Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

Abstract

תפיסת הריח מתחיל האינטראקציה של odorants עם רצפטורים odorant (או) בא לידי ביטוי על ידי חוש הריח החישה הניריונים (OSN). ריח זיהוי עוקב אחר ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזאת קידוד קומבינטורית, אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. לפיכך, ריח-ריכוז נתון יכולה להיות מתוארת על ידי תבנית ההפעלה של ORs, אשר הוא ספציפי על כל ריח. במובן הזה, פיצוח המנגנונים המשתמשת המוח להבחין ריח דורש את ההבנה odorant-ניתוח אינטראקציות. זו הסיבה מדוע הקהילה חוש הריח מחויבת "דה orphanize" רצפטורים אלו. קונבנציונאלי מערכות in vitro המשמש לזיהוי odorant- או אינטראקציות נעזרו ומוכנסות המדיה הנייד עם odorant, אשר היא נבדלת הגילוי הטבעי של ריחות באמצעות פירוק odorants אדי לתוך רירית האף לפני בחברת ORs. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה מאפשר ניטור בזמן אמת של הפעלת או באמצעות אדים-שלב odorants. השיטה שלנו מתבססת על מדידת שחרור המחנה על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות וזמינותו Glosensor. זה גשרים הנוכחי פערים בין גישות ויוו במבחנה ומספק בסיס חיישן כימיים נדיפים ביונים.

Introduction

חוש הריח מאפשר קרקעית חיות לאינטראקציה עם הסביבה כימיים נדיפים שלך כונן התנהגויות ורגשות. ביסודו, מתחיל תהליך זיהוי ריח עם האינטראקציה הראשונה של מולקולות odorant עם מערכת הריח, ברמה של קולטנים (ORs) odorant1. ביונקים, ORs מבוטאים בנפרד חוש הריח נוירונים סנסוריים (OSNs) ממוקם אפיתל חוש הריח2. הם שייכים למשפחת קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב, ליתר דיוק למשפחת אופסין # רודופסין דמוי משנה (המכונה גם מחלקה A). ORs זוג עם מופחתים גרם חלבון Golf הפעלת אשר מוביל המחנה ייצור ואחריו פתיחת ערוצי נוקלאוטיד מחזורית מגודרת, הדור של פוטנציאל פעולה. מקובל כי ההכרתיות ריח מסתמך על דפוס מסוים של ORs מופעל3,4 , ולכן זיהוי ריח מלווה ערכת קידוד המשתמשת קומבינטורית, או אחד יכול להיות מופעל על ידי קבוצת odorants בהם odorant אחד יכול להפעיל שילוב של ORs. דרך כזו קידוד קומבינטורית, זה הוא שמהווה אורגניזמים יכולים לזהות ולהבחין בין מספר עצום של מולקולות ריח נדיפים. אחד המפתחות להבנת איך נתפסים ריחות היא להבין איך ואשר ORs מופעלים על ידי ריח נתון.

בניסיון להבהיר odorant- או אינטראקציות, מבחני פונקציונלי במבחנה שיחקו תפקיד חיוני. הזיהוי של אגוניסט ליגנדים מדיף עבור יתום ORs (או דה-orphanization) כבר שדה פעיל מאוד בעשרים השנים האחרונות, באמצעות שימוש שונים במבחנה, ex-vivo ומבחני פונקציונלי ויוו5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

מערכות assay במבחנה הם המתאימים ביותר עבור אפיון פונקציונלי מפורט ORs, כולל זיהוי של תחומים פונקציונליים, ומשקעים קריטי של ORs, כמו גם יישומים הנדסיים פוטנציאליים. עם זאת, בהמשך פיתוח מערכות במבחנה יקר עבור ORs היה אתגר, בין היתר בשל קושי עם culturing OSNs וביטוי פונקציונלי של ORs בתאים heterologous. האתגר הראשון היה להקים פרוטוקולים מותרים עבור הביטוי פני שטח התא של ORs פונקציונלי מיפוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מספר קבוצות עצמאית נעזרו שונים גישות5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. אחד ההישגים המוקדמים נוצר על ידי Krautwurst et al. ב מתויג N-הסופית של ORs עם רצף מקוצרת של אופסין # רודופסין (Rho-תג) ולצפות ביטוי השטח משופרת ב- תאי כליה אנושית עובריים (HEK)13. וריאציות שבוצעו התג המוצמד הרצף או הוא עדיין נתיב חקר לשיפור או ביטוי ופונקציונליות19,21. סאיטו ואח. ואז זיהו חלבון קולטן-הובלת 1 (RTP1), RTP2 אשר להקל או סחר בסמים. 22 גרסה קצרה יותר של RTP1, שנקרא RTP1S, גם הוכח להיות יעיל יותר מאשר החלבון המקורי23. הפיתוח של קו תא (Hana3A) stably המבטאת Golf, REEP1, RTP1 ו- RTP2 24, בשילוב עם השימוש של אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה) כתבים איפשר זיהוי של odorant-ניתוח אינטראקציות. מנגנון לפיו משפחת RTP של חלבונים מקדמת הבעת פני שטח התא ORs עדיין נקבע.

אזהרה אחת משיטות אלה הוקמה היא כי הם מסתמכים על גירוי odorant בשלב נוזלי, כלומר odorants הם התפרקה מראש לתוך מדיום גירוי לעורר תאים על-ידי החלפת המדיום. . זה מאוד שונה מזו התנאים הפיזיולוגיים שבה מולקולות odorant להגיע האפיתל חוש הריח בשלב אדי, להפעיל ORs על-ידי פירוק לתוך רירית האף. כדי להידמות יותר חשיפה גירוי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, צאנז ואח20 המוצע של assay בהתבסס על אדי גירוי על-ידי החלת טיפת odorant פתרון לתלות מתחת הפנים הפנימי של סרט פלסטיק הניח על ראש תא בארות. הם הקליטו את התגובות סידן על-ידי ניטור קרינה פלואורסצנטית בעוצמה. שיטה זו היה הראשון להשתמש אוויר-שלב odorant גירוי, אבל זה לא התירו הקרנה גדולים או ההפעלה.

. הנה, פיתחנו שיטה חדשה המאפשרת ניטור בזמן אמת של הפעלת או במבחנה באמצעות אדי שלב odorant גירוי על ידי וזמינותו Glosensor (איור 1). Assay הזה שימש בעבר בהקשר של odorant נוזלי גירוי18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. התא ניטור של luminometer זה equilibrated קודם עם odorant מתאדה לפני הצלחת לקרוא (איור 1א'). Odorant מולקולות הן ואז solvated לתוך המאגר, רחצה Hana3A תאים המבטאים את הניתוח של עניין, RTP1S את החלבונים Glosensor (איור 1B). אם odorant הוא אגוניסט של הניתוח, הניתוח לעבור קונפורמציה מופעל לאגד Golf, מפעיל את cyclase adenylyl (AC) ו בסופו של דבר לגרום רמות המחנה לעלות. המחנה העולה לאגד ולהפעיל את החלבון Glosensor כדי ליצור הפריה חוץ גופית ותזרז luciferin. הארה זו לאחר מכן נרשם על-ידי luminometer ומאפשרת או הפעלת הפיקוח. שיטה זו היא עניין גבוהה בהקשר של deorphanization או כפי שהיא מביאה מערכות in vitro קרוב התפיסה הטבעית של ריחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hana3A אנליזה טרמית

  1. להכין M10 (מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום (FBS)), M10PSF (M10 פלוס 100 µg/mL פניצילין-סטרפטומיצין, שהוא גוסס 1.25 µg/mL B).
  2. התרבות התאים 10 מ"ל של M10PSF בצלחת תרבות תא 100 מ מ בתוך אינקובטור להגדיר ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2).
  3. חלוקת התאים כל יומיים ביחס של 20%: כאשר הנהרות 100% של תאים (כ 1.1 x 107 תאים) נצפית במיקרוסקופ ניגוד שלב, aspire התקשורת ולשטוף את התאים בעדינות עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
  4. האחות PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA, 0.48 מ"מ). תן פועלים למען כ 1 דקות, עד התאים מביצועם מהצלחת.
  5. הוסף 5 מ של M10 להשבית את טריפסין ולנתק בסופו של דבר את התאים עדיין מחוברים לצלחת על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  6. להעביר את אמצעי האחסון (8 מ ל) צינור 15 מ"ל צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע, resuspend את התאים לתוך 5 מ של M10PSF על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לשבור את כל תא המוני. הימנע מיצירת בועות בצינור.
  7. העברת 1 מ"ל של הפתרון resuspended תאים בתבשיל חדש של תרבות תא 100 מ מ ולהוסיף 9 מ של M10PSF טריים. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.

