यहाँ हम चूहों में chemogenetics का उपयोग कर न्यूरोनल गतिविधि को लंबे समय से नियंत्रित करने के लिए दो गैर इनवेसिव तरीकों का वर्णन. नेत्र-बूंदों का उपयोग रोजाना क्लोज़ापिन-एन-ऑक्साइड (सीएनओ) देने के लिए किया जाता था। हम भी पीने के पानी में CNO के लंबे समय तक प्रशासन के लिए दो तरीकों का वर्णन. पुरानी न्यूरॉन नियंत्रण के लिए इन रणनीतियों जानवरों के तनाव को कम करने के कम से कम हस्तक्षेप की आवश्यकता है.
Chemogenetic रणनीतियों न्यूरॉन गतिविधि के रिमोट कंट्रोल के लिए विश्वसनीय उपकरण के रूप में उभरा है. इनमें से, डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय (DREADDs) आधुनिक तंत्रिका विज्ञान में इस्तेमाल सबसे लोकप्रिय chemogenetic दृष्टिकोण बन गए हैं. अधिकांश अध्ययन एक एकल इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन का उपयोग करके लिगन्ड क्लोज़ापिन-एन-ऑक्साइड (सीएनओ) प्रदान करते हैं, जो लक्षित न्यूरोनल आबादी के तीव्र सक्रियण/अवरोध के लिए उपयुक्त है। वहाँ रहे हैं, तथापि, केवल DREADD नियंत्रित न्यूरॉन्स की पुरानी मॉडुलन के लिए रणनीतियों के कुछ उदाहरण, जिनमें से अधिकांश प्रसव प्रणाली है कि शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता के उपयोग पर भरोसा करते हैं. यहाँ, हम लंबे समय से चूहों में तंत्रिका आबादी में हेरफेर करने के लिए ligand CNO देने के लिए दो गैर इनवेसिव रणनीतियों पर विस्तार. CNO या तो दोहराव (दैनिक) आंख की बूंदों का उपयोग करके प्रशासित किया गया था, या लंबे समय से जानवर के पीने के पानी के माध्यम से. इन गैर इनवेसिव प्रतिमानों डिजाइनर रिसेप्टर्स कि CNO उपचार भर में बनी के मजबूत सक्रियण में परिणाम. यहाँ वर्णित तरीकों न्यूरोनल गतिविधि के पुराने DREADD मध्यस्थता नियंत्रण के लिए विकल्प प्रदान करते हैं और स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है, कम इनवेसिव CNO वितरण विधियों पर ध्यान केंद्रित.
तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में तकनीकी प्रगति ने वैज्ञानिकों को विशेष न्यूरोनल जनसंख्या 1 की गतिविधि की ठीक पहचान करने और नियंत्रित करने की अनुमति दीहै. इससे न्यूरोनल सर्किट के आधार और पशुओं के व्यवहार पर उनके प्रभाव को बेहतर ढंग से समझने में योगदान हुआ है, साथ ही स्थापित हठधर्मिता2,3में संशोधन करने में भी योगदान दिया है। इन उपन्यास उपकरणों में, ऑप्टोजेनेटिक और रसायन-आनुवंशिक रणनीतियों का न केवल खोजों की गुणवत्ता पर गहरा प्रभाव पड़ा है बल्कि प्रयोगों की कल्पना और डिजाइन किए जाने के तरीके पर भी गहरा प्रभाव पड़ाहै 4. वर्तमान पांडुलिपि में, हम इंजीनियर रिसेप्टर-लिगंड रणनीतियों के माध्यम से न्यूरॉन्स के सक्रियण को नियंत्रित करने के लिए chemogenetic रणनीतियों पर ध्यान केंद्रित. डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं द्वारा सक्रिय (DREADDs) न्यूरॉन गतिविधि के रिमोट कंट्रोल के लिए सबसे लोकप्रिय chemogenetic उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, के रूप में Roth द्वारा की समीक्षा की 20165. DREADDs संशोधित muscarinic acetylcholine रिसेप्टर्स कि विशेष रूप से एक निष्क्रिय ligand, clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO)6द्वारा सक्रिय कर रहे हैं का उपयोग करें.
अधिकांश अध्ययनों में इंट्रापर्टोनियल (आई.पी.) इंजेक्शन द्वारा प्रशासित CNO का उपयोग करें, जो प्रभावी रूप से एक तीव्र फैशन में इंजीनियर रिसेप्टर्स सक्रियण की खुराक और समय को नियंत्रित करता है। हालांकि, जब दोहराव या पुरानी DREADD सक्रियण की आवश्यकता है, कई i.p. इंजेक्शन का उपयोग unfeasible हो जाते हैं. इस मुद्दे का समाधान करने के लिए, पुरानी CNO वितरण के लिए विभिन्न रणनीतियों की सूचना दी गई है, जिसमें प्रत्यारोपित मिनीपंप7 और इंट्राक्रैनियल कैनुला8,9 शामिलहैं। अलग अलग हद तक, इन सभी रणनीतियों जानवरों तनाव और दर्द10का कारण है, और एक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप है कि भी व्यवहार प्रतिक्रियाओं पर सीधा प्रभाव हो सकता है की आवश्यकता का परीक्षण किया जा करने के लिए11. यहाँ, हम पुरानी CNO वितरण के लिए तीन गैर इनवेसिव रणनीतियों का वर्णन.
इस उद्देश्य के लिए, चूहों को एक एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के साथ हिप्पोकैम्पस में स्टीरियोटैक्सिक रूप से इंजेक्ट किया गया था, जो उत्तेजक एम 3 मस्कारिनिक रिसेप्टर (एचएम3डीक्यू) के इंजीनियर संस्करण को एन्कोडिंग करता है जो लिगन्ड सीएनओ द्वारा सक्रिय होने पर फट-जैसे फायरिंग की ओर जाता है न्यूरॉन्स6| यह पहले से पता चला था कि CNO युक्त एक आंख ड्रॉप प्रभावी ढंग से DREADD-expressing न्यूरॉन्स12के एक मजबूत सक्रियण प्रकाश में लाना कर सकते हैं. यहाँ हम आंखों की बूंदों के दोहराव वितरण के लिए एक संशोधित विधि का वर्णन. डिजाइनर रिसेप्टर्स की पुरानी और निरंतर नियंत्रण प्राप्त करने के लिए, हम अगले पीने के पानी के माध्यम से चूहों को CNO देने के लिए एक गैर इनवेसिव रणनीति का वर्णन. अंत में, हम एक प्रतिबंधित समय खिड़की के दौरान पीने के पानी में CNO देने के लिए एक वैकल्पिक प्रतिमान का वर्णन. चूहे चलन गतिविधि, साथ ही पीने के व्यवहार और मिठाई गरमी समाधान की खपत, ज्यादातरप्रकाश के अंधेरे भाग तक ही सीमित हैं / इसलिए, हम sucrose के लिए माउस की पसंद के आधार पर एक प्रोटोकॉल अपनाया. AAV संक्रमित कोशिकाओं में तत्काल-early जीन सी-Fos के प्रेरण को मापने के द्वारा, न्यूरॉन सक्रियण के लिए एक readout के रूप में12,15,हमने पाया कि इन CNO वितरण रणनीतियों मजबूती से विस्तारित पर DREADD नियंत्रित न्यूरॉन्स सक्रिय Durations.
DREADDs दूर से तंत्रिका गतिविधि17हेरफेर करने के लिए एक लोकप्रिय और प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में उभरा है . CNO वितरण के लिए वैकल्पिक रणनीतियों के डिजाइन मोटे तौर पर विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लि?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (जियाए MH002964-02) में इंट्रामरल अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। हम NIMH IRP Rodent व्यवहार कोर (जेडआईसी MH002952) के समर्थन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.
BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |