Summary
Здесь мы описываем два неинвазивных метода хронического контроля нейронной активности с использованием хемогенетики у мышей. Глазные капли были использованы для доставки клозапин-N-оксид (CNO) ежедневно. Мы также описываем два метода длительного введения CNO в питьевой воде. Эти стратегии хронического контроля нейронов требуют минимального вмешательства, снижая стресс животных.
Abstract
Химиогенетические стратегии стали надежными инструментами дистанционного управления нейронной активностью. Среди них дизайнерские рецепторы, активизируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), стали самым популярным хемогенетическим подходом, используемым в современной неврологии. Большинство исследований доставить лиганд клозапин-N-оксид (CNO) с помощью одной интраперитонеальной инъекции, которая подходит для острого активации / ингибирования целевой нейронной популяции. Есть, однако, лишь несколько примеров стратегий для хронической модуляции DREADD контролируемых нейронов, большинство из которых полагаются на использование систем доставки, которые требуют хирургического вмешательства. Здесь мы расширяем две неинвазивные стратегии для доставки лиганда CNO для хронического манипулирования нейронной популяции у мышей. CNO вводили либо с помощью повторяющихся (ежедневных) глазных капель, или хронически через питьевую воду животного. Эти неинвазивные парадигмы приводят к надежной активации дизайнерских рецепторов, которые сохранялись на протяжении всего лечения CNO. Методы, описанные здесь предлагают альтернативы для хронического DREADD-опосредованного контроля нейронной активности и могут быть полезны для экспериментов, направленных на оценку поведения в свободно движущихся животных, уделяя особое внимание менее инвазивных методов доставки CNO.
Introduction
Технические достижения в области нейробиологии позволили ученым точно выявлять иконтролировать активность определенных нейронных популяций 1. Это способствовало лучшепонять основы нейрональных цепей и их влияние на поведение животных, а также, пересмотр установленных догм2,3. Среди этих новых инструментов, оптогенетические и химиогенетические стратегии оказали глубокое влияние не только на качество открытий, но и на то, как эксперименты задуманы и разработаны4. В настоящей рукописи мы сосредоточиваемся на химиогенетических стратегиях контроля активации нейронов с помощью инженерных стратегий рецептор-лиганд. Дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими препаратами (DREADDs), представляют собой один из самых популярных химиогенетических инструментов для дистанционного управления нейронной активностью, как было рассмотрено Roth 20165. DREADDs использовать модифицированные мускариновых рецепторов ацетилхолина, которые специально активируются инертным лиганд, клозапин-N-оксид (CNO)6.
Большинство исследований используют CNO в ведении интраперитонеальных (т.п.) инъекций, который эффективно контролирует дозировку и сроки активации инженерных рецепторов в острой моды. Однако, когда требуется повторяющаяся или хроническая активация DREADD, использование нескольких инъекций i.p. становится неосуществимым. Для решения этой проблемы, различные стратегии для хронической доставки CNO были зарегистрированы, в том числе имплантированных minipumps7 и внутричерепных канюлев8,9. В разной степени, все эти стратегии вызывают у животных стресс и боль10, и требуют хирургического вмешательства, которые также могут иметь прямое влияние на поведенческие реакции, которые будут проверены11. Здесь мы описываем три неинвазивные стратегии для хронической доставки CNO.
Для этой цели мышам были стереотаксисически введены в гиппокампе с адено-ассоциированным вирусом (AAV), кодирующим сконструированную версию возбуждающего мускарина M3 (hM3Dq), что при активации лиганд CNO приводит к взрыву, как стрельба нейроны6. Ранее было показано, что одна капля глаз, содержащая CNO может эффективно вызвать надежную активацию DREADD-выражения нейронов12. Здесь мы описываем модифицированный метод для повторяющейся доставки глазных капель. Для достижения хронического и устойчивого контроля над рецепторами дизайнера, мы затем описать неинвазивную стратегию для доставки CNO для мышей через питьевую воду. Наконец, мы описываем альтернативную парадигму для доставки CNO в питьевой воде во время ограниченного временного окна. Мышей локомоторной деятельности, а также питьевой поведение и потребление сладких калорий решений, в основном ограничивается темной части света / темного цикла13,14. Поэтому мы приняли протокол, основанный на предпочтении мыши сахарозе. Путем измерять индукцию немедленно-раннего гена c-Fos в AAV-инфицированных клетках, как считывание для активации нейронов12,15, мы нашли что эти стратегии поставки CNO надежно активируют DREADD-контролируемые невенциальны над выдвинутыми Длительности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с руководящими принципами Комитетов по уходу и использованию животных Национального института психического здоровья (NIMH). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму боль и количество животных, используемых.
1. Инъекции адено-ассоциированных вирусов в гиппокампе
ПРИМЕЧАНИЕ: Дикий тип мышей смешанного фона (B6/129 F1 гибрид, 3 месяцев) были для стереотаксиically вводили с AAV кодирования M3 мускариновый рецептор (hM3Dq) в гиппокампе. В течение всего эксперимента, мыши были однодомейные, под регулярным 12 ч свет: 12 ч темный (T24) цикл, с доступом к пище и воде ad libitum.
- Перед выполнением стереотаксических операций очистите и стерилизуем стереотаксической раме и всех необходимых инструментах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические шторы могут быть использованы для поддержания стерильного поля и снижения потери тепла мыши. - Глубоко обезвититмышь мышь с помощью изофлюран. Для этого сначала отрегулируйте расходора кислорода примерно до 1,5 л/мин, а затем отрегулируйте изофлуранский испаритель примерно до 3-5% для индукции и примерно 1-3% для обслуживания.
- Чтобы убедиться, что животное полностью без сознания, щипать лапу мыши; животное должным образом обезболивается, когда вздрагивая ответ на щепотку отсутствует.
- Поместите мышь на грелку для поддержания стабильности температуры тела мыши.
- Побрить верхнюю часть головы и закрепите головку мыши к стереотаксической раме. Затем нанесите на глаза глазную защитную смазку, очистите поверхность, очистив повид-йодом и 70% этанола, и разоблачите череп с помощью стерильного скальпеля.
- Калибровайте раму до точки брегмы, затем просверлите по медиально-боковой координате 2,9 мм и передне-задним координатам -2,7 мм для целевой направленности на гиппокамп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если другой цель мозга должна быть введена, определить желаемые координаты для инъекций с помощью Paxinos и Франклин мыши атлас16. - Как только мозг подвергается, в одностороннем порядке вводить 90 нл AAV на дорсально-вентральной глубине -3,0 мм в гиппокампе с помощью микроинжектора и вытащил микрокапиллярных пипетки(рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблица материалов для титра AAV, используемого в этом эксперименте. Для других областей мозга, настроить объем AAV инъекции по мере необходимости. - В конце хирургической процедуры, закрыть разрез с нейлоновыми швами и применять актуальные антибиотики в рану сайта.
- Администрирование анальгетиков (бупренорфин, 0,1 мг/кг) системно сразу после операции, и 4-6 часов после.
- Начиная с 4 недель после инъекции, подвергимытие мышей любой из парадигм, описанных в следующем разделе для хронического контроля нейронов, выражающих дизайнер возбуждающий рецептор.
2. Повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель
- Акклиматизировать животных к обработке, чистя каждую мышь 3 мин ежедневно в течение 3-4 дней до введения глазных капель.
- Растворите Клозапин-N-оксид (CNO, 5 мг) в 1 мл стерильного раствора 0,9% солевой раствор (стоковый раствор: 5 мг CNO/mL). Храните раствор в холодильнике при 4 градусах Цельсия.
- Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента, чтобы определить количество CNO, которые будут доставлены. Используйте 1-3 капли (на глаз) для достижения 1,0 мг CNO / кг массы тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 20 г мыши должны получать двусторонние (по 2 л. каждый) глазные капли. - Доставка глазные капли во время неактивной (легкой) фазы мышей, 2 ч до выключения света (времяzeitgeber (ЗТ) 10). В тех случаях, когда CNO должен быть доставлен во время активной (темной) фазы мышей, обеспечить наличие тусклого красного света для надлежащего обращения с животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать нарушения циркадного (и светлого/темного) цикла экспериментальных животных.- Используя микропайпет P10, загрузите необходимое количество (1-3 л) раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый и стерильный кончик пипетки для каждого глаз-капли. В этом наборе экспериментов были выполнены двусторонние глазные капли CNO; однако, если требуется более низкая концентрация CNO, односторонние глазные капли могут быть также применены. - Обездвижить мышь через потертости.
- Медленно изгоните раствор до тех пор, пока на кончике пипетки не образуется стабильная капля.
- Аккуратно принесите капельку близко к роговице глаза мыши, пока раствор не будет доставлен. Наконечник пипетки никогда не должен контактировал с глазом мыши.
- Отпустите мышь, поместив ее обратно в свою домашнюю клетку.
- Используя микропайпет P10, загрузите необходимое количество (1-3 л) раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg.
- Повторите эту процедуру каждый день в течение 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями. - Для контрольных экспериментов используйте AAV/DREADD-инъекционные мыши, подвергающиеся фиктивному лечению (глазные капли, содержащие только солены), и мыши, вводимые с пустым вектором (например, AAV/mCherry), подвергаемые описанному протоколу глазных капель CNO.
3. Хроническая обработка CNO поставленная через питьевую воду
- Сделать небольшие бутылки с использованием 50 мл (пластиковые) конические трубки и резиновые пробки носики; крышка алюминиевой фольгой, чтобы избежать каких-либо световых воздействий на стабильность CNO.
- За три дня до начала обработки CNO, заменить регулярные бутылки с водой с небольшими бутылками, содержащие 10 мл обычной воды, чтобы мышей акклиматизироваться к ним. Защищайте бутылки к клеткам с помощью ленты.
- Измерьте ежедневное потребление воды для каждой мыши.
- Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента.
- Растворите клозапин-N-оксид (CNO, 5 мг) в 1 мл стерильного солей. Охладите бульонный раствор при 4 градусах Цельсия.
- Используйте вес тела и среднее количество потребляемой воды, чтобы определить концентрацию раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg (вес тела).
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые мыши-самцы (вес тела - 20 г) потребляют 5 мл воды в день(рисунок 2А). Поэтому для достижения концентрации CNO в 1 мг CNO/kg, 6,4 л раствора запасов CNO следует добавить к окончательному объему 8 мл воды (окончательная концентрация: 4 мкг CNO/mL). Таким образом, доза CNO для 20 г животного, которое пьет 5 мл воды в день приводит к 1 мг CNO / кг. - Определите оптимальную дозу CNO, которая отображает максимальную эффективность с минимальной концентрацией CNO, проверяя диапазон концентраций. Выполните анализ реакции дозы для определения оптимальной дозы CNO для метода питьевой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента были протестированы следующие дозы CNO: 1,0 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,1 мг/мл и солин. 1,0 мг CNO/kg был впервые протестирован на основе протоколов i.p. и глазных капель. - На 1 день, заполнить бутылку с 8 мл обычной воды и добавить необходимое количество CNO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество воды достаточно для 24 ч доступа к воде ad libitum для взрослой мужской мыши. В случае использования других видов грызунов, сначала измерьте количество воды, потребляемой ежедневно, чтобы определить необходимый объем. - Мониторинг здоровья животных на протяжении всего протокола, чтобы убедиться, что нет никаких побочных эффектов, вызванных водой и потреблением CNO.
- После 24 ч замените бутылки пресной водой и раствором CNO. Запись объема потребляемого в течение предыдущего дня.
- Утилизировать воду и раствор CNO, который не потреблялся в мусорных контейнерах. Откажитесь от пластиковых бутылок и замените резиновые пробки каждый день, после дезинфекции их в соответствии с руководящими принципами животного объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте ваковые отходы с органическими растворителями. Для получения инструкций по хранению и вывозу свяжетесь с нами в Службе химической утилизации. - Замените бутылки в одно и то же время каждый день в течение 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями. - Включите контрольные группы, как описано в шаге 2.6.
4. Ограниченное лечение CNO с использованием предпочтений мышей для сахарозы
- За 3 дня до начала лечения CNO поместите небольшую бутылку, содержащую 10 мл воды и 1% сахарозы на клетку, желательно вдали от оригинальной бутылки с водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же маленькие бутылки, описанные в шаге 3.1. - Выставляйте животных в воду и 1% сахарозы во время последней части их активной фазы (No 18 - 24). После этой экспозиции, удалить бутылку с водой и сахарозы из клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные временные окна доставки CNO могут быть использованы. Кроме того, мыши могут быть помещены под перевернутый свет / темный цикл, где начало света происходит в вечерние часы для облегчения доставки CNO. - Измерьте суточную норму воды и 1% потребления сахарозы для каждой мыши.
- Взвесьте каждую мышь перед началом эксперимента.
- Используйте вес тела и среднее количество воды - 1% сахарозы, потребляемой для определения дозы раствора CNO для достижения 1,0 мг CNO/kg (вес тела).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная доза CNO, которая отображает максимальную эффективность с минимальной концентрацией CNO должны быть проверены, как это объясняется в шаге 3.6. - На 1-й день, заполнить бутылки с 5 мл воды и 1% сахарозы и CNO (1 мг CNO / кг) и поместить их на клетку (всегда в том же месте) в течение определенного времени окна.
- В конце ограниченного временного окна, удалить бутылки и измерить количество воды и сахарозы и CNO потребляется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы и решения дезинфицируются или отбрасываются, как описано ранее в шаге 3.11. - Повторите эту процедуру каждый день в течение 5 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта продолжительность может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными требованиями. - Включите контрольную группу, описанную в шаге 2.6.
5. Анализ данных
- Perfuse мышей внутрикардиально с 4% параформальдегида (PFA) либо 2 или 6 ч после получения последнего повторяющихся (5-й день) CNO глаз капли. Когда CNO доставляется через питьевую воду, замените воду CNO и водой в конце активной фазы мыши, а затем пронизываете мышь после 2 или 6 ч после доступа CNO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если воздействие света может повлиять на индукцию c-Fos в области интереса, держать мышей в постоянной темноте в последний день экспериментов, и до перфузии. - Тщательно вскрыть мозг и погрузиться в 4% PFA решение для 9-12h.
- После фиксации PFA, криозащиты ткани мозга с помощью 30% сахарозы раствор (подождать, пока мозг тонет), а затем раздел мозга с помощью криостата.
- Перенесите секции коронального мозга (35 мкм) в раствор, содержащий 1x PBS, 10% бычьего сывороточку альбумина и 0,3% Triton X-100 на 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубировать секции мозга с анти-c-Fos (1:2500) антитела раствор на 4 кв кв ночь с постоянным возбуждением.
- После 3 стирок по 5 мин каждый с раствором, содержащим 1x PBS и 0,3% Triton X-100, инкубировать образцы с Alexa-конъюгированных вторичных антител (1:500) раствор для 1 ч при комнатной температуре вдали от света и с постоянным возбуждением.
- Получай цифровые изображения с помощью конфокального микроскопа. Собирайте и обрабатывают захваченные изображения с помощью программного обеспечения для редактирования и анализа фотографий (например, Adobe Photoshop).
- Для анализа данных, наброски и измерения AAV-инфицированных областей (mCherry (я) ячейки) с помощью программного обеспечения ImageJ, и количественно количество c-Fos (Я) клеток в этой области, чтобы получить количество активированных ячеек на область. Объедините результаты, полученные из 3 отдельных секций на одно животное.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы заметили, что повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель вызвали надежную индукцию c-Fos выражение в большинстве инфицированных нейронов (Рисунок 1C), показывая, что эффективность доставки CNO поддерживается во время повторяющихся воздействия. Кроме того, значительная индукция c-Fos наблюдалась в образцах, собранных 2 ч после обработки CNO, по сравнению с образцами, полученными 6 ч после воздействия CNO(Рисунки 1D-E), демонстрируя, что изменения, индуцированные CNO, зависят от времени.
Затем мы измерили эффективность хронической обработки CNO, поставляемой через питьевую воду. Мы заметили, что ежедневное потребление воды и CNO не сильно отличается по сравнению с общим объемом регулярной потребляемой воды(рисунок 2A). Аналогичным образом, количество воды и 1% сахарозы, потребляемой в течение ночи (6 ч время окна) не было затронуто добавлением CNO(Рисунок 2B). Кроме того, никаких различий в ежедневном потреблении (5 дней) воды и CNO(Рисунок 2C)и воды и сахарозы и CNO (Рисунок2D) не было обнаружено в ходе эксперимента для всех животных.
Подобно тому, что мы нашли с помощью CNO глазные капли, надежные индукции c-Fos наблюдается после 2 ч, но не 6 ч на cNO доступа (Рисунки 2E-F).
Наконец, мы измерили дозу ответ CNO добавил к питьевой воде. Для этого мышам были подвержены следующие дозы CNO: 1,0 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,1 мг/мл, солин. Во всех случаях, животные были perfused 2 ч после воздействия CNO. Мы обнаружили, что существует четкий порог эффективности для CNO, где низкая доза CNO (0,1 мг/мл) не вызывает активации c-Fos по сравнению с солевой контроль, в то время как более высокие дозы (0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл) индуцированной надежной и аналогичной индукции c-Fos ( Рисунок 2G).
Рисунок 1: Повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель. (A) AAV/hM3Dq-mCherry был стереотаксисически введен в гиппокампе взрослых (3 месяца) мышей мужского пола. (B) Четыре недели после инъекции, CNO вводили с помощью глазных капель один раз в день в течение 5 дней подряд. Использовалась доза 1,0 мг CNO/kg. (C) Наконец, мышей были принесены в жертву, и ткани мозга был протестирован на c-Fos (зеленый) иммунореактивности в AAV-инфицированной области (mCherry-положительные клетки, красный). Показана репрезентативная корональная секция места инъекции и активация CNO-Fos. (D) Количество c-Fos положительные клетки в AAV-инфицированной области был измерен у мышей, которые были проникнуты 2 или 6 ч после последнего введения CNO. Данные являются средними значениями для SEM. по т-тесту студента (n No 2-3 мышей). (E) Репрезентативные изображения для двух групп показаны. Шкала бар: 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Хроническая обработка CNO доставлено через питьевую воду. (A) Никаких различий в общем потреблении жидкости не наблюдалось между контрольными (вода) или обработанными (вода и CNO, доза: 1,0 мг CNO/kg) животных. Данные являются средними - SEM (n - 13-14 мышей). (B) Кроме того, никаких существенных различий не наблюдалось в объеме воды - 1 % сахарозы, потребляемой (в течение 6 ч временного окна), после добавления CNO (1,0 мг/кг). Данные являются средними - SEM (n no 5 мышей). (C) Показано ежедневное потребление воды и CNO (1,0 мг/кг) для отдельных мышей. Различий в ежедневном потреблении не наблюдалось. Данные являются средними - SEM (n no 5 мышей). (D) Показано ежедневное потребление жидкости (в течение 6 ч времени) в размере 1% сахарозы и CNO (1,0 мг/кг) для отдельных мышей. Различий в ежедневном потреблении не наблюдалось. Данные являются средними - SEM (n no 3 мышей). (E) 2 или 6 ч после последнего введения CNO, мыши были принесены в жертву, и количество c-Fos положительные клетки были количественно в AAV-инфицированной области. Данные являются средними значениями для SEM. по т-тесту студента (n No 5 мышей). (F) Мозг корональных секций были протестированы на c-Fos (зеленый) иммунореактивности в AAV-инфицированных (mCherry-положительных клеток, красный) области. Отображаются репрезентативные изображения. (G) Четыре дозы CNO были введены (0,1, 0,25, 0,5 и 1,0 мг CNO/ кг), и c-Fos индукции был измерен. Данные являются средними значениями для SEM. ANOVA, а затем тест Туки (n No 2 мышей). Шкала бар: 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs стали популярным и эффективным подходом к удаленному манипулированию нейронной активностью17. Разработка альтернативных стратегий для доставки СНО в целом увеличит спектр вариантов, доступных для конкретных экспериментальных настроек. Кроме того, неинвазивные стратегии доставки CNO свести к минимуму любое потенциальное неправильное толкование результатов за счет снижения побочных эффектов, которые могут непосредственно повлиять на здоровье животного. Здесь мы описали две неинвазивные стратегии доставки CNO, которые обеспечивают надежную активацию DREADDs (hM3Dq) и предлагают широкий спектр возможностей. Кроме того, мы считаем, что описанные здесь протоколы также могут быть полезны для различных вариантов DREADD для нейронных манипуляций, включая генетически модифицированные мускариновые или опиоидные рецепторы.
CNO доставки с использованием повторяющихся глазных капель представляет собой безболезнененную альтернативу повторяющихся интраперитонеальных инъекций CNO при сохранении власти точно контролировать дозировку и сроки доставки CNO. Поэтому мы рекомендуем использовать этот протокол, когда требуется повторная активация DREADD. Глазные капли также являются наименее дорогим вариантом для доставки CNO, особенно по сравнению с протоколом с использованием CNO добавил к питьевой воде. CNO поставляется через питьевую воду, с другой стороны, дает хронические и устойчивые активации DREADDS, избегая обработки мыши. Важно отметить, что в этом протоколе отсутствует точный контроль за сроками поставки CNO. Третий альтернативный, ограниченный по времени доступ к сахарозному раствору, содержащему CNO, сочетает в себе преимущества обоих протоколов, которые обсуждались ранее. Эта стратегия в то же время неинвазивная, повторяющаяся и проста в исполнении. Кроме того, он предлагает лучший контроль за сроками поставки CNO по сравнению с 24 ч доступ к воде с CNO. Предостережение этого подхода заключается в том, что он может быть использован только во время активной фазы животных. Мы рекомендуем использовать обе стратегии с участием CNO в питьевой воде в сочетании с инфракрасными камерами или системой лизать-о-метр для получения точной временной информации о потреблении CNO и, следовательно, активации DREADD.
Ранее сообщалось о долгосрочных последствиях, которые CNO осуществляет через питьевую воду. Мы успешно применили хроническое лечение CNO (5 мкг/мл) в течение 14 дней подряд15 для оценки поведенческих последствий тонизирующей активации таламо-корковой цепи, участвующей в контроле настроения. Кроме того, CNO, предоставляемые в питьевой воде в концентрации 40 мг / л был использован для хронической модулировать активность серотонинергических нейронов дозальное ядро raphe18, в то время как функция поджелудочной железы -клетки контролировались с помощью CNO при концентрации 0,25 мг/мл воды19. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что различные концентрации CNO могут быть настроены для эффективного контроля DREADDs. Здесь мы обнаружили, что различные дозы CNO добавил к питьевой воде вызвало аналогичные C-Fos активации, предполагая, что доза-ответ анализ должен быть выполнен для определения самой низкой и эффективной дозы CNO требуется. Недавние исследования показали, что CNO не является полностью фармакологически инертным20; кроме того, было также продемонстрировано, что активация in vivo DREADDs опосредовано CNO метаболитк клозапин, который имеет несколько эндогенных целей21. Поэтому авторы предлагают использовать подпороговые дозы клозапина, а не высокие дозы CNO. Хотя мы не оценили эффективность клозапин в описанных методах, мы обнаружили, что концентрация CNO может быть уменьшена без существенного снижения активации нейронов, и, следовательно, минимизации побочных эффектов, вызванных CNO-к-клозапин Преобразования.
Таким образом, представленные здесь стратегии представляют собой потенциальные схемы доставки CNO, которые могут быть легко адаптированы к различным экспериментальным проектам. Они были задуманы как неинвазивные стратегии, которые могут быть полезны для повторяющихся или хронических CNO-опосредованного активации DREADD-контролируемых нейронов, уменьшая влияние доставки CNO на поведение животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана программой интрамуральных исследований в Национальном институте психического здоровья (ЗИА MH002964-02). Мы хотели бы поблагодарить поддержку NIMH IRP грызунов поведенческого ядра (IC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