2. הכנה של התאים תקנים

  1. להעריך את המפגש, או את מספר התאים, על ידי התבוננות אותם תחת מיקרוסקופ שלב-ניגודיות. לפחות 10% הנהרות (כ 1.1 x 106 תאים) נדרש עבור לוח אחד.
  2. האחות התקשורת ולשטוף את התאים בעדינות עם 10 מ"ל ל- PBS. האחות PBS ולהוסיף 3 מ"ל של EDTA. תן פועלים למען כ 1 דקות בטמפרטורת החדר, עד התאים מביצועם מהצלחת.
  3. הוסף 5 מ של M10 להשבית את טריפסין ולנתק בסופו של דבר את התאים עדיין מחוברים לצלחת על-ידי pipetting למעלה ולמטה. להעביר את אמצעי האחסון (8 מ ל) 15 מ"ל ובשעות צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות.
  4. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים לתוך 5 מ של M10PSF על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לשבור את כל תא המוני. הימנע מיצירת בועות בצינור.
  5. בהתאם למספר הצלחות כדי להיות transfected, להעביר כמות מספקת של תאים מאגר עם נפח המתאימים ראוי M10PSF. לוח 96-ובכן אחד צריך להיות מצופה 1/10 של תבשיל confluent 100 מ מ 100% (כ 1.1 x 106 תאים) מעורבבת עם M10PSF כדי להגיע הנפח הכולל של 6 מ. עבור לוח 96-ובכן אחד מתחיל עם מנה 100 מ מ 100% הנהרות, להוסיף 500 µL mL 5 תאים resuspended 5.5 מ של M10PSF טריים. מערבבים את התאים ואת M10PSF ללא יצירת בועות אוויר.
  6. פיפטה 50 µL של התאים מושעה לבאר כל צלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה בין לילה-CO 37 ° C ו-5%2.

3. פלסמיד תרביות תאים

  1. לבחון את הצלחת 96-ובכן במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה תא בין 30% ל- 50%.
  2. להכין תערובת תרביות תאים הראשון המכיל את פלסמידים נפוצות על הלוח כולו (RTP1S, או חלבון Glosensor, ראה טבלה של חומרים) בעקבות אמצעי האחסון בטבלה1. לב הכמות או מתויג רו יש לחלק במספר ORs אם מספר ORs.
    הערה: אנחנו חריפה עצה כדי להוסיף פקד שלילי וקטור ריק (Rho כאן-pCI) ושליטה חיובי כלשהו (הידועה או להגיב odorant שנבדקו) את תוכנית הניסוי.
  3. להכין תערובת תרביות תאים השני המכיל 500 µL של גברת µL 20 של ריאגנט Lipofectamine 2000 (חוקי עבור לוח אחד 96-ובכן, ראה טבלה של חומרים). להוסיף את המיקס השני הראשון, לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 5 מ של M10 ומערבבים בעדינות.
  4. להחליף את M10PSF בצלחת 96-ובכן platted בעבר על ידי 50 µL של התקשורת תקנים הסופי. דגירה בערכת חממה 37 ° C ו- 5% CO2 , ואקום של לשכת הבאות לילה luminometer ההליך המתואר בשלב 6.

4. המצע דגירה

  1. לבחון את הצלחת 96-ובכן במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה תא בין 60% ל-100%. להכין פתרון גירוי מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) המכילה 10 מ מ של חומצה piperazineethanesulfonic hydroxyethyl (HEPES) ו- 5 מ מ של D-גלוקוז.
  2. לדלל µL 75 מהתרכובת במחנה (ראה טבלה של חומרים) פתרון 2.75 מ של הפתרון גירוי. הסר את המדיום תרביות תאים מהצלחת 96-ובכן, לשטוף את התאים על-ידי הוספת µL 50 של גירוי טריים פתרון טוב לכל.
  3. להסיר את הפתרון גירוי ולהוסיף 25 µL של ריאגנט המחנה פתרון מוכן בשלב 4.2 ל מכל קידוח. דגירה לצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר האפל ונטול ריח בסביבה (לדוגמה, מגירה נקי ריק הרחק מן כימיקלים או כל מקור odorant) כבר שעתיים.

5. Odorant גירוי

  1. ראשית, equilibrate תא luminometer עם מולקולות נדיפות odorant. לדלל את odorant הרצוי לריכוז ב 10 מ"ל שמן מינרלי (איור 2א). לפני סוף זמן הדגירה ריאגנט המחנה, להוסיף 25 µL של הפתרון odorant בצלחת 96-ובכן חדש (לא אחד המכיל את התאים). דגירה הצלחת הזו odorant בטמפרטורת החדר בבית הבליעה luminometer במשך 5 דקות (איור 2B) (הקלטה luminometer לא נדרשת כאן).
  2. להגדיר את luminometer כדי להקליט את הפריה חוץ גופית עם 0 s של עיכוב במהלך מחזורי 20 יחידות מידה צלחת של 90 s עם 0.7 s של מרווח הזמן בין מחזורים.
  3. לפני שקראתי את הצלחת, הסר את לוחית odorant מן החדר. להוסיף 25 µL של odorant בין הבארות של צלחת 96-ובכן המכילות את התאים (אל תוסיף את odorant ב הבארות המכילות את התאים) ולהתחיל במהירות את המידה הפריה חוץ גופית של כל בארות עבור 20 מעגלים בתוך 30 דקות (איור 2C).

6. הסרת odorant הנותרים בפנים Luminometer

  1. לפתוח את הדלת של luminometer. הכנס את הצינור מחובר את משאבת ואקום.
  2. Odorants ואקום בקריאה קאמרית בהרחבה (לפחות 2 שעות, רצוי למשך הלילה) בין שני odorants למניעת זיהום צולב של שיכללו חומרים נדיפים ריח מהניסוי אחד למשנהו. להחליף אוויר על-ידי שליחת אוויר דחוס במהלך 5 דקות לפני המקננת את odorant הבא.

7. ניתוח נתונים

  1. יצא את הנתונים בתוכנת ה-luminometer.
  2. ממוצע משכפל את הדבר או עבור כל זמן ההקלטה. לחשב התגובה או מנורמל שליטה בסופו של דבר (למשל, וקטור ריק, איור 3א ו סעיף תוצאות נציג) על-ידי חלוקת הערך שליטה בממוצע לחדר הניתוח בממוצע ערך בכל מועד הקלטה (איור 3B התוצאות נציג מדור).
  3. לנרמל את התגובה או כל פעילות הבסיס שלהם על-ידי חלוקת התגובה או בממוצע ב 0 s לכל תשובה זמן הקלטה (ראה איור 3ג' , סעיף תוצאות נציג).
  4. לחשב את השטח מתחת העקומה של כל או כדי לקבל ערך יחיד או תגובה. כדי לעשות זאת, לסכם את כל הערכים הפריה חוץ גופית כל זמן ההקלטה עבור כל או.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הוקרנו התגובה של שלושה העכבר ORs, Olfr746, Olfr124, Olfr1093 באמצעות גירוי אדי cinnamaldehyde (איור 3). במקביל, השתמשנו פקד וקטור ריק (Rho-pCI) כדי להבטיח כי פעילות odorant-induced ORs שנבדקו היו ספציפיות (איור 3א). הפעלת בזמן אמת ORs על גירוי odorant אדי היה בפיקוח מדידה מעל 20 מחזורים. הנתונים עבור כל טוב היו קודם מנורמל לערך שליטה בממוצע וקטור ריק עבור כל מחזור (איור 3ב). חשוב לשים לב כי ORs יכול להראות רמות מגוונות של פעילות הבסיס ב הזה assay באופן בלתי תלוי-או, זה יכול להיות חשוב גם לנרמל את תגובתם הפרמטר (איור 3ג'). הערך הממוצע של ניתוח ניתן לחלק לפי תגובתה ב t = 0 s, המאפשר השוואה בין ORs. גם יכול להיות מחושב ערכי הפעלה יחיד עבור כל או על-ידי חישוב השטח מתחת העקומה (AUC) עבור כל אחד, או על-ידי סיכום מדידה כל מחזור הערכים (איור 3ד').

בנוסף, למינון תגובות ניתן למדוד באמצעות שיטה זו באמצעות מינונים odorant הולך וגדל. אנו מציגים את התגובה של Olfr1377 כדי acetophenone גירוי מוקלט, באותו ההליך (איור 4). התנודתיות Acetophenone יכול להיות מוערך על ידי לחץ אדים שלה, אשר שווה ל- 0.44 mm Hg ב 25 º C. בטמפרטורה נתונה, odorant בעל לחץ אדים גבוה יותר היא תנודתיות יותר odorant עם לחץ אדים נמוכה יותר. Acetophenone הוא, וכתוצאה מכך odorant תנודתי למדי, נחשף אל התא טהור, מדולל ב 10-2, 10-4, 10-6 ו 10-8. רק שלושה ריכוז גבוה (טהור, 10-2 ו- 10-4) מסוגלים להפעיל את Olfr1377 (איור 4א). אנחנו גם ניתן להבחין כי גירוי מורכב טהור מראה נטייה להקטין את התגובה או במהלך הזמן, ככל הנראה בשל רעילות תא, כפי הוכח עבור eugenol ב הפרסום האחרונה32. עם זאת, ניתן להבחין להתנהגות תלות מנה טיפוסית של Olfr1377 (איור 4B), מציג שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את EC50 או תרכובת נדיפים.

שים לב כי כאשר מתבצעים ניסויים למינון, אנחנו לא ואקום נקייה תא luminometer. עם זאת, ניסויים מבוצעים תמיד מ נמוך למינונים odorant גבוה, הגדלת למזער מציג. יתר על כן, מאז הריכוז האמיתי של מולקולות odorant של המדיה הנייד אינו ידוע, EC50s המתקבלות בשיטה זו אינם בהכרח דומות לאלה מתקבל על ידי גירוי נוזלי. הערכים EC50 נקבע על ידי השיטה שלנו לקחת בחשבון התנודתיות odorant, קינטיקה פירוק odorant לתוך המדיום, המסיסות של odorant, את הזיקה בין odorant את הניתוח, אשר קרובים יותר התפיסה הטבעית של ריח. עבור הדוגמה שלנו של גירוי Olfr1377 על ידי acetophenone, הערך EC50 של המנה-תגובה שלנו אדי הוא 161 מיקרומטר (0.001874%), אשר הוא בסביבות 50 מקפלים גבוה יותר גירוי נוזלי (3.28 מיקרומטר סאיטו et al.6). ההבדל בין stimulations של נוזלים אדי נמסר על ידי צאנז ואח20 ב שלהם assay גירוי אדי איפה אדי גירוי נתן 100 עד 1000 קיפול ערכים נמוכים יותר EC50 מאשר הגירוי נוזלי.

