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Neuroscience

En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Fisiológicamente, los receptores odorantes son activados por moléculas odorantes inhaladas en la fase de vapor. Sin embargo, más sistemas in vitro utilizan la estimulación olfativa de fase líquida. Aquí, presentamos un método que permite en tiempo real monitoreo in vitro de la activación del receptor odorante al estímulo odorante en fase de vapor.

Abstract

Percepción olfativa comienza con la interacción de olores con los receptores de olor (o) expresados por las neuronas sensoriales olfativas (OSN). Reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. A través de tal codificación combinatoria, organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Así, un olor a una concentración determinada puede ser descrito por un patrón de activación de las RUP, que es específica para cada olor. En ese sentido, se agrieta los mecanismos que el cerebro utiliza para percibir el olor requiere el olor comprensión-interacciones de OR. Por esta razón la comunidad de olfato se ha comprometido a "la orphanize" estos receptores. Sistemas in vitro convencionales usados para identificar el olor- o interacciones han utilizado incubación media de células con olor, que es distinta de la natural detección de olores mediante disolución de Odorantes de vapor en la mucosa nasal antes de interactuar con la SRO. Aquí, describimos un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR por olores fase de vapor. Nuestro método se basa en medir campo liberación por luminiscencia usando el análisis de Glosensor. Puentes actuales brechas entre los métodos in vivo e in vitro y proporciona una base para un sensor químico volátil biomiméticos.

Introduction

El sentido del olfato permite que los animales terrestres interactuar con su ambiente químico volátil para coche comportamientos y emociones. Fundamentalmente, el proceso de detección de olor comienza con la primera interacción de moléculas de olor con el sistema olfativo, en el nivel de odorante receptores (SRO)1. En los mamíferos, ORs individualmente se expresan en neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizadas en el epitelio olfatorio2. Pertenecen a la familia de receptores (GPCR) proteína G acoplada y más precisamente a la subfamilia rhodopsin-como (también llamado clase A). Pareja de SRO con el estimulante G proteínas Golf cuya activación conduce a campo producción seguido por la apertura de canales de nucleótido cíclico cerrado y la generación de potenciales de acción. Se acepta que el percept de un olor se basa en un patrón específico de ORs activado3,4 y por lo tanto reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. Y a través de tal codificación combinatoria, se postula que los organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Una de las claves para entender cómo se perciben los olores es entender cómo y que ORs son activados por un olor determinado.

En un intento de aclarar olor- o interacciones, ensayos funcionales in vitro han jugado un papel esencial. La identificación de ligandos los agonistas para el huérfano ORs (orphanization de OR) ha sido un campo muy activo durante los últimos veinte años, mediante el uso de vario in vitro, ex vivo e in vivo análisis funcional5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

Sistemas de ensayo in vitro son los más adecuados para la caracterización funcional detallada de ORs, incluyendo identificación de los dominios funcionales y residuos críticos de SRO, así como posibles usos de la ingeniería. Sin embargo, más desarrollo de valiosos sistemas in vitro para SRO ha sido un reto, en parte debido a la dificultad de cultivo OSNs y expresión funcional de las RUP en células heterólogas. El primer desafío había sido establecer protocolos que permitían la expresión superficial de la célula de SRO funcional en el mapeo de olor-interacciones de OR. Un número de grupos independientes ha utilizado varios enfoques5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Uno de los primeros logros fue hecha por Krautwurst et en la etiqueta el N-terminal de SRO con una secuencia acortada de la rodopsina (Rho-tag) y observó una mejor expresión superficial en células de riñón embrionario humano (HEK)13. Variaciones a la etiqueta colocada en la secuencia OR sigue siendo un camino explorado para mejorar OR expresión y funcionalidad de19,21. Saito et al.. identificado entonces transporte de receptores Proteína 1 (RTP1) y RTP2 que facilitan el tráfico de OR. 22 una versión reducida de RTP1, llamado RTP1S, también ha demostrado ser incluso más eficaz que la proteína original23. El desarrollo de una línea celular (Hana3A) que expresa estable Golf, REEP1 y RTP1, RTP2 24, juntada con el uso de reporteros de monofosfato de adenosina cíclico (campo) ha permitido la identificación de olor-interacciones de OR. El mecanismo por el cual la familia RTP de proteínas promueve la expresión superficial de la célula de ORs queda por determinarse.

Una advertencia de estos métodos establecidos es que cuentan con estímulo odorante en fase líquida, lo que significa que olores se disuelven previamente en un medio de estimulación y estimulan las células mediante la sustitución del medio. Esto es muy distinto de las condiciones fisiológicas donde odorante moléculas alcanzan el epitelio olfatorio en fase de vapor y activan ORs por disolución en la mucosa nasal. Para asemejan más exposición estímulo fisiológico relevantes, Sanz et al.20 propone un análisis basado en la estimulación de vapor aplicando una gota de solución de odorante para colgar debajo de la cara interior de una película plástica colocada en la parte superior de pozos de la célula. Grabaron las respuestas de calcio mediante el control de intensidad de fluorescencia. Este método fue el primero en utilizar la estimulación olfativa de fase de aire, pero que no permitió una proyección grande de la activación de la OR.

Aquí, hemos desarrollado un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR in vitro mediante la estimulación de odorante de fase de vapor por el análisis de Glosensor (figura 1). Este análisis se ha utilizado previamente en el contexto de olor líquido estimulación18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la cámara de vigilancia de luminómetro primero es equilibrada con aroma vaporizado antes de la placa (figura 1A) de lectura. Las moléculas de olor son entonces solvated en el búfer, bañando las células Hana3A expresan la o de interés, RTP1S y la Glosensor de proteínas (figura 1B). Si el olor es un agonista de la o, o cambiar a una conformación activa y enlazar la Golf, activación del cyclase del adenylyl (AC) y en última instancia causar los niveles de campo aumenten. Este campo creciente se unen y activan a la proteína de Glosensor para generar luminiscencia catalizando luciferin. Esta luminiscencia es luego registrado por el luminómetro y permite el seguimiento de la activación de OR. Este método es de gran interés en el contexto de deorphanization OR que trae sistemas in vitro más cercano a la percepción natural de los olores.

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Protocol

1. Hana3A las células de cultura

  1. Preparar M10 (medio esencial mínimo (MEM) más 10% v/v suero fetal bovino (FBS)) y M10PSF (M10 más 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B).
  2. Las células en 10 mL de M10PSF en una placa de cultivo celular de 100 mm en una incubadora a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono (CO2) de la cultura.
  3. Las células se dividen cada 2 días en una proporción de 20%: cuando la confluencia 100% de las células (aproximadamente 1.1 x 107 células) se observa bajo un microscopio de contraste de fase, aspiran los medios de comunicación y lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Aspire PBS y añadir 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,48 mM). Dejar actuar durante aproximadamente 1 minuto, hasta que disocian las células de la placa.
  5. Añadir 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separar las células todavía conectadas a la placa mediante pipeteo arriba y abajo.
  6. Transfiera el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 min aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de M10PSF transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier celular masiva. Evitar la creación de burbujas en el tubo.
  7. Transferir 1 mL de la solución de células resuspendidos en una placa de cultivo de células de 100 mm nuevo y agregar 9 mL de M10PSF fresco. Incubar a 37 ° C y 5% CO2.

2. preparación de las células para transfección

  1. Evaluar la confluencia, o el número de células, mediante la observación bajo el microscopio de contraste de fase. Al menos 10% confluencia (aproximadamente 1.1 x 106 células) es necesaria para una placa.
  2. Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células con 10 mL de PBS. Aspire PBS y añadir 3 mL de EDTA. Dejar actuar durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente, hasta que disocian las células de la placa.
  3. Añadir 5 mL de M10 para inactivar la tripsina y finalmente separar las células todavía conectadas a la placa mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir el volumen (8 mL) a un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de M10PSF transfiriendo hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier celular masiva. Evitar la creación de burbujas en el tubo.
  5. Dependiendo del número de placas a ser transfectadas, transfiera una cantidad adecuada de células en un depósito con el correspondiente volumen adecuado de M10PSF. Una placa de 96 pocillos debe ser plateada con 1/10 de un plato de 100 mm confluentes de 100% (aproximadamente 1.1 x 106 células) diluido en M10PSF para llegar a un volumen total de 6 mL. Para una placa de 96 pozos a partir de un plato de 100 mm de 100% de confluencia, agregar 500 μl de 5 mL de células resuspendidas a 5,5 mL de M10PSF fresco. Mezcle las células y M10PSF sin generar burbujas de aire.
  6. Pipetear 50 μl de las células suspendidas en cada pocillo de la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar durante una noche a 37 ° C y 5% CO2.

3. transfección del plásmido

  1. Observar la placa de 96 pocillos con un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre 30% y 50%.
  2. Preparar una mezcla de transfección primera que contiene la plásmidos comunes a toda la placa (RTP1S, o y Glosensor proteínas, véase Tabla de materiales) después de los volúmenes en la tabla 1. Tenga en cuenta que la cantidad de OR tagged Rho debe dividirse por el número de RUP si varias SRO.
    Nota: Fuertemente Consejo añadir un vector vacío negative control (aquí Rho-pCI) y control positivo (conocido OR responder al olor prueba) para el plan del experimento.
  3. Preparar una mezcla de transfección segundo conteniendo 500 μl de MEM y 20 μl del reactivo Lipofectamine 2000 (válido para una placa de 96 pocillos, véase Tabla de materiales). Añadir la mezcla del segundo al primero y suavemente mezclar mediante pipeteo arriba y abajo e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Añadir 5 mL de M10 y mezclar suavemente.
  4. Vuelva a colocar el M10PSF en la placa de 96 pocillos previamente platted 50 μl de los medios de comunicación de final de la transfección. Incubar en un set de incubadora a 37 ° C y 5% CO2 y la cámara del luminómetro durante la noche siguiente el procedimiento descrito en el paso 6 del vacío.

4. sustrato incubación

  1. Observar la placa de 96 pocillos con un microscopio de contraste de fase para asegurar una confluencia celular entre 60% y 100%. Preparar una solución de estimulación de Hank balanceado sal solución (HBSS) que contiene 10 mM de ácido-1-ácido de hidroxietilo (HEPES) y 5 mM de D-glucosa.
  2. Diluir 75 μl de reactivo de campo (ver tabla de materiales) solución a 2,75 mL de la solución de estimulación. Retire el medio de transfección de la placa de 96 pocillos y lavar las células añadiendo 50 μl de solución fresca de la estimulación a cada pocillo.
  3. Retirar la solución de estimulación y añada 25 μl de solución de campo reactivo preparado en el paso 4.2 a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro y sin olor (por ejemplo, un cajón limpio vacío lejos de productos químicos o de cualquier fuente de olor) por 2 h.

5. olor estimulación

  1. En primer lugar, equilibrar la cámara luminómetro con moléculas volátiles odorantes. Diluir el olor a la concentración deseada en 10 mL de aceite mineral (figura 2A). Antes de finalizar el tiempo de incubación de campo reactivo, añadir 25 μl de la solución de olor en una placa de 96 pocillos nuevo (no uno que contiene las células). Incubar este olor la placa a temperatura ambiente en la cámara de luminómetro para 5 minutos (figura 2B) (ningún registro de luminómetro se requiere aquí).
  2. Establecer el luminómetro para grabar la luminiscencia con 0 s de retraso durante 20 ciclos de medida de la placa de 90 s con 0,7 s de intervalo entre los ciclos.
  3. Justo antes de leer la placa, quite la placa de odorante de la cámara. Añada 25 μl de olor entre los pocillos de la placa de 96 pocillos que contienen las células (no agregar el aroma en los pozos que contienen las células) y rápidamente iniciar la medición de la luminiscencia de todos los pozos de 20 ciclos dentro de 30 minutos (figura 2C).

6. eliminación de olor restantes dentro del luminómetro

  1. Abrir la puerta del luminómetro. Inserte el tubo conectado a la bomba de vacío.
  2. Cámara de vacío odorantes en la leyendo extensivamente (al menos 2 h, preferiblemente durante la noche) entre dos aceites para evitar la contaminación cruzada de volátiles de olor de un experimento a otro. Reemplazar con aire fresco mediante el envío de aire comprimido durante 5 min antes de incubar el aroma próximo.

7. Análisis de datos

  1. Exportar los datos del software del luminómetro.
  2. Promedio de las repeticiones de la misma o de cada hora. Calcular la respuesta normalizada de OR a cualquier eventual control (por ejemplo, vector vacío, figura 3A y sección resultados representativos) dividiendo el valor de control promediado del o un promedio de valor en cada momento de grabación (figura 3B y la sección de resultados representativos).
  3. Normalizar la cada respuesta OR su actividad basal dividiendo la respuesta promedio de OR en 0 s a cada respuesta de tiempo de grabación (véase la figura 3C y sección resultados representativos).
  4. Calcular el área bajo la curva de cada o para obtener un único valor de respuesta OR. Para ello, suma todos los valores de luminiscencia de cada hora por cada o.

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Representative Results

Defendimos la respuesta de tres ORs de ratón, Olfr746, Olfr124 y Olfr1093 utilizando la estimulación de vapor del cinamaldehído (figura 3). Al mismo tiempo, utilizamos un control vector vacío (Rho-pCI) para asegurar que las actividades inducidas por el olor de las RUP probadas fueron específicas (figura 3A). La activación en tiempo real de las RUP a estímulos de olor de vapor fue monitoreada medición de más de 20 ciclos. Los datos para cada bien se primero normalizaron el vector vacío control un promedio de valor para cada ciclo (figura 3B). Es importante señalar que ORs pueden mostrar niveles variables de actividad basal en este ensayo de manera OR-dependiente y puede ser importante normalizar también su respuesta a este parámetro (figura 3C). El valor promedio de una o se puede dividir por su respuesta en t = 0 s, permitiendo comparar entre SRO. Valores de activación único para cada o también pueden ser computados calculando el área bajo la curva (AUC) para cada uno, o mediante la suma de todos valores del ciclo de medición (figura 3D).

Además, dependiente de la dosis respuesta puede medirse usando este método con dosis creciente de odorante. Presentamos la respuesta de Olfr1377 a la estimulación de la acetofenona grabada siguiendo el mismo procedimiento (figura 4). Acetofenona volatilidad puede evaluarse por su presión de vapor, que es igual a 0,44 mm Hg a 25 ° C. A una temperatura determinada, un olor que poseen una mayor presión de vapor es más volátil que un olor con una presión de vapor más baja. Acetofenona es, en consecuencia, un olor moderadamente volátil y está expuesta a la celda puro y diluido en 10-2, 10-4, 10-6 y 10-8. Sólo las tres concentraciones más altas (pura, 10-2 y 10-4) son capaces de activar Olfr1377 (figura 4A). También podemos notar que el estímulo compuesto puro muestra una tendencia a disminuir la respuesta de OR durante tiempo, probablemente debido a la toxicidad de la célula, como se ha demostrado para el eugenol en una reciente publicación32. Sin embargo, podemos observar un comportamiento de dependencia de la dosis típica de Olfr1377 (figura 4B), mostrando que este método también puede utilizarse para determinar la EC50 de o a compuestos volátiles.

Tenga en cuenta que cuando se realizan experimentos de dosis-dependiente, no utilice la aspiradora limpia la cámara luminómetro. Sin embargo, los experimentos siempre se realizan desde baja a dosis alta, aumento de olor para minimizar la contaminación. Además, ya no se sabe la concentración real de las moléculas del olor en los medios de comunicación de la célula, el EC50s obtenido por este método no son necesariamente comparables a las obtenidas por estimulación de líquido. Los valores de EC50 determinados por el método de toman en cuenta la volatilidad del olor, la cinética de disolución de odorante en el medio, solubilidad de olor y la afinidad entre el olor y la o, que están más cerca de la percepción natural del olor. Para nuestro ejemplo de la estimulación Olfr1377 de acetofenona, el valor de EC50 de nuestro vapor dosis-respuesta es 161 μm (0.001874%), que es alrededor de 50 veces más alto que el estímulo líquido (3.28 μm de Saito et al.6). También se informó de esta diferencia entre líquido y vapor estímulos por Sanz et al20 en su ensayo de estimulación de vapor donde la estimulación de vapor dio 100 a 1000 veces menores valores de EC50 de la estimulación del líquido.

Figure 1
Figura 1 : Principio de control en tiempo real de la activación del receptor odorante por olor vaporizada. (A) la placa de 96 pocillos se colocó en el equilibrado ya con cámara de luminómetro de olor (nube violeta). (B) vaporizado odorante moléculas (violeta) en la superficie de la solución de los medios de comunicación celular disueltas en ella para llegar a la cavidad OR, en la superficie de la membrana de la célula de Hana3A. La proteína accesorio RTP1S (gris) era transfected, para favorecer la expresión superficial de la célula de la o. Si la molécula odorante es un agonista de OR, o cambia a un estado activado y obligado el Golf, provocando la activación del cyclase del adenylyl (AC) y la producción de AMP cíclico (cAMP; verde). La proteína Glosensor (luciferasa) posee un sitio de Unión para el campamento, una vez enlazado, que permite que la proteína para unirse a su ligando, el luciferin (amarillo). Final complejo Glosensor la proteína/luciferin/campo produce la luminiscencia que se registró para controlar la activación de la OR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Esquema protocolos para el monitoreo en tiempo real de la activación del receptor odorante por olor vaporizada. El olor (violeta) se diluyó en la concentración en aceite mineral (A). La solución entonces fue plateada en una nueva placa de 96 pocillos, que fue colocada en el compartimiento de luminómetro para 5 minutos equilibrar el volumen con olor vaporizada antes de control de la placa de 96 pocillos transfected (B). La solución de olor se pipetea en cada espacio entre los pozos de la placa de 96 pocillos transfected (ver zoom). La placa fue entonces leer para 20 ciclos en la cámara de luminómetro había equilibrado aroma de vapor (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Ejemplo de normalización que se puede realizar después de la grabación de datos. Control (A) un vector vacío (negativo) se insertó en el plan de transfección para ser capaces de identificar cualquier potencial activaciones de olor específico no-o de las células. También proporciona información sobre la luminiscencia del fondo de la placa. (B) cada respuesta entonces fue normalizada dividiendo el valor de emisión de cada bien por el valor medio del vector de control en cada placa. Los valores de luminiscencia de cada o entonces fueron hechas un promedio a lo largo de los ciclos de medición. (C) o respuestas también entonces pueden normalizar su actividad basal dividiendo para cada valor del ciclo por el valor promedio del ciclo 1st de medición (t = 0 s). (D) el AUC puede calcularse sumando los valores de emisión de cada ciclo de medición. Para B, C y D, barras de error representan el error estándar de la media (SEM, n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Ejemplo de respuestas dependientes de dosis obtenidas con el método. (A) la respuesta de Olfr1377 a acetofenona se registró en cinco diferentes diluciones en aceite mineral (10010-2, 10-4, 10-6, 10-8) y sin olor (0) y normalizado después de la Protocolo de normalización que se muestra en la figura 3. Ciclos (B) los datos durante la medida se tradujo en un valor AUC para cada dilución. Esta figura ha sido modificada de Kida et al32. Esta figura está licenciada bajo una Creative Commons Attribution 4.0 International (CC por 4.0). Barras de error representan el error estándar de la media (SEM, n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por placa de 96 pocillos
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
O 75 ng

Tabla 1: mezcla para transfección. Cantidades de plásmidos (proteína de la Glosensor, RTP1S y o) para agregar al MEM para transfectar a una placa de 96 pocillos.

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Discussion

La percepción del olor es fundamentalmente dependiente de la activación de las RUP. En consecuencia, entendimiento de su funcionalidad es necesaria para romper los complejos mecanismos que utiliza el cerebro para percibir su entorno químico volátil. Sin embargo, la comprensión de este proceso ha sido obstaculizada por las dificultades en el establecimiento de un método robusto para el repertorio de OR para funcionalidad contra olores in vitro. de la pantalla Célula de expresión heteróloga y superficie de ORs se ha resuelto parcialmente por la creación de receptores etiquetado13,19 y por el descubrimiento y optimización de las proteínas de transporte del receptor (RTPs) expresado en OSNs22 , 23. los primeros estudios de la proyección aparecieron entonces, traer nuevas perspectivas para nuestra comprensión de la función OR como su olor reconocimiento patrón6,7,26,33, activación mecanismo34,35, estructura tridimensional teórica36,37, evolución38,39, olor espacio40,41, 42e implicaciones en olor detección43,44,45,46. Creemos que mejorando los métodos in vitro podría impulsar el desciframiento de la codificación del olor. Como tal, aquí desarrollamos un nuevo análisis funcional para permitir el seguimiento de la activación de OR por moléculas odorantes vaporizado.

El éxito de este método depende de varios pasos críticos. Aunque mejorado en los últimos años, la expresión heteróloga de algunas RUP sigue siendo difícil, que puede influenciar la respuesta OR a olor. La expresión de las RUP en la membrana celular puede evaluarse en un experimento paralelo usando el flujo cytometry19,24. Notar que los bajos niveles de expresión superficial pueden todavía presentes respuestas sólidas en células heterólogas sistemas35. Otro punto crítico es evitar contaminaciones de olor. Dada la sensibilidad de este ensayo, las moléculas de olor de perfume, comida ni ensayo previo pueden contaminar el experimento por inducir respuestas incontroladas de OR. Por esta razón aconsejamos al vacío la cámara del luminómetro para al menos 2 h, preferiblemente durante la noche, antes de realizar un ensayo con un olor diferente. También es importante considerar una citotoxicidad potencial de olor utilizado en el experimento. Una potencial disminución de la respuesta de la o durante la supervisión de 30 min puede demostrar que el olor sí mismo tiene un efecto negativo sobre la salud celular. La citotoxicidad de odorante puede evaluarse mediante la realización de un ensayo de viabilidad celular después de exponer las células para el olor. Para mitigar este problema, es posible considerar sólo lo 10 min el tiempo de grabación para el análisis de datos, cultivo final. Nos dimos cuenta de que olor toxicidad ocurre principalmente cuando el olor es puro o en concentraciones muy altas. La sensibilidad de nuestro ensayo permite la detección de olor diluido en aceite mineral. La concentración óptima para obtener la respuesta máxima varía de un olor a otro, pero se observó que una dilución de 1% es suficiente para provocar una saturación de un OR respuesta32. Sin embargo, algunas moléculas odorantes pueden poseen baja presión de vapor (y por lo tanto baja volatilidad) y pueden necesitar algunos ajustes que deban realizarse en el protocolo presentado. El tiempo de incubación del olor en la cámara de luminómetro aquí está situado a 5 min. Suponemos que esta cantidad de tiempo es suficiente para equilibrar la cámara con las moléculas volátiles de olor, pero aceites de baja volatilidad pueden requerir tiempos de incubación más largos.

Aparte de estos puntos críticos, este método ofrece muchas nuevas posibilidades a explorar las relaciones estructura-función de olor-interacciones de OR. El aspecto de control en tiempo real de este método también permite la comprensión de la cinética de eventos que ocurren durante la percepción del olor. Como ejemplo, usamos el protocolo para explorar la funcionalidad de la enzima de un metabolito, el esterase carboxyl 1D (Ces1d), que se expresa en la mucosa olfatoria de mamíferos47. Esta enzima es conocida por convertir ésteres a ácido carboxílico y alcohol48. La transfección Co de Ces1d mostró una modulación de las respuestas de OR in vitro a compuestos de éster,32 demostrando que este nuevo protocolo es eficaz en la exploración de la importancia de las enzimas metabólicas en la detección de olor. Además, utilizando esta plataforma para investigar mezclas de olor y la forma de los olores se presentan en ambientes que son más naturales, le permitirá a futuro estudio en la comprensión de las interacciones más complejas de odorante. Finalmente, la detección de moléculas odorantes RUP es también de gran interés en el desarrollo de un sensor de olor. Una vez demostrado que nuestro sistema puede detectar moléculas de olor presentadas en una fase de vapor, este método es un primer paso en el proceso de desarrollo de un biosensor miniaturizado.

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Disclosures

Dufr, H. K y H.M. presentaron una solicitud de patente correspondiente a este trabajo en 27 de octubre de 2016.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por becas del NIH (DC014423 y DC016224) y el defensa avanzada proyecto Agencia RealNose proyecto de investigación. YF me alojé en Duke University con apoyo financiero del programa JSP para avance estratégico internacional redes acelerar la circulación de investigadores talentosos (R2801). Agradecemos a Sahar Kaleem para la edición del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor
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de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

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