستهلاك اليومي (5 أيام) لكل من المياه + CNO (الشكل2C)والماء + السكروز + CNO (الشكل2D)في جميع أنحاء التجربة لجميع الحيوانات.
على غرار ما وجدناه باستخدام قطرات العين CNO، لوحظ تحريض قوي من c-Fos بعد 2 ح ولكن ليس 6 ح عند الوصول إلى CNO (أرقام2E-F).
وأخيرا، قمنا بقياس استجابة جرعة CNO المضافة إلى مياه الشرب. وللقيام بذلك، تعرضت الفئران لجرعات CNO التالية: 1.0 ملغ / مل، 0.5 ملغ / مل، 0.25 ملغ / مل، 0.1 ملغ / مل، ملحي. في جميع الحالات، كانت الحيوانات تُغرس 2 ساعة بعد التعرض للCNO. وجدنا أن هناك عتبة واضحة من الفعالية لCNO، حيث جرعة منخفضة من CNO (0.1 ملغ / مل) لا تثير تفعيل C-Fos مقارنة مع السيطرة على المالحة، في حين أن جرعات أعلى (0.25 ملغ / مل، 0.5 ملغ / مل و 1.0 ملغ / مل) الناجمة عن تحريض ج فوس قوية ومماثلة ( الشكل 2زاي).
الشكل 1: تكرار CNO التسليم باستخدام قطرات العين. (أ) تم حقن AAV /hM3Dq-mCherry بشكل مجسم في الحصين من الفئران الذكور الكبار (3 أشهر من العمر). (B) أربعة أسابيع بعد الحقن، وتدار CNO باستخدام قطرات العين مرة واحدة يوميا لمدة 5 أيام متتالية. واستخدمت جرعة من 1.0 ملغ CNO / كجم. (ج) وأخيرا، تم التضحية الفئران، وتم اختبار أنسجة الدماغ لc-Fos (الأخضر) المناعية في المنطقة المصابة AAV (الخلايا الإيجابية mCherry، الأحمر). يتم عرض قسم الإكليل التمثيلي لموقع الحقن وتنشيط c-Fos بوساطة CNO. (د) تم قياس عدد الخلايا الإيجابية c-Fos في المنطقة المصابة AAV في الفئران التي تم perfused 2 أو 6 ساعة بعد إدارة CNO الأخيرة. البيانات هي متوسط ± SEM. *** p < 0.001; بواسطة الطالب t-اختبار (n = 2-3 الفئران). (هـ)يتم عرض الصور التمثيلية للمجموعتين. شريط مقياس: 100 درجة مئوية الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العلاج المزمن بـ CNO الذي يتم تقديمه من خلال مياه الشرب. (أ) لم تلاحظ أي اختلافات في إجمالي استهلاك السوائل بين السيطرة (الماء) أو المعالجة (الماء + CNO، الجرعة: 1.0 ملغ CNO/ كجم) الحيوانات. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 13-14 الفئران). (ب) وبالمثل، لم تلاحظ اختلافات كبيرة في حجم المياه + 1٪ السكروز المستهلكة (خلال نافذة زمنية 6 ح)، بعد إضافة CNO (1.0 ملغ / كغ). البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 5 الفئران). (C) يظهر الاستهلاك اليومي للمياه + CNO (1.0 ملغ / كغ) للفئران الفردية. ولم تلاحظ أي اختلافات في الاستهلاك اليومي. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 5 الفئران). (D) يظهر الاستهلاك اليومي للسوائل (خلال نافذة زمنية 6 ح) من السكروز 1٪ + CNO (1.0 ملغ / كغ) للفئران الفردية. ولم تلاحظ أي اختلافات في الاستهلاك اليومي. البيانات هي متوسط ± SEM (ن = 3 الفئران). (E) 2 أو 6 ساعة بعد إدارة CNO الأخيرة، تم التضحية الفئران، وتم تحديد عدد الخلايا الإيجابية c-Fos في المنطقة المصابة AAV. البيانات هي متوسط ± SEM. *** p < 0.001; بواسطة الطالب t-اختبار (ن = 5 الفئران). (F) تم اختبار أقسام الدماغ الإكليلية لتفاعل المناعة c-Fos (الأخضر) في المنطقة المصابة AAV (الخلايا الإيجابية mCherry، الأحمر). يتم عرض الصور التمثيلية. (G) تم إعطاء أربع جرعات CNO (0.1, 0.25, 0.5, و 1.0 ملغ CNO/kg), وتم قياس الحث c-Fos. البيانات هي متوسط ± SEM. *** p < 0.001; بواسطة ANOVA، تليها اختبار توكي (ن = 2 الفئران). شريط مقياس: 100 درجة مئوية الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ظهرت DREADDs كنهج شعبية وفعالة للتعامل عن بعد النشاط العصبي17. ومن ثم، فإن تصميم استراتيجيات بديلة لتقديم عمل كل من CNO سيزيد بشكل عام من نطاق الخيارات المتاحة لبيئات تجريبية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاستراتيجيات غير الغازية لتسليم CNO تقلل من أي سوء تفسير محتمل للنتائج عن طريق الحد من الآثار الجانبية السلبية التي يمكن أن تؤثر مباشرة على صحة الحيوان. هنا، وصفنا استراتيجيتين غير الغازية لتسليم CNO التي تمنح تفعيل قوي من DREADDs (hM3Dq) وتقدم مجموعة واسعة من الاحتمالات. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن البروتوكولات الموصوفة هنا قد تكون مفيدة أيضا لمختلف المتغيرات DREADD للتلاعب الخلايا العصبية، بما في ذلك مستقبلات muscarinic أو الأفيونية المهندسة وراثيا.