Figure 1
איור 1 : עקרון ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטן odorant על ידי vapored odorant. (א) הצלחת 96-ובכן הונח לתוך equilibrated כבר עם ריח (ענן סגול) luminometer קאמרית. (B) מתאדה odorant מולקולות (סגול) על פני השטח של מאגר מדיה התא התפרקה לתוכו כדי להגיע אל החלל או על פני קרום התא Hana3A. החלבון אביזר (אפור) RTP1S היה transfected וכן, לטובת הביטוי פני שטח התא של הניתוח. אם מולקולת odorant היה אגוניסט או, או החלפת מצב מופעל, וכרוכים Golf, מפעילה את ההפעלה של adenylyl cyclase (AC) ואת הייצור של מחזורי AMP (מחנה; ירוק) החלבון Glosensor (לוציפראז) הנו אתר איגוד למחנה המאפשר, פעם מאוגדים, החלבון לקשור ליגנד שלה, luciferin (צהוב). הסופי מורכב Glosensor החלבון/luciferin/המחנה הפיק של הפריה חוץ-גופית שנצרב כדי לנטר את ההפעלה או. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : סכימטי פרוטוקולים עבור ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטן odorant על ידי vapored odorant. Odorant (סגול) היה מדולל-ריכוז הרצויים בשמן מינרלי (A). הפתרון היה מצופה ואז לתוך צלחת חדשה 96-ובכן, אשר הונחה אל החדר luminometer במשך 5 דקות כדי equilibrate את אמצעי האחסון עם vapored odorant לפני ניטור לצלחת 96-ובכן transfected (B). הפתרון odorant היה pipetted לתוך רווחים בין הבארות של צלחת 96-ובכן transfected (ראה זום). הלוח היה אז קריאה עבור 20 מחזורים בבית הבליעה luminometer equilibrated אדי odorant (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : דוגמה של נרמול שיכולים להתבצע לאחר נתוני ההקלטה. (א) וקטור ריק (שלילי) שליטה הוכנס בתכנית תרביות תאים כדי להיות מסוגל לזהות כל ההפעלות ריח ספציפי או ללא פוטנציאל של תאים. זה מספק גם מידע על הארה רקע של הצלחת. (B) כל או התגובה היה מנורמל אז על-ידי חלוקת הערך פליטה של כל טוב לפי הערך הממוצע של וקטור שליטה בצלחת לכל. ערכי הפריה חוץ גופית או כל היו אז בממוצע לאורך מחזורי מדידה. (ג) או תגובות יכול גם אז אפשרות לנרמל את פעילות הבסיס שלהם על-ידי כל ערך מחזור לפי הערך הממוצע של מחזור 1st מידה של חלוקת נוספת (t = 0 s). חאן אל (D) יכול להיות מחושב על ידי סיכום הערכים פליטה של כל מחזור מדידה. עבור B, C ו- D, קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע (SEM, n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . דוגמה תגובות תלויות מינון שהושג עם השיטה. (א) תגובת Olfr1377 acetophenone הוקלט עבור חמש דילולים שונים בשמן מינרלי (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), וללא odorant (0), ואת מנורמל בעקבות פרוטוקול נורמליזציה בתרשים 3. ערך חאן אל כל דילול תורגם מחזורים (ב') הנתונים במהלך המדידה. דמות זו שונתה קידה et al.32. איור זה מותקן ברשיון במסגרת יצירתי של מלאי ייחוס 4.0 הבינלאומי (CC מאת 4.0). קווי שגיאה לייצג את שגיאת התקן של הממוצע (SEM, n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לכל צלחת 96-ובכן
מאמ 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
או 75 ng

טבלה 1: לערבב על תרביות תאים. כמויות של פלסמידים (חלבון Glosensor, RTP1S ואו) כדי להוסיף MEM כדי transfect צלחת 96-ובכן אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התפיסה של ריח תלויה באופן מהותי ההפעלה של ORs. כתוצאה מכך, הבנה של הפונקציונליות שלהם נדרש כדי לפצח את המנגנון מורכבות המשתמשות המוח להבחין סביבתו כימיים נדיפים. עם זאת, ההבנה של תהליך זה יש כבר הקשו על ידי הקשיים בהקמת שיטה חזקה למסך את הרפרטואר או פונקציונליות נגד odorants במבחנה. תא והביטוי השטח heterologous של ORs נפתרה באופן חלקי על ידי היצירה של קולטנים מתויג13,19 ועל ידי גילוי של אופטימיזציה של הובלת קולטן החלבונים (RTPs) באה לידי ביטוי OSNs22 , 23. המחקרים ההקרנה הראשונה ואז הופיע, מביא תובנות חדשות להבנת או בפונקציה כגון שלהם odorant זיהוי דפוס6,7,26,33, הפעלה מנגנון34,35,36,מבנה תלת מימדי תיאורטי37,38,האבולוציה39, ריח שטח40,41, 42, וההשלכות של ריח זיהוי43,44,45,46. אנו מאמינים כי שיפור שיטות הפריה יכול להגביר את פיענוח של ריח קידוד. ככזה, כאן פיתחנו assay פונקציונלי חדש כדי לאפשר פיקוח על הפעלה או על ידי מולקולות מתאדה odorant.

ההצלחה של שיטה זו תלויה במספר שלבים קריטיים. למרות שיפור בשנים האחרונות, ביטוי heterologous של כמה ORs נשאר קשה, אשר עשויים להשפיע או היענות odorant. ניתן להעריך את הביטוי של ORs-קרום התא בניסוי מקביל באמצעות לזרום cytometry19,24. שים לב כי רמות נמוכות של הביטוי משטח יכול עדיין נוכחים תגובות חזקות מערכות תא heterologous35. נקודה קריטית נוספת היא כדי למנוע זיהום odorant. לאור הרגישות של זה וזמינותו, מולקולות odorant כל בושם, מזון או assay הקודם יכול לזהם את הניסוי על ידי גרימת תגובות או בלתי מבוקרת. זו הסיבה מדוע אנו ממליצים לשאוב את התא של luminometer כבר לפחות שעתיים, רצוי בן לילה, לפני ביצוע וזמינותו עם odorant שונים. חשוב גם לקחת בחשבון cytotoxicity הפוטנציאליים של odorant המשמשים את הניסוי. ירידה אפשרית של התגובה של הניתוח במהלך ה 30 דקות ניטור יכול להראות כי odorant עצמו יש השפעה שלילית על בריאות התא. ניתן להעריך את cytotoxicity odorant על-ידי ביצוע וזמינותו הכדאיות של התא לאחר חשיפת התאים odorant. כדי להמתיק את הבעיה, זה אפשרי לקחת בחשבון רק את 10 דקות הראשונות של זמן ההקלטה של הניתוח של נתונים, חיתוך הסוף. שמנו לב כי odorant רעילות מתרחשת בעיקר כאשר odorant נבדק טהור או בריכוזים גבוהים מאוד. הרגישות של assay שלנו מאפשרת הגילוי של odorant מדולל בשמן מינרלי. ריכוז אופטימלי שמעודדים תגובה מקסימלי משתנה מ- odorant אחד למשנהו, אבל הבחנו כי לדילול 1% מספיקה כדי להפיק רוויה תגובה או32. אולם, כמה מולקולות odorant שיכולה להיות נמוך לחץ אדים (ו תנודתיות נמוכה ולכן), ייתכן שיהיה עליך כמה שינויים ייעשו פרוטוקול שהוצגו. תקופת הדגירה odorant בבית הבליעה luminometer כאן מוגדר כ 5 דקות. הנחנו כי כמות זמן זו מספיקה equilibrate את התא מולקולות נדיפות odorant, אבל odorants תנודתיות נמוכה עשויים לדרוש יותר זמן דגירה פעמים.

מלבד אלה נקודות קריטיות, בשיטה זו מביא הרבה אפשרויות חדשות לחקור את קשרי הגומלין של מבנה-פונקציה של odorant-ניתוח אינטראקציות. ההיבט ניטור בזמן אמת של שיטה זו מאפשרת גם להבנת קינטיקה של אירועים המתרחשים במהלך תפיסה ריח. לדוגמה, השתמשנו הפרוטוקול לחקור את הפונקציונליות של אנזים מטבוליט, esterase carboxyl 1 י (Ces1d), נמצאו להתבטא רירית חוש הריח של יונקים47. אנזים זה ידוע כדי להמיר אסטרים חומצה קרבוקסילית, אלכוהול48. תרביות תאים שותף של Ces1d הראתה אפנון של או במבחנה, התגובות תרכובות אסתר,32 הוכחת כי פרוטוקול חדש זה הוא יעיל לחקור את החשיבות של אנזימים מטבוליים בזיהוי odorant. יתר על כן, באמצעות פלטפורמה זו לחקור odorant תערובות, ועל הדרך ריחות מוצגים הגדרות טבעי יותר, יאפשר בעתיד מחקר להבנת מורכבות יותר אינטראקציות odorant. לבסוף, זיהוי של מולקולות odorant על ידי חברת ORs היא גם עניין גבוהה להתפתחות בחיישני הריח. שיש הראו כי המערכת שלנו יכול לזהות מולקולות odorant הציגה בשלב אדי, שיטה זו היא צעד ראשון בתהליך הפיתוח של ביוסנסור ולמחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

י, ה K ו- H.M. הגיש בקשה לרישום פטנט רלוונטיים לעבודה זו על 27 אוקטובר 2016.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (DC014423 ו- DC016224), את ההגנה מתקדם פרוייקט הסוכנות RealNose פרוייקט מחקר. YF נשאר באוניברסיטת דיוק עם תמיכה כספית מתוכנית JSPS לרשתות קידום אסטרטגי בינלאומי להאיץ את זרימת הדם של מוכשרים החוקרים (R2801). אנו מודים Kaleem סהר על עריכה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

אדי neuroscience גיליון 146 גירוי קולטנים odorant הפעלה בזמן אמת מולקולות odorant קוד קומבינטורית וזמינותו פונקציונלי
בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter