Ikke-invasiv strategier for kronisk manipulering av DREADD-kontrollerte neuronal aktivitet
Summary
Her beskriver vi to ikke-invasive metoder for å kronisk kontrollere neuronal aktivitet ved hjelp av chemogenetics i mus. Eye-DROPS ble brukt til å levere Clozapine-N-oksid (CNO) daglig. Vi beskriver også to metoder for langvarig administrering av CNO i drikkevann. Disse strategiene for kronisk neuronal kontroll krever minimalt inngrep redusere dyrs stress.
Abstract
Chemogenetic strategier har dukket opp som pålitelige verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet. Blant disse, designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) har blitt den mest populære chemogenetic tilnærming som brukes i moderne nevrovitenskap. De fleste studier leverer ligand Clozapine-N-oksid (CNO) ved hjelp av en enkelt intraperitoneal injeksjon, som er egnet for akutt aktivering/hemming av den målrettede neuronal befolkningen. Det er imidlertid bare noen få eksempler på strategier for kronisk modulering av DREADD-kontrollerte neurons, de fleste som er avhengige av bruk av leveringssystemer som krever kirurgisk inngrep. Her utvider vi på to ikke-invasiv strategier for å levere ligand CNO å kronisk manipulere neural befolkningen i mus. CNO ble administrert enten ved hjelp av repeterende (daglig) øyedråper, eller kronisk gjennom dyrets drikkevann. Disse ikke-invasiv paradigmer resultere i robust aktivering av designer reseptorer som holdt gjennom CNO behandlinger. Metodene som er beskrevet her tilbyr alternativer for kronisk DREADD-mediert kontroll av neuronal aktivitet og kan være nyttig for eksperimenter utformet for å evaluere atferd i fritt bevegelige dyr, med fokus på mindre invasive CNO leveringsmetoder.
Introduction
Tekniske fremskritt innen nevrovitenskap har tillatt forskerne å presist identifisere og kontrollere aktiviteten til bestemte neuronal populasjoner1. Dette har bidratt til å bedre forstå grunnlaget for neuronal kretser og deres innvirkning på dyr atferd, samt revidere etablerte dogmer2,3. Blant disse romanen verktøy, optogenetic og chemogenetic strategier har hatt en dyp innvirkning ikke bare på kvaliteten av funn, men også på vei eksperimenter er unnfanget og designet4. I dagens manuskript fokuserer vi på chemogenetic strategier for å kontrollere aktiveringen av neurons via konstruerte reseptor-ligand strategier. Designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs) representerer en av de mest populære chemogenetic verktøy for fjernkontroll av neuronal aktivitet, som gjennomgått av Roth 20165. DREADDs utnytte modifiserte muskarine acetylkolin reseptorer som er spesielt aktivert av en inert ligand, Clozapine-N-oksid (CNO)6.
De fleste studier bruker CNO administreres av intraperitoneal (IP) injeksjoner, som effektivt styrer dosering og timing av konstruerte reseptorer aktivering i en akutt måte. Imidlertid, når repeterende eller kronisk DREADD aktivisering er krevde, bruken av mangfoldig IP injeksjoner bli unfeasible. For å løse dette problemet, har ulike strategier for kronisk CNO levering er rapportert, inkludert implantert minipumps7 ogintrakraniell kanyler. Til ulike utvidelser, alle disse strategiene føre til at dyrene stress og smerte10, og krever en kirurgisk inngrep som kan også ha en direkte innvirkning på atferdsdata tiltak for å bli testet11. Her beskriver vi tre ikke-invasiv strategier for kronisk CNO levering.
For dette formålet, mus ble stereotaktiskt injisert i hippocampus med en adeno-assosiert virus (AAV) koding en utviklet versjon av eksitatoriske M3 muskarine reseptor (hM3Dq) at når den aktiveres av ligand CNO fører til burst-like avfyring av neurons6. Det ble tidligere vist at en enkelt øye-drop som inneholder CNO kan effektivt lokke fram en robust aktivering av DREADD-uttrykker neurons12. Her beskriver vi en modifisert metode for repeterende levering av øyedråper. For å oppnå kroniske og vedvarende kontroll av designeren reseptorer, vi neste beskriver en ikke-invasiv strategi for å levere CNO til mus gjennom drikkevannet. Til slutt beskriver vi et alternativ paradigme for å levere CNO i drikkevann i et begrenset tidsrom vindu. Mus Locomotor aktivitet, samt drikking atferd og inntak av Sweet kalori løsninger, er stort sett begrenset til den mørke delen av lys/mørk syklus13,14. Derfor vedtok vi en protokoll basert på musen preferanse for sukrose. Ved å måle induksjon av det umiddelbare genet c-Fos i AAV-infiserte celler, som en avlesning for neuronal aktivering12,15, fant vi ut at disse CNO leverings strategier robust aktivere DREADD-kontrollerte neurons over Extended Varigheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
DREADDs har dukket opp som en populær og effektiv tilnærming til eksternt manipulere neuronal aktivitet17. Utformingen av alternative strategier for CNO levering vil bredt øke spekteret av tilgjengelige alternativer for spesifikke eksperimentelle innstillinger. I tillegg ikke-invasiv strategier for levering av CNO minimere eventuelle feil tolkning av resultatene ved å redusere ugunstige bivirkninger som kan direkte påvirke dyrets helse. Her har vi beskrevet to ikke-invasiv strategier for CNO …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av intramural forskningsprogram ved nasjonalt Institutt for psykisk helse (ZIA MH002964-02). Vi vil gjerne takke støtte fra NIMH IRP gnagere Behavioral Core (ZIC MH002952).
Materials
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 in. |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III – Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 ml |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µl) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. . Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -. P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -. M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