يمثل توصيل CNO باستخدام قطرات العين المتكررة بديلاً غير مؤلم لحقن CNO المتكررة داخل المجلس الاقتصادي والاجتماعي مع الحفاظ على القدرة على التحكم بدقة في الجرعة وتوقيت توصيل CNO. لذلك، نوصي باستخدام هذا البروتوكول عند الحاجة إلى تنشيط DREADD المتكررة. قطرات العين هي أيضا الخيار الأقل تكلفة لتسليم CNO، لا سيما بالمقارنة مع البروتوكول باستخدام CNO إضافة إلى مياه الشرب. CNO تسليمها من خلال مياه الشرب، من ناحية أخرى، يضفي تفعيل مزمن ومستمر من DREADDS، وتجنب أي التعامل مع الماوس. ومن المهم الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يفتقر إلى رقابة دقيقة على توقيت تسليم CNO. بديل ثالث، والوصول مقيدة زمنيا إلى محلول السكروز الذي يحتوي على CNO، يجمع بين مزايا كلا البروتوكولين التي نوقشت سابقا. هذه الاستراتيجية هي في الوقت نفسه غير الغازية، المتكررة وسهلة الأداء. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر سيطرة أفضل على توقيت تسليم CNO مقارنة مع 24 ساعة الوصول إلى المياه مع CNO. تحذير من هذا النهج هو أنه لا يمكن استخدامه إلا خلال المرحلة النشطة من الحيوانات. نوصي باستخدام كلا الاستراتيجيتين التي تنطوي على CNO في مياه الشرب في تركيبة مع كاميرات الأشعة تحت الحمراء أو نظام لعق س متر للحصول على معلومات زمنية دقيقة حول استهلاك CNO، وبالتالي، تفعيل DREADD.
وقد سبق الإبلاغ عن الآثار الطويلة الأمد التي يمنحها قانون مكافحة التلوث الجوي الذي يُسلَّم عن طريق مياه الشرب. لقد قمنا بتطبيق علاج CNO المزمن (5 ميكروغرام / مل) خلال 14 يوما متتاليا15 لتقييم العواقب السلوكية لتنشيط منشط من دائرة الثالامو القشرية المشاركة في السيطرة على المزاج. بدلا من ذلك، CNO المقدمة في مياه الشرب بتركيز 40 ملغ / لتر وقد استخدمت لتعديل مزمن لنشاط الخلايا العصبية السيروتونين من نواة raphe الظهرية18، في حين تم التحكم في وظيفة خلايا بيتا البنكرياس باستخدام CNO بتركيز 0.25 ملغم/مل من الماء19. جنبا إلى جنب، وتشير هذه النتائج إلى أن تركيزات CNO مختلفة يمكن ضبطها للسيطرة بشكل فعال DREADDs. هنا, وجدنا أن جرعات مختلفة من CNO إضافة إلى مياه الشرب أثارت مماثلة c-Fos التنشيط, مما يشير إلى أنه ينبغي إجراء تحليل الجرعة استجابة لتحديد جرعة CNO أدنى وفعالة المطلوبة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن CNO ليست خاملة تماما الدوائية20; وبالإضافة إلى ذلك، ثبت أيضا أن التنشيط في الجسم الحي من DREADDs هو بوساطة من قبل كلوزابين المستقلب CNO، والتي لديها العديد من الأهداف الذاتية21. ولذلك, يقترح المؤلفون استخدام جرعات تحت العتبة من كلوزابين, بدلاً من جرعات CNO عالية. على الرغم من أننا لم نقيم فعالية كلوزابين في الأساليب الموصوفة، وجدنا أن تركيز CNO يمكن خفضدون الحد بشكل كبير من تنشيط الخلايا العصبية، وبالتالي، تقليل الآثار الجانبية الناجمة عن CNO إلى كلوزابين التحويل.
وباختصار، فإن الاستراتيجيات المعروضة هنا تمثل مخططات محتملة لتقديم CNO يمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة متنوعة من التصاميم التجريبية. وقد تم تصورها على أنها استراتيجيات غير الغازية التي قد تكون مفيدة لتنشيط المتكررة أو المزمنة بوساطة CNO من الخلايا العصبية التي تسيطر عليها DREADD، والحد من تأثير تسليم CNO على السلوك الحيواني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية في المعهد الوطني للصحة العقلية (ZIA MH002964-02). نود أن نشكر دعم نيمه IRP القوارض الأساسية السلوكية (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
