Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Fysiologisch, worden odorant receptoren geactiveerd door odorant moleculen in de fase van de damp ingeademd. Echter, meest in vitro systemen gebruiken vloeibare fase odorant stimulatie. Hier presenteren we een methode waarmee in vitro bewaking in real-time van odorant receptor activering op odorant stimulatie in damp fase.

Abstract

Olfactorische waarneming begint met de interactie van odorant met odorant receptoren (of) uitgedrukt door olfactorische sensorische neuronen (OSN). Geur erkenning volgt een combinatorische coderingsschema dat, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van odorant en één odorant kan het activeren van een combinatie van ultraperifere regio's. Door dergelijke combinatorische codering, kunnen organismen detecteren en onderscheid maken tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen. Dus, een geur met een bepaalde concentratie kan worden beschreven door een patroon voor activering van ultraperifere regio's, die specifiek is voor elke geur. In die zin, het kraken van de mechanismen die de hersenen gebruikt voor het waarnemen van geur vereist het begrip odorant-OR interacties. Dit is de reden waarom de reukzin Gemeenschap streeft naar "--orphanize" deze receptoren. Conventionele in vitro systemen gebruikt voor het identificeren van odorant- of interacties drachtige cel media met odorant, hebben gebruikt die verschilt van de natuurlijke detectie van geuren via damp odorant ontbinding in nasale mucosa voor interactie met ORs. Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van OR activering via damp-fase odorant. Onze methode is afhankelijk van de cAMP release door luminescentie met behulp van de bepaling van de Glosensor meten. Het huidige verschillen tussen de in vivo en in vitro benaderingen overbrugt en vormt de basis voor een biomimetische vluchtige chemische sensor.

Introduction

De betekenis van geur kunt landdieren om te interageren met hun vluchtige chemische omgeving station gedrag en emoties. Fundamenteel, is het detectieproces geur begint met de allereerste interactie van odorant moleculen met de olfactorische systeem, op het niveau van odorant receptoren (ORs)1. ORs worden individueel zoogdieren uitgedrukt in olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel2. Zij behoren tot de familie van de G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en precies te zijn naar de subgroep van rodopsine-achtige (ook wel klasse A). ORs paar met de stimulerend G eiwit Golf wiens Activering tot cAMP productie leidt, gevolgd door de opening van cyclische nucleotide gated kanalen en de generatie van de actie potentieel. Het is geaccepteerd dat een geur percept is afhankelijk van een specifiek patroon van geactiveerde ORs3,4 en geur erkenning een combinatorische coderingsschema dat volgt, waar een OR kan worden geactiveerd door een reeks van reukstoffen en één odorant kunt activeren een combinatie van ultraperifere regio's. En door middel van dergelijke combinatorische codering, het is gepostuleerd dat organismen kunnen detecteren en onderscheid tussen een groot aantal vluchtige geur moleculen maken. Een van de sleutels tot het inzicht hoe geuren worden waargenomen is te begrijpen hoe en die ultraperifere regio's worden geactiveerd door een bepaalde geur.

