Summary
Burada farelerde kemogenetik kullanarak nöronal aktiviteyi kronik olarak kontrol etmek için iki non-invaziv yöntem açıklanmıştır. Göz damlaları günlük klozapin-N-oksit (CNO) sunmak için kullanıldı. Ayrıca içme suyunda CNO uzun süreli uygulanması için iki yöntem açıklar. Kronik nöronal kontrol için bu stratejiler hayvanların stresini azaltarak minimal müdahale gerektirir.
Abstract
Kemogenetik stratejiler nöronal aktivitenin uzaktan kontrolü için güvenilir araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bunlar arasında, tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) modern nörolojik kullanılan en popüler kemogenetik yaklaşım haline gelmiştir. Çoğu çalışma, hedeflenen nöronal popülasyonun akut aktivasyonu/inhibisyonu için uygun olan tek bir intraperitoneal enjeksiyon kullanarak ligand klozapin-N-oksit (CNO) sunar. Bununla birlikte, DREADD kontrollü nöronların kronik modülasyonu için stratejilersadece birkaç örnek vardır, bunların çoğunluğu cerrahi müdahale gerektiren dağıtım sistemlerinin kullanımına dayanır. Burada, ligand CNO'yu farelerdeki nöral popülasyonu kronik olarak manipüle etmek için teslim etmek için iki non-invaziv stratejiyi genişletiyoruz. CNO ya tekrarlayan (günlük) göz damlaları kullanılarak ya da kronik olarak hayvanın içme suyu yoluyla uygulandı. Bu non-invaziv paradigmalar CNO tedavileri boyunca devam tasarımcı reseptörlerinin sağlam aktivasyonu ile sonuçlanır. Burada açıklanan yöntemler nöronal aktivitenin kronik DREADD aracılı kontrolü için alternatifler sunmakta ve serbestçe hareket eden hayvanlardaki davranışları değerlendirmek için tasarlanmış deneylerde, daha az invaziv CNO dağıtım yöntemlerine odaklanarak yararlı olabilir.
Introduction
Nöroloji alanındaki teknik gelişmeler, bilim adamlarının belirli nöronal popülasyonların aktivitesini tamolarak belirlemelerine ve kontrol etmelerine olanak sağlamıştır 1. Bu daha iyi nöronal devrelerin temelini ve hayvan davranışı üzerindeki etkilerini anlamak için katkıda bulunmuştur, yanı sıra, kurulan dogmalar revize2,3. Bu yeni araçlar arasında, optogenetik ve kemogenetik stratejiler keşiflerin kalitesi üzerinde değil, aynı zamanda deneylerin tasarlanıptasarlanmabiçimi üzerinde de derin bir etkiye sahiptir 4. Bu yazıda, nöronların aktivasyonunu mühendislik reseptör-ligand stratejileri ile kontrol etmek için kemogenetik stratejilere odaklanıyoruz. Tasarımcı reseptörleri sadece tasarımcı ilaçlar tarafından aktive (DREADDs) nöronal aktiviteuzaktan kontrol için en popüler kemogenetik araçlardan birini temsil, Roth tarafından gözden olarak 20165. DREADDs özellikle bir inert ligand tarafından aktive modifiye muskcarinik asetilkolin reseptörleri kullanmak, klozapin-N-oksit (CNO)6.
Çoğu çalışmada, akut bir şekilde mühendislik reseptörlerinin aktivasyonunun dozajını ve zamanlamasını etkili bir şekilde kontrol eden intraperitoneal (yani) enjeksiyonlar tarafından uygulanan CNO kullanılır. Ancak, tekrarlayan veya kronik DREADD aktivasyonu gerektiğinde, birden fazla i.p. enjeksiyonunun kullanımı mümkün değildir. Bu sorunu gidermek için, kronik CNO doğum için farklı stratejiler bildirilmiştir, implante minipumpsdahil 7 ve intrakranial kanüller8,9. Farklı ölçüde, tüm bu stratejiler hayvanların stres ve ağrıneden 10, ve aynı zamanda test edilecek davranışsal tepkiler üzerinde doğrudan bir etkisi olabilir cerrahi bir müdahale gerektirir11. Burada kronik CNO doğumu için üç non-invaziv strateji açıklıyoruz.
Bu amaçla, fareler stereotaksik bir adeno-ilişkili virüs ile hipokampus enjekte edildi (AAV) uyarıcı M3 muscarinic reseptörü (hM3Dq) bir mühendislik sürümünü kodlama ligand CNO tarafından aktive patlama gibi ateş yol açar nöronlar6. Daha önce CNO içeren tek bir göz damlası etkili DREADD ifade nöronların sağlam bir aktivasyon ortaya olabilir gösterilmiştir12. Burada göz damlalarının tekrarlayan teslimatı için değiştirilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Tasarımcı reseptörlerinin kronik ve sürekli kontrolünü sağlamak için, daha sonra içme suyu aracılığıyla farelere CNO sunmak için non-invaziv bir strateji açıklar. Son olarak, sınırlı bir zaman dilimi içinde içme suyunda CNO teslim etmek için alternatif bir paradigma açıklar. Fareler lokomotor aktivitesi, yanı sıra içme davranışı ve tatlı kalori çözeltileri tüketimi, çoğunlukla ışık / karanlık döngüsü13,14karanlık kısmı ile sınırlıdır. Bu nedenle farenin sakaroz tercihine dayalı bir protokol uyguladık. AAV-enfekte hücrelerde hemen erken gen c-Fos indüksiyon ölçerek, nöronal aktivasyon için bir okuma olarak12,15, Biz bu CNO dağıtım stratejileri sağlam dreadd kontrollü nöronlar üzerinde genişletilmiş etkinleştirmek bulundu Süre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü 'nün (NIMH) Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri yönergelerine uygun olarak ele alındı. Kullanılan hayvan sayısını ve acısını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi.
1. Hipokampus adeno ilişkili virüs enjeksiyonları
NOT: Karışık arka plan (B6/129 F1 hibrid, 3 aylık) yabani tip erkek fareler stereotaksik hipokampus içine M3 muskarinik reseptör (hM3Dq) kodlama bir AAV ile enjekte edildi. Tüm deney sırasında, fareler tek ev, düzenli bir 12 saat ışık altında: 12 saat karanlık (T24) döngüsü, gıda ve su reklam libitumerişimi ile.
- Stereotaksik ameliyatları gerçekleştirmeden önce stereotaksik çerçeveyi ve gerekli tüm aletleri temizleyin ve sterilize edin.
NOT: Cerrahi perdeler steril bir alanı korumak ve farenin ısı kaybını azaltmak için kullanılabilir. - Derinden izoflurane kullanarak fare anestezik. Bunu yapmak için, önce oksijen akış ölçeri yaklaşık 1,5 L/dak olarak ayarlayın ve ardından isofluran buharlaştırıcıyı indüksiyon için yaklaşık %3-5 ve bakım için yaklaşık %1-3 olarak ayarlayın.
- Hayvanın tamamen baygın olduğundan emin olmak için farenin pençesini çimdikle; hayvan düzgün çimdik için flinching yanıt yok olduğunda anestezi edilir.
- Farenin vücut ısısının stabilitesini korumak için fareyi ısıtma yastığına yerleştirin.
- Kafanın üst kısmını tıraş edin ve farenin başını stereotaksik çerçeveye sabitle. Daha sonra gözlere göz koruyucu yağlayıcı uygulayın, povione-iyot ve %70 etanol ile ovarak yüzeyi temizleyin ve steril bir neşter kullanarak kafatasını ortaya çıkarın.
- Çerçeveyi bregma noktasına kalibre edin, ardından hipokampusu hedeflemek için 2,9 mm'lik orta-lateral koordinatta ve -2,7 mm'lik anterior-posterior koordinatta delin.
NOT: Diğer beyin hedefi enjekte edilmesi gerekiyorsa, Paxinos ve Franklin fare atlası16kullanarak enjeksiyon için istenilen koordinatları belirleyin. - Beyin maruz kaldığında, tek taraflı olarak bir mikroenjektör kullanarak hipokampusta -3.0 mm dorsal-ventral derinlikte AAV 90 nL enjekte ve mikrokapiller pipetler çekti (Şekil1A).
NOT: Bu deneyde kullanılan AAV titreci için Malzeme Tablosu'na bakınız. Diğer beyin bölgeleri için, gerektiğinde enjeksiyon AAV hacmini ayarlayın. - Cerrahi işlemin sonunda kesiyi naylon dikişlerle kapatın ve yara bölgesine topikal antibiyotik uygulayın.
- Ameliyattan hemen sonra ve 4-6 saat sonra analjezikler (buprenorfin, 0.1 mg/kg) sistemsel olarak uygulayın.
- Enjeksiyon sonrası 4 hafta başlayarak, aşağıdaki bölümde açıklanan paradigmalardan herhangi biri için konu fareler kronik nöronlar tasarımcı uyarıcı reseptör ifade kontrol etmek.
2. Göz damlası kullanarak tekrarlayan CNO teslimatı
- Göz damlası uygulamasından önce 3-4 gün boyunca her fareyi 3 dk günde 3 dk silkeleyerek hayvanları işlemeye alıştırın.
- Klozapin-N-oksit (CNO, 5 mg) 1 mL steril %0.9 tuzlu çözeltide çözün (stok çözeltisi: 5 mg CNO/ mL). Çözeltiyi 4 °C'de buzdolabında saklayın.
- Teslim edilecek CNO miktarını belirlemek için denemeyi başlatmadan önce her fareyi tartın. 1.0 mg CNO/ kg vücut ağırlığı elde etmek için 1-3 μL damla (göz başına) kullanın.
NOT: Örnek olarak, 20 g'lık bir fare yeneni (her biri 2 μL) göz damlası almalıdır. - Farelerin inaktif (Hafif) fazı sırasında göz damlalarını teslim edin, ışıklar sönmeden önce 2 saat(zeitgeber zamanı (ZT) 10). Farelerin aktif (karanlık) evresinde CNO'nun teslim edilmesi gereken durumlarda, uygun hayvan kullanımı için loş kırmızı ışığın varlığından emin olun.
NOT: Deneysel hayvanların sirkadiyen (ve açık/karanlık) döngüsünü bozmamak için önlemler alınmalıdır.- P10 mikropipet kullanarak, 1.0 mg CNO/ kg elde etmek için cno çözeltisinin gerekli miktarını (1-3 μL) yükleyin.
NOT: Her göz damlası için yeni ve steril pipet ucu kullanın. Bu deney setinde, cno'nun bilateral göz damlaları yapıldı; ancak, daha düşük bir CNO konsantrasyonu gerekiyorsa, tek taraflı göz damlası da uygulanabilir. - Scruff ile fareimimimmobilize.
- Pipet ucunda kararlı bir damlacık oluşana kadar çözeltiyi yavaşça dışarı at.
- Çözelti teslim edilene kadar damlacık farenin gözünün korneasına dikkatlice yakınbir şekilde getirin. Pipet ucu asla farenin gözüne temas kurmamalıdır.
- Fareyi kendi kafesine geri yerleştirerek serbest bırakın.
- P10 mikropipet kullanarak, 1.0 mg CNO/ kg elde etmek için cno çözeltisinin gerekli miktarını (1-3 μL) yükleyin.
- Bu işlemi 5 gün boyunca her gün tekrarlayın.
NOT: Bu süre deneysel gereksinimlere göre ayarlanabilir. - Kontrol deneyleri için, sahte tedaviye tabi tutulan AAV/DREADD enjekte edilmiş fareler (sadece tuzlu çözelti içeren göz damlaları) ve açıklanan CNO göz damlası protokolüne maruz kalan boş bir vektör (örn. AAV/mCherry) enjekte edilen fareleri kullanın.
3. İçme suyu ile verilen kronik CNO tedavisi
- 50 mL (plastik) konik tüpler ve kauçuk stoper boruları kullanarak küçük şişeler olun; CNO stabilitesi üzerinde Herhangi bir ışık aracılı etkileri önlemek için alüminyum folyo ile kaplayın.
- CNO tedavisine başlamadan üç gün önce, farelerin onlara alışması için 10 mL düzenli su içeren küçük şişelerle normal su şişelerini değiştirin. Bant kullanarak şişeleri kafeslere sabitleyin.
- Her fare için günlük su tüketimini ölçün.
- Denemeye başlamadan önce her fareyi tartın.
- Klozapin-N-oksit (CNO, 5 mg) 1 mL içinde % 0.9 steril salin çözeltisi çözün. Stok çözeltisini 4 °C'de soğutun.
- 1.0 mg CNO/ kg (vücut ağırlığı) elde etmek için CNO çözeltisinin konsantrasyonunu tanımlamak için vücut ağırlığını ve tüketilen ortalama su miktarını kullanın.
NOT: Yetişkin erkek fareler (~20 g vücut ağırlığı) günde ~5 mL su tüketirler (Şekil2A). Bu nedenle, 1 mg CNO/ kg CNO konsantrasyonu elde etmek için, 6.4 μL CNO stok çözeltisi 8 mL su (son konsantrasyon: 4 μg CNO/ mL) son hacmine eklenmelidir. Böylece günde 5 mL su içen 20 g'lık bir hayvan için CNO dozu 1 mg CNO/ kg ile sonuçlanır. - Bir dizi konsantrasyonu test ederek minimum CNO konsantrasyonu ile maksimum etkinliği gösteren optimal CNO dozu belirleyin. İçme suyu yöntemi için optimal CNO dozu belirlemek için bir doz yanıt analizi gerçekleştirin.
NOT: Bu deney için aşağıdaki CNO dozları test edildi: 1.0 mg/ mL, 0.5 mg/ mL, 0.25 mg/ mL, 0.1 mg/ mL ve tuzlu. 1.0 mg CNO/ kg ilk olarak i.p. ve göz damlası protokollerine göre test edildi. - 1. günde, şişeyi 8 mL düzenli su ile doldurun ve gerekli miktarda CNO ekleyin.
NOT: Bu su miktarı yetişkin bir erkek fare için 24 saat reklam libitum su erişimi için yeterlidir. Diğer kemirgen türlerinin kullanılması durumunda, öncelikle gerekli hacmi belirlemek için günlük tüketilen su miktarını ölçün. - Su + CNO tüketiminin neden olduğu yan etkilerin olmamasını sağlamak için protokol boyunca hayvanların sağlığını izleyin.
- 24 saat sonra şişeleri tatlı su + CNO çözeltisi ile değiştirin. Bir önceki gün tüketilen hacmi kaydedin.
- Atık kaplarda tüketilmeyen su + CNO çözeltisini atın. Plastik şişeleri atın ve hayvan tesisi kurallarına göre dezenfekte ettikten sonra her gün kauçuk durdurucuları değiştirin.
NOT: Sulu atıkları organik çözücülerle karıştırmayın. Depolama ve teslim alma talimatları için Kimyasal İmha Servisi'ne başvurun. - Şişeleri 5 gün boyunca her gün aynı saatte değiştirin.
NOT: Bu süre deneysel gereksinimlere göre ayarlanabilir. - Adım 2.6'da açıklandığı gibi kontrol gruplarını ekleyin.
4. Farelerin sakaroz tercihini kullanarak kısıtlı CNO tedavisi
- CNO tedavisine başlamadan 3 gün önce, 10 mL su + %1 sakaroz içeren küçük bir şişeyi tercihen orijinal su şişesinden uzakta, kafese yerleştirin.
NOT: Adım 3.1'de açıklanan küçük şişeleri kullanın. - Aktif fazlarının son kısmında hayvanları suya + %1 sakaroza maruz bırakırlar (ZT 18 – 24). Bu pozlama sonra, kafesten su + sakaroz ile şişe çıkarın.
NOT: CNO teslimatının farklı zaman pencerelerini kullanılabilir. Ayrıca, fareler CNO teslimatını kolaylaştırmak için akşam saatlerinde ışığın başlangıcının meydana geldiği ters bir ışık/karanlık döngü altına yerleştirilebilir. - Her fare için günlük su + %1 sakaroz tüketimini ölçün.
- Denemeye başlamadan önce her fareyi tartın.
- Vücut ağırlığı ve su ortalama miktarı kullanın + 1% sakaroz tüketilen CNO çözeltisi dozu belirlemek için 1.0 mg CNO / kg (vücut ağırlığı).
NOT: Minimum CNO konsantrasyonu ile maksimum etkinliği gösteren optimal CNO dozu, adım 3.6'da açıklandığı gibi test edilmelidir. - 1. günde şişeleri 5 mL su + %1 sakaroz + CNO (1 mg CNO/ Kg) ile doldurun ve belirlenen zaman diliminde kafesin üzerine (her zaman aynı yerde) yerleştirin.
- Kısıtlı zaman penceresinin sonunda, şişeleri çıkarın ve tüketilen su + sakaroz + CNO miktarını ölçün.
NOT: Malzemeler ve çözümler daha önce adım 3.11'de açıklandığı gibi dezenfekte edilir veya atılır. - Bu işlemi 5 gün boyunca her gün tekrarlayın.
NOT: Bu süre deneysel gereksinimlere göre ayarlanabilir. - Adım 2.6'da açıklandığı gibi bir kontrol grubu ekleyin.
5. Veri analizi
- Perfuse fareler intrakardial ile 4% paraformaldehit (PFA) ya 2 veya 6 saat son tekrarlayan aldıktan sonra (5 gün) CNO göz damlası. CNO içme suyu ile teslim edildiğinde, farenin aktif fazSonunda CNO + su değiştirin, sonra 2 veya 6 saat sonra CNO erişim sonra fare perfuse.
NOT: Işık maruziyeti ilgi alanındaki c-Fos indüksiyonunu etkileyebilecekse, fareleri deneylerin son gününde ve perfüzyondan önce sürekli karanlıkta tutun. - Dikkatle beyin dışarı incelemek ve 9-12h için% 4 PFA çözeltisi batırın.
- PFA fiksasyon sonra, kriyoprotect beyin dokusu kullanarak 30% sakaroz çözeltisi (beyin batana kadar bekleyin), sonra bir kriyostat kullanarak beyin bölümü.
- Koronal beyin kesitlerini (35 μm) oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1x PBS, %10 büyükbaş serum albumin ve %0,3 Triton X-100 içeren bir solüsyonun içine aktarın.
- Beyin bölümlerini bir anti-c-Fos (1:2500) antikor çözeltisi ile gece boyunca 4 °C'de sürekli ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
- 1x PBS ve %0,3 Triton X-100 içeren bir çözelti ile her biri 5 dakika 3 yıkamadan sonra, numuneleri Alexa konjuge ikincil antikor (1:500) solüsyonu ile oda sıcaklığında ışıktan uzakta ve sürekli ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
- Konfokal mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edin. Yakalanan görüntüleri fotoğraf düzenleme ve analiz yazılımıyla (örneğin Adobe Photoshop) birleştirin ve işleyin.
- Veri analizi için, ImageJ yazılımını kullanarak AAV ile enfekte olan alanı (mCherry(+) hücreleri anahatve ölçün ve alan başına aktif hücre sayısını elde etmek için bu bölgedeki c-Fos(+) hücrelerinin sayısını ölçün. Hayvan başına 3 ayrı bölümden elde edilen sonuçları birleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Göz damlası kullanılarak tekrarlayan CNO doğumunun enfekte olan nöronların çoğunda (Şekil1C)c-Fos ekspresyonunun sağlam bir indüksiyonuna yol açtığını gözlemledik ve tekrarlayan maruziyet sırasında CNO doğumunun etkinliğinin devam ettiğini gösterdik. Ayrıca CNO tedavisinden 2 saat sonra toplanan örneklerde c-Fos'un önemli bir indüksiyonu gözlenirken, CNO maruziyetinden sonra 6 saat (Şekil1D-E)alınan örneklere göre CNO tarafından indüklenen değişikliklerin zamana bağlı olduğu görüldü.
Daha sonra içme suyu ile yapılan kronik CNO tedavisinin etkinliğini ölçtük. Günlük su + CNO tüketiminin tüketilen toplam su hacmine göre anlamlı olarak farklı olmadığını gözlemledik (Şekil2A). Benzer şekilde, gece boyunca tüketilen su + %1 sakaroz miktarı (6 saat zaman penceresi) CNO eklenmesinden etkilenmemiştir (Şekil2B). Ayrıca deney boyunca tüm hayvanlar için su + CNO (Şekil 2C)ve su + sakkaroz + CNO (Şekil2D)günlük tüketiminde (5 gün) farklılık saptanmamada bulunmuştur.
CNO göz damlası kullanılarak bulduğumuza benzer şekilde, CNO erişiminde 2 saat değil, 6 saat sonra c-Fos'un sağlam indüksiyonu gözlendi (Şekil 2E-F).
Son olarak, cno içme suyuna eklenen doz yanıtı ölçüldü. Bunun için fareler aşağıdaki CNO dozlarına maruz kaldılar: 1.0 mg/ mL, 0.5 mg/ mL, 0.25 mg/ mL, 0.1 mg/ mL, tuzlu. Her durumda, hayvanlar CNO maruz kaldıktan sonra 2 saat perfüzyon edildi. Düşük CNO dozu (0.1 mg/ mL) saline kontrolüne göre c-Fos aktivasyonu oluşturmazken, daha yüksek dozlarda (0.25 mg/ mL, 0.5 mg/mL ve 1.0 mg/ mL) indüklenen sağlam ve benzeri c-Fos indüksiyonu ( Şekil 2G).
Şekil 1: Göz damlası kullanılarak tekrarlayan CNO doğumu. (A) AAV/hM3Dq-mCherry yetişkin (3 aylık) erkek farelerin hipokampusuna stereotaksik olarak enjekte edildi. (B) Enjeksiyondan dört hafta sonra, CNO günde bir kez 5 gün üst üste göz damlası kullanılarak uygulandı. 1.0 mg CNO/ kg doz kullanıldı. (C) Son olarak, fareler kurban edildi ve beyin dokusu AAV enfekte bölgede c-Fos (yeşil) immünreaktivite için test edildi (mCherry-pozitif hücreler, kırmızı). Enjeksiyon bölgesinin temsili koronal bölümü ve CNO aracılı c-Fos aktivasyonu gösterilmiştir. (D) Son CNO uygulamasından sonra perfüze olan farelerde AAV enfekte bölgedeki c-Fos pozitif hücrelerin intibak sayısı ölçüldü. Veriler ortalama ± SEM. ***p < 0.001 ; Öğrencinin t-testi (n = 2-3 fareler) tarafından. (E) İki grubun temsili görüntüleri gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İçme suyu ile verilen kronik CNO tedavisi. (A) Kontrol (su) veya arıtılmış (su + CNO, doz: 1.0 mg CNO/ kg) hayvanlar arasında toplam sıvı tüketiminde herhangi bir fark gözlenmemiştir. Veriler ortalama ± SEM 'dir (n = 13-14 fareler). (B) Benzer şekilde, CNO (1.0 mg/ Kg) eklendikten sonra tüketilen su + % 1 sakaroz hacminde (6 saat zaman diliminde) anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Veriler ortalama ± SEM (n = 5 fare). (C) Tek tek fareler için günlük su + CNO (1.0 mg/kg) tüketimi gösterilir. Günlük tüketimde herhangi bir farklılık gözlenmedi. Veriler ortalama ± SEM (n = 5 fare). (D) Tek tek fareler için günlük sıvı tüketimi (6 saat zaman diliminde) %1 sakaroz + CNO (1.0 mg/kg) gösterilir. Günlük tüketimde herhangi bir farklılık gözlenmedi. Veriler ortalama ± SEM (n = 3 fare). (E) Son CNO uygulamasından 2 veya 6 saat sonra fareler kurban edildi ve AAV enfekte bölgede c-Fos pozitif hücrelerin sayısı ölçüldü. Veriler ortalama ± SEM. ***p < 0.001 ; Öğrencinin t-testine göre (n = 5 fare). (F) Beyin koronal kesitleri AAV enfekte (mCherry-pozitif hücreler, kırmızı) bölgesinde c-Fos (yeşil) immünoreaktivitesi açısından test edildi. Temsili görüntüler gösterilir. (G) Dört CNO dozu uygulandı (0.1, 0.25, 0.5, ve 1.0 mg CNO/ kg) ve c-Fos indüksiyonu ölçüldü. Veriler ortalama ± SEM. ***p < 0.001 ; ANOVA tarafından takip edilen Tukey testi (n = 2 fareler). Ölçek çubuğu: 100 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DREADDs uzaktan nöronal aktivite17işlemek için popüler ve etkili bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. CNO teslimatı için alternatif stratejilerin tasarımı, belirli deneysel ayarlar için mevcut seçeneklerin yelpazesini geniş ölçüde artıracaktır. Buna ek olarak, CNO teslimi için non-invaziv stratejiler doğrudan hayvan Sağlığını etkileyebilir yan etkileri azaltarak sonuçların herhangi bir potansiyel yanlış yorumlanmasını en aza indirmek. Burada, CNO teslimatı için DREADD'lerin (hM3Dq) sağlam bir aktivasyonu sağlayan ve geniş bir olanak yelpazesi sunan iki non-invaziv stratejiyi tanımladık. Ayrıca, burada açıklanan protokollerin, genetik olarak tasarlanmış muskasinik veya opioid reseptörleri de dahil olmak üzere nöronal manipülasyon için farklı DREADD varyantları için de yararlı olabileceğine inanıyoruz.
Tekrarlayan göz damlaları kullanılarak CNO doğum tam dozaj ve CNO doğum zamanlaması kontrol etmek için güç korurken tekrarlayan intraperitoneal CNO enjeksiyonları için ağrısız bir alternatif temsil eder. Bu nedenle, yinelenen DREADD etkinleştirme gerektiğinde bu protokolü kullanmanızı öneririz. Göz damlaları da CNO teslimat için en ucuz seçenek, özellikle CNO kullanarak protokol ile karşılaştırıldığında içme suyuna ekledi. CNO içme suyu ile teslim, diğer taraftan, herhangi bir fare kullanımı kaçınarak, DREADDS kronik ve sürekli aktivasyon confers. Bu protokolün CNO teslimatının zamanlaması üzerinde kesin kontrolden yoksun olduğunu belirtmek önemlidir. CNO içeren bir sakaroz çözümüne zaman kısıtlamalı üçüncü bir alternatif, zaman kısıtlamalı erişim, daha önce tartışılan her iki protokolün avantajlarını birleştirir. Bu strateji aynı zamanda non-invaziv, tekrarlayan ve gerçekleştirmek kolaydır. Ayrıca, CNO ile suya 24 saat erişim ile karşılaştırıldığında CNO teslimat zamanlaması daha iyi bir kontrol sunuyor. Bu yaklaşımın bir uyarı sadece hayvanların aktif aşamasında kullanılabilir olmasıdır. CNO tüketimi ve dolayısıyla DREADD aktivasyonu hakkında kesin zamansal bilgi edinmek için kızılötesi kameralar veya yalama-o-metre sistemi ile birlikte içme suyunda CNO içeren her iki stratejiyi de kullanmanızı öneririz.
CNO'nun içme suyu yoluyla sağladığı uzun süreli etkiler daha önce bildirilmiştir. Ruh hali kontrolünde yer alan talamo-kortikal devrenin tonik aktivasyonunun davranışsal sonuçlarını değerlendirmek için 14 gün 15 art arda kronik CNO (5 μg/ mL) tedavisini başarıyla uyguladık. Alternatif olarak, 40 mg/L konsantrasyonda içme suyunda sağlanan CNO, dorsal raphe çekirdeğinin serotonerjik nöronlarının aktivitesini kronik olarak modüle etmek için kullanılmıştır18, oysa pankreas β-hücrelerinin fonksiyonu CNO kullanılarak kontrol edilirdi 0.25 mg/mL su konsantrasyonunda19. Kombine, bu sonuçlar farklı CNO konsantrasyonları etkili DREADDs kontrol etmek için ayarlanabilir öneririz. Burada, cno farklı dozlarda içme suyu benzer c-Fos aktivasyonu ortaya ekledi bulundu, gerekli en düşük ve etkili CNO dozu tanımlamak için bir doz-yanıt analizi yapılması gerektiğini düşündüren. Son çalışmalar, CNO'nun tamamen farmakolojik olarak inert olmadığını göstermiştir20; buna ek olarak, aynı zamanda DREADDs in vivo aktivasyonu CNO metabolit klozapin aracılık olduğu gösterilmiştir, hangi birkaç endojen hedefleri vardır21. Bu nedenle, yazarlar klozapin subthreshold dozlarda kullanarak öneririz, yerine yüksek CNO dozları. Tanımlanan yöntemlerde klozapinetkinliğini değerlendirmemiş olsak da, nöronal aktivasyonu önemli ölçüde azaltmadan CNO konsantrasyonunun azaltılabileceğini ve bu nedenle CNO-to-klozapinin neden olduğu yan etkileri en aza indirebileceğimizi bulduk. Dönüştürme.
Özetle, burada sunulan stratejiler, çeşitli deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilen CNO teslimatı için potansiyel şemaları temsil etmektedir. Onlar DREADD kontrollü nöronların tekrarlayan veya kronik CNO aracılı aktivasyonu için yararlı olabilir non-invaziv stratejiler olarak tasarlandı, hayvan davranışı üzerinde CNO doğum etkisini azaltarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü 'ndeki intramural araştırma programı (ZIA MH002964-02) tarafından desteklenmiştir. Biz NIMH IRP Kemirgen Davranış Çekirdek (ZIC MH002952) desteğine teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma life science | #A2153-100G | Lyophilized powder ≥96% (agarose gel electrophoresis) |
| C57BL/6J mice | The Jackson laboratory | #000664 | male mice, 3 months old |
| Capillaries | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Outer diameter: 1.14 inch |
| Clozapine-N-oxide | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isoflurane, USP |
| Microinjector III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector |
| Mounting media | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | #15710 | 16% aqueous solution (methanol free), 10 mL |
| Primary c-Fos Antibody | Cell signaling technology | #2250S | c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100µL) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vector Core | Titer: ~3x10e12 vg/mL | |
| Secondary Antibody | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Donkey anti-rabbit IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
References
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of depression. Neuropsychopharmacology. 1, (2018).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Review Silencing Neurons: Tools, Applications, and Experimental Constraints. , (2017).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic Tools with Therapeutic Utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55 (1), 399-417 (2015).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Donato, F., Jacobsen, R. I., Moser, M. -B., Moser, E. I. Stellate cells drive maturation of the entorhinal-hippocampal circuit. Science. 355 (6330), (2017).
- Mahler, S. V., et al. Designer receptors show role for ventral pallidum input to ventral tegmental area in cocaine seeking. Nature Neuroscience. 17 (4), 577-585 (2014).
- Lichtenberg, N. T., et al. Basolateral Amygdala to Orbitofrontal Cortex Projections Enable Cue-Triggered Reward Expectations. The Journal of Neuroscience. 37 (35), 8374-8384 (2017).
- Schotman, P., Reith, M. E. A., Gispen, W. H. Effects of stressful procedures as ether anesthesia and intracranial injections on amino acid incorporation into brain protein. Brain Research Bulletin. , (1977).
- Frumberg, D. B., Fernando, M. S., Lee, D. E., Biegon, A., Schiffer, W. K. Metabolic and behavioral deficits following a routine surgical procedure in rats. Brain Research. , (2007).
- Keenan, W. T., Fernandez, D. C., Shumway, L. J., Zhao, H., Hattar, S. Eye-Drops for Activation of DREADDs. Frontiers in Neural Circuits. 11, 93 (2017).
- LeGates, T. A., Altimus, C. M. Measuring circadian and acute light responses in mice using wheel running activity. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Bainier, C., Mateo, M., Felder-Schmittbuhl, M. -P., Mendoza, J. Circadian rhythms of hedonic drinking behavior in mice. Neuroscience. 349, 229-238 (2017).
- Fernandez, D. C., et al. Light Affects Mood and Learning through Distinct Retina-Brain Pathways. Cell. 175 (1), 71-84 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin’s The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2019).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Urban, D. J., et al. Elucidation of The Behavioral Program and Neuronal Network Encoded by Dorsal Raphe Serotonergic Neurons. Neuropsychopharmacology official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 41 (5), 1404-1415 (2016).
- Jain, S., Ruiz De Azua, I., Lu, H., White, M. F., Guettier, J. -M., Wess, J. Chronic activation of a designer G q-coupled receptor improves β cell function. The Journal of Clinical Investigation. 123, (2013).
- MacLaren, D. A. A., et al. Clozapine N-Oxide Administration Produces Behavioral Effects in Long-Evans Rats: Implications for Designing DREADD Experiments. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
