Summary
Här beskriver vi två icke-invasiva metoder för att kroniskt kontrollera neuronala aktivitet med hjälp av chemogenetik hos möss. Ögondroppar användes för att leverera klozapin-N-oxid (CNO) dagligen. Vi beskriver också två metoder för långvarig administrering av CNO i dricksvatten. Dessa strategier för kronisk neuronala kontroll kräver minimal intervention minska djurens stress.
Abstract
Kemogenetiska strategier har vuxit fram som pålitliga verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet. Bland dessa, designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) har blivit den mest populära kemogenetiska metod som används i modern neurovetenskap. De flesta studier levererar ligand klozapin-N-oxid (CNO) med hjälp av en enda intraperitoneal injektion, som är lämplig för akut aktivering/hämning av den riktade neuronala befolkningen. Det finns dock bara några exempel på strategier för kronisk modulering av DREADD-kontrollerade nervceller, varav de flesta förlitar sig på användning av leveranssystem som kräver kirurgiska ingrepp. Här expanderar vi på två icke-invasiva strategier för att leverera ligand CNO att kroniskt manipulera neurala befolkningen i möss. CNO administrerades antingen genom att använda repetitiva (dagligen) ögondroppar, eller kroniskt genom djurets dricksvatten. Dessa icke-invasiva paradigm resultera i robust aktivering av de designer receptorer som kvarstod i hela CNO behandlingar. De metoder som beskrivs här erbjuder alternativ för kronisk DREADD-medierad kontroll av neuronala aktivitet och kan vara användbart för experiment som syftar till att utvärdera beteendet i fritt rörliga djur, med fokus på mindre invasiva CNO leveransmetoder.
Introduction
Tekniska framsteg inom neurovetenskap har gjort det möjligt för forskarna att exakt identifiera och kontrollera aktiviteten hos vissa neuronala populationer1. Detta har bidragit till att bättre förstå grunden för neuronala kretsar och deras inverkan på djurens beteende, samt, revidera etablerade dogmer2,3. Bland dessa nya verktyg, optogenetiska och kemogenetiska strategier har haft en djupgående inverkan inte bara på kvaliteten på upptäckter utan också på hur experiment utformas och utformas4. I det nuvarande manuskriptet fokuserar vi på chemogenetiska strategier för att kontrollera aktiveringen av nervceller via konstruerade receptor-ligand-strategier. Designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs) utgör en av de mest populära kemogenetiska verktyg för fjärrstyrning av neuronala aktivitet, som granskats av Roth 20165. DREADDs utnyttja modifierade muskarinacetylkolinreceptorer som är specifikt aktiveras av en inert ligand, klozapin-N-oxid (CNO)6.
De flesta studier använder CNO administreras av intraperitoneal (i.p.) injektioner, som effektivt styr doseringen och tidpunkten för konstruerade receptorer aktivering på ett akut sätt. Men när repetitiva eller kronisk DREADD aktivering krävs, användning av flera i.p. injektioner blir omöjlig. För att lösa detta problem, olika strategier för kronisk CNO leverans har rapporterats, inklusive implanterade minipumpar7 och intrakraniella kanyl8,9. Till olika grader, alla dessa strategier orsakar djuren stress och smärta10, och kräver en kirurgisk intervention som också kan ha en direkt inverkan på beteendemässiga svar som ska testas11. Här beskriver vi tre icke-invasiva strategier för kronisk CNO-leverans.
För detta ändamål var möss stereotaxically injiceras i hippocampus med en Adeno-associerade virus (AAV) kodning en konstruerad version av excitatoriska M3 muskarina receptor (hM3Dq) som när den aktiveras av ligand CNO leder till burst-liknande bränning av nervceller6. Det visades tidigare att en enda ögondroppe som innehåller CNO effektivt kan framkalla en robust aktivering av DREADD-uttrycker nervceller12. Här beskriver vi en modifierad metod för repetitiv leverans av ögondroppar. För att uppnå kronisk och varaktig kontroll av designerreceptorer, beskriver vi nästa en icke-invasiv strategi för att leverera CNO till möss genom dricksvattnet. Slutligen beskriver vi ett alternativt paradigm för att leverera CNO i dricksvatten under ett begränsat tidsfönster. Möss rörelseaktivitet, liksom dryckesbeteende och konsumtionen av söta kalori lösningar, är oftast begränsade till den mörka delen av ljus/mörker cykel13,14. Därför antog vi ett protokoll baserat på musens preferens för sackaros. Genom att mäta induktionen av den omedelbara tidiga genen c-FOS i AAV-infekterade celler, som en avläsning för neuronala aktivering12,15, fann vi att dessa CNO leverans strategier kraftfullt aktivera dreadd-kontrollerade neuroner över utökade Varaktigheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur sköttes i enlighet med riktlinjerna från det nationella institutet för psykisk hälsa (NIMH). Alla ansträngningar gjordes för att minimera smärtan och antalet djur som används.
1. Adeno-associerade virus injektioner i hippocampus
Anmärkning: Vild typ hanmöss med blandad bakgrund (B6/129 F1 hybrid, 3 månader gamla) var för stereotaxically injiceras med en AAV kodning M3 muskarina receptor (hM3Dq) i hippocampus. Under hela experimentet, möss var enkel-inrymt, under en regelbunden 12 h ljus: 12 h Dark (T24) cykel, med tillgång till mat och vatten AD libitum.
- Innan du utför stereotaxic operationer, rengör och sterilisera stereotaxic ram och alla nödvändiga instrument.
Anmärkning: kirurgiska draperier kan användas för att upprätthålla ett sterilt fält och minska musens värmeförlust. - Djupt söva musen med isofluran. För att göra detta, först justera syre flödesmätaren till cirka 1,5 L/min, och sedan justera isofluran spridare till cirka 3-5% för induktion och cirka 1-3% för underhåll.
- För att säkerställa att djuret är fullt medvetslöst, nyp musens tass; djuret är ordentligt sövda när flinande svar på nypa är frånvarande.
- Placera musen på en värmedyna för att bibehålla stabiliteten i musens kroppstemperatur.
- Raka toppen av huvudet och fäst huvudet av musen till stereotaxic ram. Sedan, applicera okulär skyddande smörjmedel på ögonen, rengör ytan genom skrubbning med povidon-jod och 70% etanol, och exponera skallen med en steril skalpell.
- Kalibrera ramen till bregma punkt, sedan borra på en medial-lateral koordinat av 2,9 mm och en främre-posterior koordinat-2,7 mm för att rikta hippocampus.
Anmärkning: om andra hjärn mål måste injiceras, bestämma de önskade koordinaterna för injektion med hjälp av Paxinos och Franklin Mouse Atlas16. - När hjärnan exponeras, ensidigt injicera 90 nL av AAV vid dorsala-ventrala djupet av-3,0 mm i hippocampus med hjälp av en microinjektor och drog microcapillary pipetter (figur 1a).
Anmärkning: se tabell över material för titern av AAV används i detta experiment. För andra hjärnområden, justera AAV-volymen för injektion efter behov. - I slutet av det kirurgiska ingreppet, Stäng snittet med nylon suturer och tillämpa topikala antibiotika till såret webbplats.
- Administrera analgetika (buprenorfin, 0,1 mg/kg) systemiskt omedelbart efter operationen, och 4-6 timmar efter.
- Början 4 veckor efter injektion, ämne möss till någon av de paradigm som beskrivs i följande avsnitt för att kroniskt styra nervceller som uttrycker designern excitatoriska receptor.
2. repetitiv CNO-leverans med ögondroppar
- Acclimate djuren att hantera genom att skruffa varje mus 3 min dagligen för 3-4 dagar före administrering av ögondroppar.
- Lös upp klozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) i 1 mL steril 0,9% saltlösning (stamlösning: 5 mg CNO/mL). Förvara lösningen kyld vid 4 ° c.
- Väg varje mus innan du påbörjar experimentet för att bestämma mängden CNO som ska levereras. Använd 1-3 μL droppe (per öga) för att uppnå 1,0 mg CNO/kg kroppsvikt.
Obs: som ett exempel bör en 20 g mus få bilaterala (2 μL vardera) ögondroppar. - Leverera ögondroppar under den inaktiva (lätta) fasen av möss, 2 h innan lamporna stängs av (Zeitgeber Time (ZT) 10). I de fall CNO behöver levereras under den aktiva (mörka) fasen av möss, säkerställ närvaron av svagt rött ljus för korrekt djurhantering.
Anmärkning: försiktighetsåtgärder bör vidtas för att undvika att störa cirkadiska (och ljus/mörker) cykel av försöksdjur.- Använd en P10-mikropipett och fyll på erforderligt belopp (1-3 μL) CNO-lösning för att uppnå 1,0 mg CNO/kg.
Obs: Använd en ny och steril pipettspets för varje ögondroppe. I denna uppsättning experiment utfördes bilaterala ögondroppar av CNO; men om en lägre CNO koncentration krävs, ensidiga ögondroppar kan också tillämpas. - Immobilize musen via Scruff.
- Långsamt utvisa lösningen tills en stabil droppe bildas på pipettspetsen.
- Ta försiktigt upp droppet nära hornhinnan i musens öga tills lösningen levereras. Pipettspetsen ska aldrig kontakta musens öga.
- Släpp musen, placera den tillbaka i sin hem bur.
- Använd en P10-mikropipett och fyll på erforderligt belopp (1-3 μL) CNO-lösning för att uppnå 1,0 mg CNO/kg.
- Upprepa proceduren varje dag i 5 dagar.
Obs: denna varaktighet kan justeras enligt de experimentella kraven. - För kontroll experiment, Använd AAV/DREADD-injicerade möss som utsätts för simulerad behandling (ögondroppar som endast innehåller saltlösning) och möss som injiceras med en tom vektor (t. ex. AAV/mCherry) som utsätts för det beskrivna CNO Eye-Drops-protokollet.
3. kronisk CNO-behandling levererad genom dricksvatten
- Gör små flaskor med 50 mL (plast) koniska rör och gummipropp spouts; Täck med aluminiumfolie för att undvika ljus-medierade effekter på CNO stabilitet.
- Tre dagar innan du börjar med CNO-behandlingen, Byt ut vanliga vattenflaskor med små flaskor, innehållande 10 mL vanligt vatten, så att möss kan vänja sig vid dem. Säkra flaskorna till burarna med tejp.
- Mät den dagliga vattenförbrukningen för varje mus.
- Väg varje mus innan du påbörjar experimentet.
- Lös upp klozapin-N-oxid (CNO, 5 mg) i 1 mL 0,9% steril saltlösning. Kylskåp stamlösningen vid 4 ° c.
- Använd kroppsvikten och den genomsnittliga mängden vatten som förbrukas för att definiera koncentrationen av CNO lösning för att uppnå 1,0 mg CNO/kg (kroppsvikt).
Obs: vuxna hanmöss (~ 20 g kroppsvikt) förbrukar ~ 5 mL vatten per dag (figur 2A). För att uppnå en CNO-koncentration på 1 mg CNO/kg bör därför 6,4 μL CNO-lagerlösning tillsättas till en slutlig volym på 8 mL vatten (slutkoncentration: 4 μg CNO/mL). Således, dosen av CNO för ett 20 g djur som dricker 5 mL vatten per dag resulterar i 1 mg CNO/kg. - Bestäm den optimala CNO-dosen som visar maximal effektivitet med minimal CNO-koncentration genom att testa en rad koncentrationer. Utför en dos svars analys för att fastställa den optimala CNO-dosen för dricksvatten metoden.
Anmärkning: följande CNO-doser testades för detta experiment: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL och saltlösning. 1,0 mg CNO/kg prövades först, baserat på i.p. och Eye-droppar protokoll. - På dag 1, Fyll flaskan med 8 mL vanligt vatten och tillsätt önskad mängd CNO.
Obs: denna mängd vatten är tillräckligt för 24 h av AD libitum vattentillgång för en vuxen manlig mus. Om andra gnagare arter används, först mäta mängden vatten som förbrukas dagligen för att bestämma den volym som behövs. - Övervaka djurens hälsa i hela protokollet för att säkerställa att det inte finns några negativa biverkningar orsakade av vatten + CNO konsumtion.
- Efter 24 h, Byt ut flaskorna med färskvatten + CNO lösning. Anteckna volymen som förbrukas under föregående dag.
- Kassera vatten + CNO-lösningen som inte konsumerades i avfallsbehållare. Kassera plastflaskor och Byt ut gummiproppar varje dag, efter att de desinficerat dem enligt riktlinjerna för djurens anläggning.
Obs: Blanda inte vattenhaltigt avfall med organiska lösningsmedel. Kontakta kemikalie kasse rings tjänsten för instruktioner för förvaring och avhämtning. - Byt ut flaskorna vid samma tid varje dag i 5 dagar.
Obs: denna varaktighet kan justeras enligt de experimentella kraven. - Inkludera kontrollgrupper, enligt beskrivningen i steg 2,6.
4. begränsad CNO-behandling med möss föredrar sackaros
- 3 dagar innan du börjar med CNO-behandlingen, placera en liten flaska som innehåller 10 mL vatten + 1% sackaros på buren, helst bort från den ursprungliga vattenflaskan.
Obs: Använd samma små flaskor som beskrivs i steg 3,1. - Exponera djur för vatten + 1% sackaros under den sista delen av deras aktiva fas (ZT 18 – 24). Efter denna exponering, ta bort flaskan med vatten + sackaros från buren.
Obs: olika tidsfönster av CNO leverans kan användas. Dessutom kan möss placeras under en inverterad ljus/mörk cykel, där uppkomsten av ljus inträffar under kvällstid för att underlätta CNO leverans. - Mät den dagliga vatten + 1% sackaros konsumtion för varje mus.
- Väg varje mus innan du påbörjar experimentet.
- Använd kroppsvikten och den genomsnittliga mängden vatten + 1% sackaros konsumeras för att bestämma dosen av CNO lösning för att uppnå 1,0 mg CNO/kg (kroppsvikt).
Obs: den optimala CNO-dosen som visar maximal effektivitet med minimal CNO-koncentration bör testas, enligt beskrivningen i steg 3,6. - På dag 1, Fyll flaskor med 5 mL vatten + 1% sackaros + CNO (1 mg CNO/kg) och placera dem på buren (alltid på samma plats) under den fastställda tidsperiod fönstret.
- I slutet av den begränsade tiden fönstret, ta bort flaskorna och mäta mängden vatten + sackaros + CNO konsumeras.
Anmärkning: material och lösningar saneras eller kasseras som tidigare beskrivits i steg 3,11. - Upprepa proceduren varje dag i 5 dagar.
Obs: denna varaktighet kan justeras enligt de experimentella kraven. - Inkludera en kontrollgrupp, enligt beskrivningen i steg 2,6.
5. analys av data
- Perfuse möss intracardially med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) antingen 2 eller 6 h efter att ha mottagit den sista repetitiva (5: e dagen) CNO Eye-Drop. När CNO levereras genom dricksvatten, Ersätt CNO + vatten med vatten i slutet av musens aktiva fas, sedan parfymera musen efter antingen 2 eller 6 h post-CNO-åtkomst.
Anmärkning: om ljus exponering kan påverka c-FOS induktion i området av intresse, hålla möss i konstant mörker under den sista dagen av experimenten, och före perfusion. - Noggrant dissekera hjärnan ut och sänk i 4% PFA lösning för 9-12h.
- Efter PFA fixering, kryoprotect hjärnvävnaden med hjälp av en 30% sackaroslösning (vänta tills hjärnan sjunker), sedan avsnitt hjärnan med hjälp av en kryostat.
- Överför koronala hjärn sektioner (35 μm) till en lösning som innehåller 1x PBS, 10% bovint serumalbumin och 0,3% Triton X-100 för 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera hjärn sektionerna med en anti-c-FOS (1:2500) antikropps lösning vid 4 ° c över natten med ständig agitation.
- Efter 3 tvättar av 5 min vardera med en lösning som innehåller 1x PBS och 0,3% Triton X-100, inkubera proverna med en Alexa-konjugerad sekundär antikropp (1:500) lösning för 1 h vid rumstemperatur borta från ljus och med ständig agitation.
- Hämta digitala bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop. Montera och bearbeta tagna bilder med ett fotoredigerings-och analysprogram (t. ex. Adobe Photoshop).
- För dataanalys, kontur och mäta AAV-infekterade området (mCherry (+) celler) med ImageJ programvara, och kvantifiera antalet c-FOS (+) celler i denna region för att få antalet aktiverade celler per område. Kombinera de resultat som erhålls från 3 separata avsnitt per djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi observerade att upprepad CNO leverans med ögondroppar framkallade en robust induktion av c-FOS uttryck i de flesta infekterade nervceller (figur 1c), visar att effektiviteten av CNO leverans upprätthålls under upprepad exponering. Dessutom observerades en signifikant induktion av c-FOS i prover som samlats in 2 timmar efter CNO-behandling, jämfört med prover som erhållits 6 h efter CNO-exponering (figurerna 1d-E), vilket visar att förändringar som induceras av CNO är tidsberoende.
Vi mätte sedan effektiviteten av kronisk CNO behandling som levereras genom dricksvatten. Vi konstaterade att den dagliga konsumtionen av vatten + CNO inte var signifikant annorlunda jämfört med den totala volymen av vanligt vatten som förbrukas (figur 2A). På samma sätt påverkades inte mängden vatten + 1% sackaros som konsumerades under natten (6 h tidsfönster) genom tillsats av CNO (figur 2b). Ytterligare, inga skillnader i den dagliga konsumtionen (5 dagar) av både vatten + CNO (figur 2C) och vatten + sackaros + CNO (figur 2D) hittades i hela experimentet för alla djur.
Liknar vad vi hittade med CNO Eye-droppar, robust induktion av c-FOS observerades efter 2 h men inte 6 h vid CNO tillgång (figur 2e-F).
Slutligen mätte vi dos reaktionen av CNO tillsätts dricksvatten. För att göra detta, möss utsattes för följande CNO doser: 1,0 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1 mg/mL, saltlösning. I samtliga fall var djuren parfymera 2 h efter CNO-exponering. Vi fann att det finns en tydlig tröskel för effektivitet för CNO, där en låg CNO dos (0,1 mg/mL) inte framkalla c-FOS aktivering jämfört med saltlösning, medan högre doser (0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL och 1,0 mg/mL) inducerade robust och liknande c-FOS induktion ( Figur 2G).
Figur 1: repetitiv CNO-leverans med ögondroppar. (A) AAV/HM3Dq-mcherry var stereotaxically injiceras i hippocampus av vuxna (3 månader gamla) manliga möss. B) fyra veckor efter injektionen administrerades CNO med ögondroppar en gång dagligen under 5 dagar i följd. En dos på 1,0 mg CNO/kg användes. (C) Slutligen, möss offrades, och hjärnvävnad testades för C-FOS (grön) immunoreaktivitet i AAV-infekterade området (mcherry-positiva celler, röd). En representativ koronala sektion av injektionsstället och CNO-medierad c-FOS-aktivering visas. Dantalet positiva celler av c-FOS i det AAV-infekterade området mättes hos möss som var parfymera 2 eller 6 timmar efter den sista administreringen av CNO. Data är medelvärdet ± SEM. * * * p < 0,001; av Students t-test (n = 2-3 möss). (E) representativa bilder för de två grupperna visas. Skalbar: 100 μm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kronisk CNO-behandling levererad genom dricksvatten. A) inga skillnader i den totala vätske förbrukningen observerades mellan kontroll (vatten) eller behandlad (vatten + CNO, dos: 1,0 mg CNO/kg) djur. Data är medelvärdet ± SEM (n = 13-14 möss). (B) på samma sätt observerades inga signifikanta skillnader i volymen vatten + 1% sackaros som konsumeras (under en 6 h tidsfönster), efter tillsats av cno (1,0 mg/kg). Data är medelvärdet ± SEM (n = 5 möss). (C) daglig konsumtion av vatten + CNO (1,0 mg/kg) för enskilda möss visas. Inga skillnader i den dagliga konsumtionen observerades. Data är medelvärdet ± SEM (n = 5 möss). D) daglig vätskeförbrukning (under 6 timmar) av 1% sackaros + cno (1,0 mg/kg) för enskilda möss visas. Inga skillnader i den dagliga konsumtionen observerades. Data är medelvärdet ± SEM (n = 3 möss). (E) 2 eller 6 h efter den sista CNO administration, möss offrades, och antalet c-FOS positiva celler kvantifierades i AAV-infekterade området. Data är medelvärdet ± SEM. * * * p < 0,001; av Students t-test (n = 5 möss). (F) hjärn korniga sektioner testades för c-FOS (grön) immunoreaktivitet i AAV-infekterade (mcherry-positiva celler, röd) region. Representativa bilder visas. (G) fyra CNO-doser administrerades (0,1, 0,25, 0,5 och 1,0 mg CNO/kg) och c-FOS-induktionen mättes. Data är medelvärdet ± SEM. * * * p < 0,001; av ANOVA, följt av Tukey ' s test (n = 2 möss). Skalbar: 100 μm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs har vuxit fram som en populär och effektiv strategi för att på distans manipulera neuronala aktivitet17. Utformningen av alternativa strategier för CNO leverans kommer i stort sett öka spektrumet av alternativ tillgängliga för specifika experimentella inställningar. Dessutom, icke-invasiva strategier för leverans av CNO minimera eventuella feltolkningar av resultaten genom att minska negativa biverkningar som direkt kan påverka djurens hälsa. Här beskrev vi två icke-invasiva strategier för CNO leverans som ger en robust aktivering av DREADDs (hM3Dq) och erbjuder ett brett spektrum av möjligheter. Vidare anser vi att de protokoll som beskrivs här kan också vara användbara för olika DREADD varianter för neuronala manipulation, inklusive genetiskt modifierade muskarina eller opioidreceptorer.
CNO leverans med repetitiva ögondroppar representerar ett smärtfritt alternativ till repetitiva intraperitoneala CNO injektioner samtidigt behålla kraften att exakt kontrollera dosering och timing av CNO leverans. Därför rekommenderar vi att du använder det här protokollet när upprepad DREADD-aktivering krävs. Ögondroppar är också det billigaste alternativet för CNO leverans, särskilt jämfört med protokollet med CNO läggas till dricksvattnet. CNO levereras genom dricksvatten, å andra sidan, ger en kronisk och ihållande aktivering av DREADDS, undvika alla mushantering. Det är viktigt att nämna att detta protokoll saknar exakt kontroll över tidpunkten för CNO-leveransen. Ett tredje alternativ, tidsbegränsad tillgång till en sackaroslösning som innehåller CNO, kombinerar fördelarna med båda protokollen som tidigare diskuterats. Denna strategi är på samma gång icke-invasiva, repetitiva och lätt att utföra. Dessutom erbjuder det en bättre kontroll av tidpunkten för CNO leverans jämfört med 24 h tillgång till vatten med CNO. En varning för detta tillvägagångssätt är att den endast kan användas under den aktiva fasen av djur. Vi rekommenderar att du använder båda strategierna med CNO i dricksvatten i kombination med infraröda kameror eller en Lick-o-metersystem för att få exakt temporala information om CNO konsumtion och därför DREADD aktivering.
De långvariga effekter som CNO gav genom dricksvatten har tidigare rapporterats. Vi har framgångsrikt tillämpat en kronisk CNO (5 μg/mL) behandling under 14 på varandra följande dagar15 för att utvärdera de beteendemässiga konsekvenserna av tonic aktivering av en thalamo-kortikal krets inblandade i humör kontroll. Alternativt, CNO tillhandahålls i dricksvattnet vid en koncentration av 40 mg/L har använts för att kroniskt modulera aktiviteten av serotonerga neuroner i dorsala Raphe Nucleus18, medan funktionen av bukspottskörteln β-celler kontrollerades med hjälp av CNO vid en koncentration av 0,25 mg/mL vatten19. Kombinerat, dessa resultat tyder på att olika CNO koncentrationer kan justeras för att effektivt kontrollera DREADDs. Här fann vi att olika doser av CNO läggas till dricksvatten framkallade liknande c-FOS aktivering, vilket tyder på att en dos-respons analys bör utföras för att definiera den lägsta och effektiv CNO dos som krävs. Nyligen genomförda studier har visat att CNO inte är helt farmakologiskt inert20; Dessutom visades det också att in vivo-aktiveringen av DREADDs medieras av CNO-metaboliten klozapin, som har flera endogena mål21. Därför, författarna föreslår att använda subthreshold doser av klozapin, i stället för höga CNO doser. Även om vi inte har utvärderat effekten av klozapin i de beskrivna metoderna, fann vi att CNO koncentration kan reduceras utan att signifikant minska neuronala aktivering, och därför, minimera biverkningar orsakade av CNO-to-klozapin Konvertering.
Sammanfattnings, de strategier som presenteras här representerar potentiella system för CNO leverans som lätt kan anpassas till en mängd olika experimentella konstruktioner. De utformades som icke-invasiva strategier som kan vara användbara för repetitiva eller kroniska CNO-medierad aktivering av DREADD-kontrollerade nervceller, minska effekterna av CNO leverans på djurens beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av interna forskningsprogram vid National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02). Vi skulle vilja tacka stöd av NIMH IRP gnagare beteendemässiga kärna (ZIC MH002952).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