In een poging om het verhelderen van odorant- of interacties, in vitro functionele testen een essentiële rol hebben gespeeld. De identificatie van de agonist geurige liganden voor wees ORs (OR ambtshalve orphanization) is een zeer actief gebied geweest voor de afgelopen twintig jaar, door het gebruik van diverse in vitro, ex vivo en in vivo Functionele assays5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In-vitro-assay systemen zijn zeer geschikt voor de gedetailleerde functionele karakterisering van ultraperifere regio's, met inbegrip van identificatie van de functionele domeinen en kritische residuen van ultraperifere regio's, evenals mogelijke waterbouwkundige toepassingen. Ontwikkeling van waardevolle in vitro systemen voor ultraperifere regio's is echter verder een uitdaging, gedeeltelijk als gevolg van problemen met kweken OSNs en functionele expressie van ultraperifere regio's in heterologe cellen geweest. De eerste uitdaging was geweest om de protocollen die voor de cel-oppervlakte expressie van functionele ultraperifere regio's in de toewijzing van odorant toegestaan-OR interacties. Een aantal onafhankelijke groepen hebben gebruikt verschillende benaderingen5,6,7,8,9,10,11,12, 14,,18,19,20. Een van de vroegste successen geboekt door Krautwurst et al. gelabeld in de N-terminus van ultraperifere regio's met een verkorte opeenvolging van rodopsine (Rho-tag) en een verbeterde oppervlakte expressie in menselijke embryonale nier (HEK) cellen13waargenomen. Voor de tag gekoppeld aan de volgorde van de OR aangebrachte wijzigingen is nog steeds een pad onderzocht voor het verbeteren van de OR expressie en functionaliteit19,-21. Saito et al.. dan vervoer van receptor eiwitten 1 (RTP1) geïdentificeerd en RTP2 die vergemakkelijken OR mensenhandel. 22 een kortere versie van RTP1, genaamd RTP1S, is ook aangetoond dat zelfs effectiever dan de oorspronkelijke eiwit23. De ontwikkeling van een cellijn (Hana3A) die stabiel Golf uitdrukt, REEP1 en RTP1, RTP2 24, in combinatie met het gebruik van cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) verslaggevers identificatie van odorant heeft ingeschakeld-OR interacties. Het mechanisme waarmee de RTP-familie van eiwitten cel oppervlakte expressie van ultraperifere regio's bevordert moet nog worden bepaald.

Een waarschuwing voor deze gevestigde methoden is dat ze op de stimulatie van de odorant in vloeibare fase vertrouwen, wat betekent dat odorant vooraf in een medium stimulatie opgelost zijn en cellen stimuleren door vervanging van het medium. Dit is zeer verschillend van de fysiologische omstandigheden waar odorant moleculen de olfactorische epitheel in damp fase bereiken en activeren van ORs door ontbinding in de nasale mucosa. Als u wilt meer sterk gelijken op fysiologisch relevante stimulans blootstelling, Sanz et al.20 voorgesteld een bepaling op basis van damp stimulatie door toepassing van een daling van odorant oplossing om op te hangen onder de binnenzijde van een plastic folie geplaatst op de top van cel wells. Zij de calcium antwoorden opgenomen door controle van de intensiteit van de fluorescentie. Deze methode was de eerste die lucht-fase odorant stimulatie, maar deed het niet toestaan dat een grote screening van OR activering.

Hier, ontwikkelden we een nieuwe methode waarmee real-time bewaking van in vitro OR activering via damp fase odorant stimulatie door de bepaling van de Glosensor (Figuur 1). Deze bepaling heeft eerder is gebruikt in het kader van vloeibare odorant stimulatie18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. de controle kamer van de luminometer is eerste geëquilibreerd met gevaporiseerde odorant vóór plaat lezen(Figuur 1). Odorant moleculen zijn dan solvated in de buffer, Baden van Hana3A cellen, uiting geven aan de OR van belang, RTP1S en de Glosensor eiwitten (Figuur 1B). Als de odorant een agonist van de UPR's is, zal de OR overschakelen naar een geactiveerde bevleesdheid en binden de Golf, activeren de adenylyl cyclase (AC) en uiteindelijk leiden tot cAMP niveaus te stijgen. Dit stijgende kamp zal binden aan en activeer het eiwit Glosensor voor het genereren van luminescentie luciferine katalyseren. Deze luminescentie wordt vervolgens geregistreerd door de luminometer en kan OR activering. Deze methode is van groot belang in het kader van OR deorphanization, zoals het in vitro systemen dichter bij de natuurlijke waarneming van geuren brengt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hana3A cellen cultuur

  1. Bereiden M10 (Minimum essentiële Medium (MEM) plus 10% v/v foetale runderserum (FBS)) en M10PSF (M10 plus 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B).
  2. Cultuur van de cellen in 10 mL van de M10PSF in een 100 mm cel cultuur schotel in een incubator vastgesteld op 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2).
  3. Verdeel de cellen om de 2 dagen op een 20%-verhouding: bij 100% samenvloeiing van cellen (ongeveer 1.1 x 107 cellen) wordt waargenomen onder een Microscoop fase contrast, streven de media en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. PBS gecombineerd en voeg 3 mL 0,05% trypsine-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA, 0,48 mM). Laten treden voor ongeveer 1 minuut, totdat de cellen van de plaat distantiëren.
  5. Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens.
  6. Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.
  7. Breng 1 mL van de oplossing van de geresuspendeerde cellen in een nieuwe cel cultuur schotel van 100 mm en voeg 9 mL verse M10PSF. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.

2. voorbereiding van de cellen van de Transfectie

  1. Evalueren de samenvloeiing, of het aantal cellen, door het observeren van hen onder een Microscoop fase contrast. Ten minste 10% samenvloeiing (ongeveer 1.1 x 106 cellen) is nodig voor een plaat.
  2. De media gecombineerd en wassen van de cellen zachtjes met 10 mL PBS. PBS gecombineerd en voeg 3 mL EDTA. Laten treden voor ongeveer 1 minuut bij kamertemperatuur, totdat de cellen van de plaat distantiëren.
  3. Voeg 5 mL M10 inactivering van de trypsine en uiteindelijk het loskoppelen van de cellen nog steeds gekoppeld aan de plaat op en neer waarbij eveneens. Het volume (8 mL) overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
  4. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 5 mL van M10PSF door pipetteren omhoog en omlaag om een willekeurige cel massa te doorbreken. Vermijd het creëren van bubbels in de buis.
  5. Afhankelijk van het aantal platen om te zijn transfected, overdracht van een passend bedrag van cellen in een reservoir met de juiste bijbehorende volume van M10PSF. Een 96-wells-plaat moet worden bedekt met 1/10 van een 100% confluente 100 mm schotel (ongeveer 1.1 x 106 cellen) verdund in M10PSF tot een totaal volume van 6 mL. Voeg voor een 96-wells-plaat beginnen met een schotel van 100% samenvloeiing 100 mm, 500 µL van de 5 mL geresuspendeerde cellen tot 5,5 mL van verse M10PSF. Meng de cellen en M10PSF zonder dat er luchtbellen.
  6. Pipeteer 50 µL van de zwevende cellen in elk putje van de 96-wells-plaat met een meerkanaalspipet. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO2.

3. plasmide transfectie

  1. Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 30% en 50%.
  2. Bereiden van een eerste transfectie mix waarin de plasmiden gemeenschappelijk aan de gehele plaat (RTP1S, of en Glosensor eiwit, Zie Tabel van materialen) na de volumes in tabel 1. Merk op dat de hoeveelheid Rho-gelabeld OR moet worden gedeeld door het aantal ORs als verschillende ORs.
    Opmerking: We sterk advies een lege vector negatieve controle (hier Rho-pCI) en een positieve controle (OR bekend om te reageren op de geteste odorant) toevoegen aan het experiment-plan.
  3. Een tweede transfectie mix met 500 µL van MEM en 20 µL van het Lipofectamine 2000 reagens te bereiden (geldig voor een 96-wells-plaat, Zie Tabel van materialen). De tweede mix toevoegen aan de eerste, en zachtjes Meng door omhoog en omlaag pipetteren en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 5 mL M10 en meng voorzichtig.
  4. De M10PSF in de eerder vernikkeld 96-wells-plaat vervangen door 50 µL van de definitieve transfectie media. Incubeer in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2 en vacuüm van de kamer van de luminometer overnachting volgende de procedure zoals in stap 6 beschreven.

4. substraat incubatie

  1. Observeer de 96-wells-plaat onder een Microscoop fase contrast te verzekeren van een cel samenloop tussen 60% en 100%. Bereid de oplossing van een stimulatie van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) met 10 mM voor hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 5 mM van D-glucose.
  2. Verdun 75 µL van het kamp reagens (Zie tabel van materialen) -oplossing tot 2.75 / mL van de oplossing van de stimulatie. Verwijder het medium van de transfectie van de 96-wells-plaat en wassen van de cellen door 50 µL van vers stimulatie oplossing toe te voegen aan elk putje.
  3. Verwijder de stimulatie-oplossing en voeg 25 µL van cAMP reagens oplossing bereid in stap 4.2 aan elk putje. Incubeer de 96-wells-plaat bij kamertemperatuur in een donkere en geur-vrije omgeving (bijvoorbeeld een schone lege lade ver weg tegen chemicaliën of odorant) voor 2 h.

5. Odorant stimulatie

  1. Eerst, equilibreer de luminometer kamer met vluchtige odorant moleculen. Verdun de odorant aan de gewenste concentratie in 10 mL minerale olie(Figuur 2). Vóór het eind van de incubatietijd cAMP reagens, voeg toe 25 µL van de odorant oplossing in een nieuwe 96-wells-plaat (niet de ene met de cellen). Incubeer deze odorant plaat bij kamertemperatuur in de zaal van de luminometer voor 5 min (Figuur 2B) (geen luminometer opname is hier vereist).
  2. Instellen van de luminometer om vast te leggen van de luminescentie met 0 s van vertraging tijdens 20 cycli van plaat meting van 90 s met 0,7 s van het interval tussen de cycli.
  3. Vlak voor het lezen van de plaat, de odorant plaat uit de zaal te verwijderen. Voeg 25 µL van odorant tussen de putjes van de 96-wells-plaat met de cellen (de odorant niet toevoegen in de putjes met de cellen) en snel beginnen met het meten van de luminescentie van alle putjes voor 20 cycli binnen 30 min (Figuur 2C).

6. verwijdering van de resterende odorant binnen de Luminometer

  1. Open het deurtje van de luminometer. Plaats de buis verbonden met de vacuümpomp.
  2. Vacuüm odorant in de lezing kamer uitgebreid (ten minste 2 uur, bij voorkeur 's nachts) tussen twee odorant aan het voorkomen van kruisbesmetting van vluchtige stoffen de geur van een experiment naar de andere. Vervangen door frisse lucht door het sturen van perslucht gedurende 5 min voordat de volgende odorant aan het broeden.

7. de gegevensanalyse

  1. Exporteer de gegevens uit de luminometer-software.
  2. Het gemiddelde van de duplo's van hetzelfde of voor elke opnametijd. Bereken de genormaliseerde OR reactie aan een eventuele besturingselement (bijvoorbeeld lege vector, Figuur 3A en representatieve resultaten sectie) door het verdelen van de waarde van het besturingselement gemiddeld of gemiddeld waarde op elk tijdstip van de opname (Figuur 3B en representatieve resultaten sectie).
  3. Normaliseren de elke OR-reactie op hun basale activiteit door het verdelen van de gemiddelde reactie van de OR bij 0 s tot elke opname tijd reactie (Zie Figuur 3C en representatieve resultaten sectie).
  4. Bereken de oppervlakte onder de curve van elke of het verkrijgen van een interne OR-responswaarde. Om dit te doen, som van alle waarden van de luminescentie van elke opnametijd voor elke OR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wij onderzocht de reactie van drie muis ORs, Olfr746, Olfr124 en Olfr1093 met behulp van cinnamaldehyde damp stimulatie (Figuur 3). Gelijktijdig, gebruikten we een lege vectorbestrijding (Rho-pCI) om te verzekeren dat de activiteiten van odorant-geïnduceerde van de geteste ultraperifere regio's specifieke (Figuur 3A). De real-time activering van de ultraperifere regio's op damp odorant stimulans was gecontroleerde meer dan 20 meting cycli. De gegevens voor elk waren goed eerst genormaliseerd naar de lege vector gemiddeld controlewaarde voor elke cyclus (Figuur 3B). Het is belangrijk op te merken dat ORs variabele niveaus van basale activiteit in deze test in een OR-afhankelijke manier weergeven kunnen en het kan belangrijk zijn om te normaliseren ook hun reactie op deze parameter (Figuur 3C). De gemiddelde waarde van een OR kan worden verdeeld door haar reactie op t = 0 s, waardoor te vergelijken tussen de ultraperifere regio's. Interne activering waarden voor elke OR kunnen ook worden berekend door het berekenen van het gebied onder de curve (AUC) voor elk of door optelling van alle meetwaarden (Figuur 3D) cyclus.

Bovendien, kunnen dosis-afhankelijke reacties worden gemeten met behulp van deze methode met behulp van toenemende odorant doses. Presenteren we de reactie van Olfr1377 op Acetofenon stimulatie opgenomen volgens dezelfde procedure (Figuur 4). Acetofenon volatiliteit kan worden geëvalueerd door de dampdruk, die gelijk is aan 0.44 mm Hg bij 25 ° C. Bij een gegeven temperatuur is een odorant bezitten een hogere dampdruk volatieler dan een odorant met een lagere druk van de damp. Acetofenon wordt bijgevolg een matig vluchtige odorant en is blootgesteld aan de cel zuiver en verdunde op 10-2, 10-4, 10-6 en 10-8. Alleen de drie hogere concentraties (puur, 10-2 en 10-4) zijn in staat om te activeren Olfr1377 (Figuur 4A). Ook kunnen we merken dat de zuivere samengestelde stimulatie een neiging tot het verlagen van het OR-antwoord periode, waarschijnlijk als gevolg van de toxiciteit van de cel, toont zoals is gebleken voor eugenol in een recente publicatie32. Toch kunnen we zien een typische dosis afhankelijkheid gedrag van Olfr1377 (Figuur 4B), waaruit blijkt dat deze methode kan ook worden gebruikt om te bepalen van de EC50 of vluchtige stoffen.

Merk op dat wanneer dosisafhankelijk experimenten worden uitgevoerd, wij doen niet vacuüm schoon de kamer luminometer. Echter worden experimenten altijd uitgevoerd van laag tot hoog, toenemende odorant doses tot een minimum beperken van verontreinigingen. Verder, aangezien de echte concentratie van odorant moleculen in de cel media niet bekend is, de EC50s volgens deze methode verkregen zijn niet noodzakelijkerwijs vergelijkbaar zijn met die verkregen door vloeibaar stimulatie. De EC50-waarden bepaald door onze methode rekening worden gehouden met de volatiliteit van de odorant, de kinetiek van odorant ontbinding in het medium, de odorant de oplosbaarheid en de verwantschap tussen de odorant en de UPR's, die zijn dichter bij het natuurlijke perceptie van geur. Voor onze voorbeeld van Olfr1377 stimulatie door Acetofenon is de EC50-waarde uit onze damp dosis-respons 161 µM (0.001874%), die ongeveer 50 vouwen hoger dan de vloeibare stimulatie (3,28 µM van Saito et al.6). Dit verschil tussen vloeistof en damp stimulaties werd ook gemeld door Sanz et al.20 in hun damp stimulatie assay waar damp stimulatie gaf 100 tot en met 1000 vouwen lagere EC50-waarden dan de vloeibare stimulatie.

Figure 1
Figuur 1 : Beginsel van real-time bewaking van odorant receptor activering door vapored odorant. (A) de 96-wells-plaat werd geplaatst in de reeds geëquilibreerd met geur (violet cloud) luminometer kamer. (B) verdampt odorant moleculen (Violette) op het oppervlak van de media van de cel buffer opgelost in het bereiken van de OR-Holte, aan het oppervlak van de celmembraan Hana3A. De accessoire eiwit RTP1S (grijze) was zo goed, transfected om de gunst van de cel-oppervlakte expressie van de UPR's. Als de molecule odorant een OR-agonist was, de UPR's overgeschakeld naar een geactiveerd staat en afhankelijk van de G-olf, triggering de activering van adenylyl cyclase (AC) en de productie van cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT (cAMP; groen). Het Glosensor eiwit (luciferase) bezit een bindende site voor kamp waarmee, eenmaal gebonden, het eiwit te binden de ligand, de luciferine (geel). Het laatste complex Glosensor eiwit/luciferine/kamp geproduceerd de luminescentie die werd opgenomen voor het controleren van de activering van de OR. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Schematische protocollen voor real-time bewaking van odorant receptor activering door vapored odorant. De odorant (violet) was verdund op de gewenste concentratie in minerale olie (A). De oplossing werd vervolgens verguld in een nieuwe 96-wells-plaat, die in de zaal van de luminometer gedurende 5 minuten aan het volume met vapored odorant equilibreer voordat de transfected 96-wells-plaat (B) toezicht werd geplaatst. De oplossing van odorant was afgepipetteerde in elke ruimte tussen de putjes van de transfected 96-wells-plaat (Zie zoom). De plaat werd dan lezen voor 20 cycli in de luminometer zaal geëquilibreerd damp odorant (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Voorbeeld van een normalisatie die kan worden uitgevoerd na gegevensregistratie. (A) een lege vector (negatief) controle werd opgenomen in het plan van de Transfectie te kunnen identificeren alle mogelijke niet-OR specifieke geur activeringen van cellen. Het verstrekt ook informatie over de luminescentie van de achtergrond van de plaat. (B) Each of reactie was dan genormaliseerd door het verdelen van de emissiewaarde van elk putje met de gemiddelde waarde van het besturingselement vector in elke plaat. De waarden van de luminescentie van elke OR waren dan gemiddeld langs de cycli van de meting. (C) of reacties kunnen dan ook worden genormaliseerd naar hun basale activiteit verder elke cyclus door waarde te delen door de gemiddelde waarde van de 1st -cyclus van meting (t = 0 s). (D) de AUC kan worden berekend door optelling van de emissiewaarden voor elke meting-cyclus. Voor de B, C en D, foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM, n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Voorbeeld van een dosis afhankelijke reacties verkregen met de methode. (A) de reactie van Olfr1377 op Acetofenon werd opgenomen voor vijf verschillende verdunningen in minerale olie (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), en zonder odorant (0), en genormaliseerd na de normalisatie protocol afgebeeld in Figuur 3. (B) de gegevens tijdens de meting cycli werd vertaald in een AUC-waarde voor elke verdunning. Dit cijfer is gewijzigd van Kida et al.32. Dit cijfer is gelicentieerd onder een Creative Commons Naamsvermelding 4.0 internationaal (CC door 4.0). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM, n = 3). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Per 96-wells-plaat
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
OR 75 ng

Tabel 1: Mix voor Transfectie. Hoeveelheden van plasmiden (Glosensor eiwit, RTP1S en of) toe te voegen aan MEM te transfect aan een 96-wells-plaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De perceptie van geur is fundamenteel afhankelijk van de activering van ultraperifere regio's. Bijgevolg, begrip van hun functionaliteit is vereist voor spleet naar de complexe mechanismen waarmee de hersenen zijn vluchtige chemische omgeving waarnemen. Echter heeft het begrip van dit proces belemmerd door de moeilijkheden bij het vaststellen van een robuuste methode om het scherm van het repertoire van de OR voor functionaliteit tegen odorant in vitro. Cel oppervlak en heterologe expressie van ultraperifere regio's is gedeeltelijk opgelost door de oprichting van tagged receptoren13,19 en door de ontdekking en optimalisatie van het vervoer van receptor eiwitten (RTPs) uitgedrukt in OSNs22 , 23. de eerste screening studies toen verschenen, nieuwe inzichten te brengen aan ons begrip van de OR-functie zoals hun odorant erkenning patroon6,7,26,33, activering mechanisme34,35, theoretische driedimensionele structuur36,37, evolutie38,39, geur ruimte40,41, 42, en gevolgen van geur detectie43,44,45,46. Wij zijn van mening dat verbetering van de in vitro methoden het ontcijferen stimuleren kan van de codering van de geur. Zo ontwikkelden we hier een nieuwe functionele test zodat de controle van de OR activering door verdampte odorant moleculen.

Het succes van deze methode is afhankelijk van verschillende kritische stappen. Hoewel in de afgelopen jaren verbeterd, blijft heterologe expressie van sommige ultraperifere regio's moeilijk, die een invloed kunnen hebben op OR klantgerichtheid odorant. De uitdrukking van ultraperifere regio's bij de celmembraan kan worden geëvalueerd in een parallelle experiment met behulp van stroom cytometry19,24. Merk op dat lage niveaus van oppervlakte expressie nog steeds aanwezig robuuste reacties in heterologe cel systemen35 kunnen. Een ander belangrijk punt is om odorant verontreiniging te voorkomen. Gezien de gevoeligheid van deze test, kunnen odorant moleculen van parfum, voedsel, of vorige bepaling vervuilen het experiment door inducerende ongecontroleerde OR reacties. Dit is de reden waarom wij adviseren om het vacuüm van de kamer van de luminometer gedurende ten minste 2 uur, bij voorkeur 's nachts, alvorens een bepaling met een verschillende odorant uit te voeren. Het is ook belangrijk om te overwegen een potentiële cytotoxiciteit van de odorant gebruikt in het experiment. Een mogelijke daling van de reactie van de UPR's tijdens de controle op 30 min kan laten zien dat de odorant zelf een negatief effect op de gezondheid van de cel heeft. De cytotoxiciteit odorant kan worden geëvalueerd door het uitvoeren van een cel levensvatbaarheid assay na de cellen aan de odorant bloot. Om te verhelpen dit probleem, is het mogelijk dat alleen de eerste 10 min van de opnametijd voor de analyse van gegevens, het bijsnijden van het einde. We hebben gemerkt dat odorant toxiciteit voornamelijk optreedt wanneer de odorant wordt puur getest of bij zeer hoge concentraties. De gevoeligheid van onze test kan de detectie van odorant verdund in minerale olie. De optimale concentratie te verduidelijken met maximale respons varieert van één odorant naar de andere, maar we waargenomen dat een 1% verdunning is genoeg om te ontlokken een verzadiging van een OR reactie32. Echter sommige odorant moleculen kunnen bezitten lage dampdruk (en dus lage volatiliteit) en wellicht enkele aanpassingen moeten worden aangebracht in het voorgestelde protocol. De incubatietijd van de odorant in de luminometer zaal hier is ingesteld op 5 min. We ervan uitgegaan dat deze hoeveelheid tijd voldoende is om de kamer met de vluchtige moleculen odorant equilibreer, maar lage volatiliteit odorant langere incubatietijd tijden kunnen vereisen.

Afgezien van deze kritieke punten, deze methode brengt veel nieuwe mogelijkheden te verkennen van de structuur-functie relaties van odorant-OR interacties. De real-time controle aspect van deze methode staat ook voor het begrip van de kinetiek van gebeurtenissen die zich tijdens een perceptie van geur voordoen. Als voorbeeld, we gebruikten het protocol te verkennen van de functionaliteit van een metaboliet enzym, het carboxyl nte esterase 1d (Ces1d), moet worden uitgedrukt in de olfactorische mucosa van zoogdieren47gevonden. Dit enzym heet esters converteren naar carbonzuur en alcohol48. De co transfectie van Ces1d toonde een modulatie van in vitro OR reacties op ester verbindingen,32 aan te tonen dat dit nieuwe protocol efficiënt is in het verkennen van het belang van metabolische enzymen in odorant detectie. Bovendien, met behulp van dit platform om odorant mengsels, en de manier waarop geuren zijn gepresenteerd in de instellingen die meer natuurlijk zijn, te onderzoeken, kunnen toekomstige studie in het begrip van complexere odorant interacties. Ten slotte, detectie van odorant moleculen door ORs is ook van groot belang in de ontwikkeling van een geur-sensor. Deze methode is hebben aangetoond dat onze systeem odorant moleculen gepresenteerd in een fase van damp kan detecteren, een eerste stap in het ontwikkelingsproces van een verkleinde biosensor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y.F., H. K en H.M. een patent aanvraag ingediend relevant zijn voor dit werk op 27 oktober 2016.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van NIH (DC014423 en DC016224) en het Defense Advanced Research Project Agentschap RealNose-Project. YF bleef aan de Duke University met financiële steun van JSPS programma voor de bevordering van strategische internationale netwerken voor het versnellen van de omloop van getalenteerde onderzoekers (R2801). Wij danken Sahar Kaleem voor het bewerken van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 146 damp stimulatie odorant receptoren real-time activering odorant moleculen combinatorische code functionele test
Real-Time In Vitro Monitoring van Odorant Receptor activering door een Odorant in de damp-fase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter