Nicht-invasive Strategien zur chronischen Manipulation der DREADD-kontrollierten neuronalen Aktivität
Summary
Hier beschreiben wir zwei nicht-invasive Methoden zur chronischen Kontrolle der neuronalen Aktivität mit Chemogenetik bei Mäusen. Augentropfen wurden verwendet, um Clozapin-N-Oxid (CNO) täglich zu liefern. Wir beschreiben auch zwei Methoden für die längere Verabreichung von CNO im Trinkwasser. Diese Strategien zur chronischen neuronalen Kontrolle erfordern minimale Eingriffe, um den Stress der Tiere zu reduzieren.
Abstract
Chemogenetische Strategien haben sich als zuverlässige Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität herauskristallisiert. Unter diesen, Designer-Rezeptoren ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert (DREADDs) haben sich die beliebtesten chemogenetischen Ansatz in der modernen Neurowissenschaft verwendet. Die meisten Studien liefern das Ligand Clozapin-N-Oxid (CNO) mit einer einzigen intraperitonealen Injektion, die für die akute Aktivierung/Hemmung der gezielten neuronalen Population geeignet ist. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele für Strategien zur chronischen Modulation von DREADD-kontrollierten Neuronen, von denen die meisten auf den Einsatz von Trägersystemen angewiesen sind, die einen chirurgischen Eingriff erfordern. Hier erweitern wir zwei nicht-invasive Strategien zur Bereitstellung des Liganden-CNO zur chronischen Manipulation der neuronalen Population bei Mäusen. CNO wurde entweder mit repetitiven (täglichen) Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres verabreicht. Diese nicht-invasiven Paradigmen führen zu einer robusten Aktivierung der Designerrezeptoren, die während der gesamten CNO-Behandlungen fortbestehen. Die hier beschriebenen Methoden bieten Alternativen zur chronischen DREADD-vermittelten Kontrolle der neuronalen Aktivität und können für Experimente nützlich sein, die entwickelt wurden, um das Verhalten bei frei beweglichen Tieren zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf weniger invasiven CNO-Bereitstellungsmethoden liegt.
Introduction
Technische Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Aktivität bestimmter neuronaler Populationen genau zu identifizieren und zu kontrollieren1. Dies hat dazu beigetragen, die Grundlagen der neuronalen Schaltkreise und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Tieren besser zu verstehen, sowie die Überarbeitung etablierter Dogmen2,3. Unter diesen neuartigen Werkzeugen haben optogenetische und chemogenetische Strategien nicht nur die Qualität der Entdeckungen, sondern auch die Art und Weise, wie Experimente konzipiert und gestaltet werden, tiefgreifend beeinflusst4. Im vorliegenden Manuskript konzentrieren wir uns auf chemogenetische Strategien zur Steuerung der Aktivierung von Neuronen über entwickelte Rezeptor-Ligand-Strategien. Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) aktiviert werden, stellen eines der beliebtesten chemogenetischen Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität dar, wie von Roth 20165überprüft. DREADDs verwenden modifizierte muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, die speziell durch eine inerte Liganligande aktiviert werden, Clozapin-N-Oxid (CNO)6.
Die meisten Studien verwenden CNO durch intraperitoneale (i.p.) Injektionen verabreicht, die effektiv steuert die Dosierung und Timing der technischen Rezeptoren Aktivierung in akuter Weise. Wenn jedoch eine repetitive oder chronische DREADD-Aktivierung erforderlich ist, wird die Verwendung mehrerer i.p.-Injektionen nicht mehr möglich. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Strategien für die chronische CNO-Lieferung berichtet, einschließlich implantierter Minipumpen7 und intrakraniellen Kanülen8,9. In unterschiedlichem Ausmaß verursachen all diese Strategien Stress und Schmerzen10, und erfordern einen chirurgischen Eingriff, der auch einen direkten Einfluss auf die Zutest-Verhaltensreaktionen haben könnte11. Hier beschreiben wir drei nicht-invasive Strategien für die chronische CNO-Entbindung.
Zu diesem Zweck wurden Mäuse stereotaxisch in den Hippocampus mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) injiziert, der eine technische Version des exzitatorischen M3-Muskarinrezeptors (hM3Dq) kodiert, der bei Aktivierung durch den Liganden CNO zum burstartigen Abfeuern von Neuronen6. Es wurde zuvor gezeigt, dass ein einzelner Augentropfen, der CNO enthält, effektiv eine robuste Aktivierung der DREADD-exemitten Neuronen12auslösen kann. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode zur wiederholten Abgabe von Augentropfen. Um eine chronische und nachhaltige Kontrolle der Designerrezeptoren zu erreichen, beschreiben wir als nächstes eine nicht-invasive Strategie, Um cNO an Mäuse durch das Trinkwasser zu liefern. Schließlich beschreiben wir ein alternatives Paradigma für die Bereitstellung von CNO im Trinkwasser während eines begrenzten Zeitfensters. Die Motoraktivität der Mäuse sowie das Trinkverhalten und der Konsum von süßen Kalorienlösungen beschränken sich meist auf den dunklen Teil des Hellen/Dunkel-Zyklus13,14. Daher haben wir ein Protokoll angenommen, das auf der Vorliebe der Maus für Saccharose basiert. Durch die Messung der Induktion des unmittelbar-frühen Gens c-Fos in AAV-infizierten Zellen, als Auslese für neuronale Aktivierung12,15, fanden wir heraus, dass diese CNO-Lieferstrategien DREADD-kontrollierte Neuronen über erweiterte Dauer.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs haben sich als ein beliebter und effektiver Ansatzzur Fernmanipulation neuronaler Aktivität 17 herauskristallisiert. Die Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung wird das Spektrum der verfügbaren Optionen für spezifische experimentelle Einstellungen weitgehend erweitern. Darüber hinaus minimieren nicht-invasive Strategien für die Bereitstellung von CNO mögliche Fehlinterpretationen von Ergebnissen, indem sie nebenwirkungen, die sich direkt auf die Gesundheit de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das intramurale Forschungsprogramm am National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02) unterstützt. Wir danken der Unterstützung des NIMH IRP Nagetier Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
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