Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Abstract

Koku algı odorants etkileşim propil reseptörleri ile başlar (veya) koku duyusal sinir hücreleri tarafından (OSN) dile getirdi. Koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile etkinleştirilebilir ve bir propil ORs bir arada etkinleştirebilirsiniz bir birleşimsel kodlama düzeni izler. Böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayırımcılık. Böylece, belirli bir konsantrasyon, bir koku ORs, tarafından bir harekete geçirmek desen her koku için belirli olan tanımlanabilir. Bu anlamda, koku gerektirir anlayış propil algıladıkları için beyin kullandığı düzeneklerini çatlama-OR etkileşimleri. Bu yüzden koku alma toplum "Bu reseptörleri de-orphanize için" taahhüt eder. Propil tanımlamak için kullanılan geleneksel tüp bebek sistemleri- veya etkileşimler ORs ile etkileşim daha önce doğal algılama kokuları buharı odorants dağılması ile burun mukozası içine sorumluluk alanlarından olan hücre ortamla kuluçka propil, kullanılan. Burada, OR etkinleştirme buharı fazlı odorants üzerinden gerçek zamanlı izlenmesi için izin yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim yöntem Glosensor tahlil kullanarak ışıldama tarafından kamp yayın ölçme üzerinde dayanır. İçinde vivo ve tüp bebek yaklaşımlar arasındaki geçerli boşlukları arasında köprü görevi gören ve bir biomimetic uçucu kimyasal duyumsal için bir temel sağlar.

Introduction

Koku alma duygusu karasal hayvanlar uçucu kimyasal çevreleri sürücü davranışları ve duyguları ile etkileşimine izin verir. Temelde, koku alma sistemi, propil reseptörleri (ORs)1düzeyinde ilk etkileşim propil moleküllerin koku Algılama işlemi başlar. Memelilerde, ORs tek tek koku epitel2' de yer alan koku duyusal nöronlar (OSNs) ifade edilir. Ait oldukları G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) ailesi ve daha doğrusu rhodopsin benzeri alt aile (sınıf A olarak da bilinir). ORs çift kimin harekete geçirmek ardından döngüsel nükleotit geçişli kanal açılması ve aksiyon potansiyelleri nesil kamp üretim yol açan uyarıcı G protein Golf ile. Bir koku algılama etkinleştirilmiş ORs3,4 belirli bir desen kullanır ve bu nedenle koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile aktif ve bir propil etkinleştirmek bir birleşimsel kodlama düzeni izler kabul edilen bir ORs birleşimi. Ve böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, bu organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayrımcılık öne ise. Bir kokuları nasıl algılandığını anlamak için anahtar olduğunu anlamak için nasıl ve hangi ORs tarafından verilen bir koku harekete geçirmek.

Bir girişim propil aydınlatmak için- veya etkileşimler, tüp bebek fonksiyonel deneyleri önemli bir rol oynamıştır. Yetim ORs (OR de-orphanization) için agonist kokulu ligandlar tanımlaması çok aktif bir alan son yirmi yıldır, ex vivo ve içinde vivo işlevsel testleri5,6,7 tüp bebek, çeşitli aracılığıyla olmuştur ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

İn vitro tahlil sistemleri en iyi ORs işlevsel etki alanları ve kritik artıkları ORs yanı sıra potansiyel mühendislik uygulamaları da dahil olmak üzere, ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Ancak, daha fazla değerli tüp bebek sistemlerinin geliştirilmesi için ORs kodlamayla OSNs ile zorluk ve kapaklı hücrelerdeki ORs işlev ifadesi nedeniyle kısmen bir mücadele vardı. İlk challenge propil haritalama işlevsel ORs hücre yüzey ifade için izin iletişim kuralları kurmak için olmuştu-OR etkileşimleri. Bir dizi bağımsız gruplar çeşitli yaklaşımlar5,6,7,8,9,10,11,12kullanılan, 14,18,19,20. En erken başarılarından Krautwurst vd tarafından yapıldı ın rhodopsin (Rho-etiket) kısaltılmış bir dizi ile N-terminus, ORs öğesini ve geliştirilmiş yüzey ifade insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri13' te görülmektedir. Varyasyonları OR dizisine bağlı etiketi için yapılan olduğunu hala bir yol OR ifade ve işlevselliği19,21artırmak için araştırdı. Saito ve ark. sonra teşhis reseptör taşıma proteini 1 (RTP1) ve OR ticareti kolaylaştırmak RTP2. 22 RTP1, RTP1S, olarak adlandırılan daha kısa bir sürümünü de özgün protein23daha da etkili olduğu gösterilmiştir. Geliştirme stabil Golfifade bir hücre satırı (Hana3A), siklik adenozin monofosfattır (kampı) gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde REEP1, RTP1 ve RTP2 24, propil tanımlaması sağladı-OR etkileşimleri. Hangi RTP aile proteinlerin hücre yüzey ifade belirlenecek ORs kalıntılarının teşvik mekanizması.

Kurulan bu yöntemlerin bir uyarı onlar odorants bir stimülasyon orta önceden çözülür ve orta değiştirerek hücreleri uyarmak anlamında propil stimülasyon sıvı faz, güvenmek olduğunu. Bu fizyolojik şartlarda nerede propil molekülleri koku epitel buharı aşamasında ulaşmak ve ORs dağılması tarafından nazal mukoza etkinleştirmek çok farklıdır. Daha yakından benzer fizyolojik ilgili uyarıcı pozlama, Sanz vd.20 altında hücre kuyu üstüne yerleştirilen bir plastik film iç yüzü asmaya propil çözüm bir damla uygulayarak buharı stimülasyon üzerinde dayalı bir tahlil evlenme teklif etti. Onlar kalsiyum yanıt floresan yoğunluğu izleme tarafından kaydedildi. Bu yöntem ilk hava fazlı propil stimülasyon kullanın, ama OR harekete geçirmek büyük bir tarama izin vermedi.

Burada, gerçek zamanlı buharı faz propil stimülasyon ile tüp bebek OR etkinleştirme Glosensor assay (şekil 1) tarafından izlenmesi sağlar yeni bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil daha önce sıvı propil stimülasyon18,19,25,26,27,28,29, bağlamında kullanılan 30 , 31. luminometer izleme odası ilk plaka (şekil 1A) okuma önce buharlaşmış propil ile equilibrated. Propil moleküllerdir sonra faiz, RTP1S ve Glosensor proteinler (şekil 1B) OR ifade Hana3A hücreleri banyo arabellek içine solvated. Propil bir agonist or ise, OR için aktif bir uyum geçin ve gozlemler cyclase (AC) aktive Golf, bağlama ve sonuçta kamp düzeyleri yükselmeye neden. Yükselen bu kampı bağlamak ve Glosensor protein biyoluminesans katalizlerler ışıma oluşturmak için harekete geçirmek. Bu ışıma sonra luminometer tarafından kaydedilir ve OR etkinleştirme izleme sağlar. Tüp Bebek sistemleri yakınlaştırmayı kokular doğal algı getiriyor gibi yüksek faiz OR deorphanization bağlamında bu yöntem kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hana3A kültür hücreleri

  1. M10 hazırlayın (en az önemli orta (MEM) artı % 10 v/v fetal sığır serum (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B).
  2. M10PSF 100 mm hücre kültür bulaşık kuluçka 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) ayarla içinde içinde 10 mL hücrelerde kültür.
  3. 2 günde % 20 oranında Hücreleri Böl: % 100 izdiham hücre (yaklaşık 1.1 x 107 hücreleri) faz kontrast mikroskop altında gözlenen zaman medya aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL yavaşça hücrelerle yıkayın.
  4. PBS Aspire edin ve 3 mL % 0.05 tripsin-etilen diamin tetraacetic asit (EDTA, 0,48 mM) ekleyin. Yaklaşık 1 dak kadar hücreleri plaka ayırmak için izin hareket.
  5. M10 tripsin devre dışı bırakın ve sonunda hala plaka için yukarı ve aşağı pipetting tarafından bağlı hücreler ayırmak için 5 mL ekleyin.
  6. 15 mL tüp hacmi (8 mL) aktarmak ve 200 x g 5 dk. aspiratı süpernatant de santrifüj kapasitesi ve hücreleri 5 mL M10PSF de yukarı ve aşağı herhangi bir hücreyi kitle kırmaya pipetting tarafından resuspend. Kabarcıklar tüp oluşturmaktan kaçının.
  7. 1 mL resuspended hücreleri çözeltisi yeni 100 mm hücre kültür tabağına aktarın ve taze M10PSF 9 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.

2. Transfection için hücreleri hazırlanması

  1. Kesiştiği yerde veya hücreleri, faz kontrast mikroskop altında gözlemleyerek değerlendirmek. En az % 10 izdiham (yaklaşık 1.1 x 106 hücreler) bir tabak için gereklidir.
  2. Medya Aspire edin ve PBS 10 mL yavaşça hücrelerle yıkayın. PBS Aspire edin ve 3 mL EDTA ekleyin. Yaklaşık 1 dakika oda sıcaklığında hücreleri plaka ayırmak kadar hareket izin.
  3. M10 tripsin devre dışı bırakın ve sonunda hala plaka için yukarı ve aşağı pipetting tarafından bağlı hücreler ayırmak için 5 mL ekleyin. Hacmi (8 mL) 15 mL tüp ve 5 min için 200 x g , santrifüj aktarın.
  4. Süpernatant Aspire edin ve yukarı ve aşağı herhangi bir hücreyi kitle kırmaya pipetting tarafından hücreleri 5 mL M10PSF de resuspend. Kabarcıklar tüp oluşturmaktan kaçının.
  5. Transfected için tabak sayısına bağlı olarak, bir rezervuar hücrelerde uygun bir miktar M10PSF uygun karşılık gelen hacmi ile aktarın. Bir 96-şey plaka 1/10 toplam hacmi 6 mL ulaşmak için M10PSF içinde seyreltilmiş bir % 100 Konfluent 100 mm tabak (yaklaşık 1.1 x 106 hücreler) ile kaplama. % 100 izdiham 100 mm çanak ile başlayan bir 96-şey plaka için 500 µL taze M10PSF, 5.5 mL 5 mL resuspended hücreleri de ekleyin. Hücreleri ve M10PSF hava kabarcıkları oluşmadan karıştırın.
  6. Askıya alınan hücrelerinin 50 µL bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plaka her kuyuya pipet. Gecede 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.

3. plazmid Transfection

  1. 96-şey plaka % 30 ve % 50 arasında bir hücre izdiham sağlamak için faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek.
  2. Tüm plakasına ortak plazmid içeren ilk transfection karışımı hazırlayın (RTP1S, ya da ve Glosensor protein, Tablo malzemelerigörmek) birimleri Tablo 1' deki aşağıdaki. Fark miktarını Rho öğesini OR ayrılmış ORs sayısına göre eğer birkaç ORs.
    Not: Biz şiddetle tavsiye bir boş vektör negatif kontrol (burada Rho-PCI) ve herhangi bir pozitif kontrol (OR bilinen test propil yanıt vermek için) deney plana eklemek için.
  3. MEM 500 µL ve Lipofectamine 2000 reaktif 20 µL içeren ikinci bir transfection karışım hazırlamak (bir 96-şey plaka için geçerli Tablo malzemelerigörmek). İlki için ikinci mix ekleyin ve karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. M10 5 mL ekleyin ve karışımı yavaşça.
  4. Daha önce platted 96-şey plaka M10PSF son transfection Medya 50 µL tarafından değiştirin. CO2 37 ° C ve %5 için bir kuluçka makinesi kümesindeki kuluçkaya ve yordamı 6. adımda açıklanan luminometer gecede aşağıdakileri TMMOB vakum.

4. substrat kuluçka

  1. 96-şey plaka % 60 ve % 100 arasında bir hücre izdiham sağlamak için faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek. Stimülasyon çözüm, Hank'in dengeli tuz çözüm (10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 5 mM D-glikoz içeren HBSS) hazırlayın.
  2. Kamp reaktif 75 µL seyreltik (bkz: malzemeler tablo) 2.75 mL stimülasyon çözeltisi için çözüm. Transfection orta 96-şey plaka kaldırmak ve her şey için taze stimülasyon çözüm 50 µL ekleyerek hücreleri yıkayın.
  3. Stimülasyon çözüm kaldırın ve kamp reaktif çözüm adım 4.2 her şey için hazırlanan 25 µL ekleyin. 96-şey plaka, oda sıcaklığında karanlık ve odor-özgür bir ortamda (örneğin, bir temiz boş çekmece kimyasallar veya propil kaynaklarından uzakta) 2 h için kuluçkaya.

5. propil stimülasyon

  1. İlk olarak, luminometer odası uçucu propil molekülleri ile equilibrate. Madeni yağ (Şekil 2A) istenen konsantrasyonu 10 ml için propil sulandırmak. Kamp reaktif kuluçka süresi bitmeden 25 µL propil çözüm yeni bir 96-şey plaka (değil bir hücre içeren) ekleyin. Bu propil plaka, oda sıcaklığında 5 (hiçbir luminometer kayıt burada gereklidir) min (Şekil 2B) için luminometer odasında kuluçkaya.
  2. Luminometer 0 ile ışıldama kaydetmek için ayarla s plaka ölçü 90 20 döngüleri sırasında gecikme 0,7 ile s s döngüleri arasındaki süre.
  3. Şu plaka okumadan önce propil plaka odasından kaldırın. Propil wells (katmayın propil hücreleri içeren wells) hücreleri içeren 96-şey plaka arasında 25 µL ekleyin ve hızlı bir şekilde tüm wells ışıldama ölçüm için 30 dk (Şekil 2C) içinde 20 döngü başlar.

6. Luminometer içinde kalan propil kaldırılması

  1. Luminometer kapıyı aç. Vakum pompası bağlı tüp takın.
  2. Vakum odorants okuma odası kapsamlı (en az 2 h, tercihen gece) başka bir koku tenler bir deneme Çapraz bulaşma kaçınmak için iki odorants arasında. Temiz hava ile 5 dk önce sonraki propil kuluçka sırasında basınçlı hava göndererek değiştirin.

7. veri analizi

  1. Verileri luminometer yazılımından verin.
  2. Ortalama aynı veya her kayıt süresi için çoğaltır. Normalleştirilmiş OR yanıt veya denetim ortalama değerine bölünerek herhangi bir nihai denetime (örneğin, boş vektör, şekil 3vebir temsilcisi sonuçları bölümü) değeri her kayıt süresi (şekil 3B ortalama hesaplama ve temsilcisi sonuçları bölümü).
  3. Bazal faaliyetlerini her OR cevaben at 0 ortalama OR yanıt bölerek normalize s her kayıt zaman yanıt (bkz: şekil 3C ve temsilcisi sonuçları bölümü).
  4. Tek bir OR yanıt değer elde etmek için her OR eğri altındaki alan hesaplamak. Bunu yapmak için her OR için her kayıt süresi tüm ışıma değerleri toplamı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yanıt üç fare ORs, Olfr746, Olfr124 ve Olfr1093 ekranlı cinnamaldehyde buharı stimülasyon (şekil 3) kullanarak. Aynı anda, biz test ORs propil kaynaklı faaliyetlerinin belirli sağlamak için bir boş vektör kontrolü (Rho-PCI) kullanılan (şekil 3A). ORs buharı propil uyarıcı üzerine gerçek zamanlı etkinleştirme izlenen 20'den fazla ölçüm devir oldu. Her veri de ilk boş vektör kontrolü ortalama değerine her çevriminde (şekil 3B) normalleştirilmiş. ORs bu tahlil OR-bağımlı bir şekilde düzeyleri Bazal faaliyet göstermek ve ayrıca bu parametre (şekil 3C) onların yanıt normalize etmek önemli olabilir unutmamak gerekir. Ortalama değerini bir t onun Cevabıyla ayrılabilir = 0 s, ORs arasında karşılaştırmak için izin. Her OR için tek aktivasyon değerleri (AUC) her biri için eğri altındaki alan hesaplama veya tüm ölçüm devir değerleri (şekil 3D) özetleme hesaplanabilir.

Ayrıca, doz bağımlı yanıt artan propil dozlarda kullanılarak bu yöntemle ölçülebilir. Biz Olfr1377 yanıt olarak kaydedilen acetophenone stimülasyon aşağıdaki aynı yordamı (şekil 4) mevcut. Hangi 25 ° C'de 0,44 mm Hg eşittir Acetophenone volatilite onun buhar basıncı tarafından değerlendirilir Belirli bir sıcaklıkta yüksek buhar basıncı haiz bir propil bir propil daha düşük bir buhar basıncı ile daha fazla kırılgandır. Acetophenone ise, sonuç olarak, orta derecede uçucu propil ve hücreye maruz saf ve seyreltilmiş 10-2, 10-4, 10-6 ve 10-8. Sadece üç daha yüksek konsantrasyonlarda (saf, 10-2 ve 10-4) Olfr1377 aktive edebiliyoruz (şekil 4A). Biz de bu son yayın32eugenol için gösterdiği gibi saf bileşik stimülasyon sırasında zaman, büyük olasılıkla nedeniyle hücre toksisite, OR yanıt azaltmak için bir eğilim gösterir fark edebilirsiniz. Yine de, Olfr1377 tipik doz bağımlılık davranışlarını gözlemlemek (şekil 4B), gösterilen bu yöntem de EC50 veya uçucu bileşiği belirlemek için kullanılabilir.

Doz bağımlı deneyler gerçekleştirildiğinde, biz temiz luminometer odası vakum değil olduğunu unutmayın. Ancak, deneyler her zaman düşük contaminations en aza indirmek için yüksek, artan propil doz yapılır. Ayrıca, propil moleküller hücre medya gerçek konsantrasyonu bilinmemektedir beri bu yöntemle elde edilen EC50s mutlaka bu sıvı stimülasyon tarafından elde edilen karşılaştırılabilir değildir. Bizim yöntemi tarafından belirlenen EC50 değerleri göz önünde bulundurun propil volatilite, orta, propil'ın çözünürlük ve propil ve OR arasındaki affinity propil çözünme kinetiği koku doğal algı daha yakın olan. İçin bizim örnek Olfr1377 stimülasyon acetophenone tarafından EC50 bizim buharı doz-yanıt dan 50 civarında olan 161 µM (%0.001874), kat sıvı stimülasyon (Saito ve ark.63.28 µM) daha yüksek değerdir. Sıvı ve Buhar elektrodlar arasındaki bu fark da Sanz vd.20 nerede buharı stimülasyon 100-1000 kat daha düşük EC50 değerleri sıvı stimülasyon daha verdi onların buharı stimülasyon tahlil tarafından bildirildi.

Figure 1
Resim 1 : Gerçek zamanlı propil reseptör aktivasyonu tarafından buharlı propil izleme prensibi. (A) 96-şey plaka yerleştirildi zaten dengelenmiş içine koku (Menekşe bulut) luminometer odası. (B) OR kavite, Hana3A hücre membran yüzeyinde ulaşmak için içine çözünmüş propil molekülleri (Menekşe) hücre medya arabellek yüzeyi buharlaşmış. Aksesuar protein RTP1S (gri) de, OR hücre yüzey ifade lehine transfected. Propil molekül bir OR agonist olsaydı, OR olarak aktif duruma geçti ve gozlemler cyclase (AC) aktivasyonu ve siklik AMP (kampı; yeşil) üretimi tetikleyen Golf, bağlı. Glosensor protein (luciferase) izin veren, bir kez bağlı, onun ligand, biyoluminesans (sarı) bağlamak protein kampı için bir bağlama site sahiptir. Son karmaşık Glosensor protein/biyoluminesans/kamp OR harekete geçirmek izlemek için kaydedildi ışıldama üretti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Gerçek zamanlı propil reseptör aktivasyonu tarafından buharlı propil izleme için şematik protokol. Propil (Menekşe), mineral yağ(a)istenen konsantrasyon düşürülmüştü. Çözüm sonra buharlı propil birimle transfected 96-şey plaka (B) izleme daha önce equilibrate 5 min için luminometer odasına yerleştirilen yeni bir 96-şey plaka içine kaplama. Propil çözüm transfected 96-şey plaka kuyu arasında her uzaya pipetted (bkz: zoom). Daha sonra okumak için luminometer odasında 20 devir buharı propil (C) equilibrated plaka vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Örnek veri kayıt sonra gerçekleştirilen normalleştirme. (A) boş bir vektör (negatif) denetim herhangi bir potansiyel sigara-OR belirli koku activations hücre tanımlamak edebilmek için transfection planında eklenmiş. Ayrıca kalenin arka plan ışıma üzerinde bilgiler sağlanmıştır. (B) veya her yanıt sonra her şey emisyon değeri her plaka kontrol vektörde ortalama değeri tarafından bölerek normalize. Işıma değerlerin her or sonra ölçüm döngüleri ortalaması. (C) veya yanıt-e doğru de sonra normalleştirilmiş Bazal faaliyetlerini daha da ölçü 1st döngüsünün ortalama değeri her döngü değeriyle bölerek (t = 0 s). (D) AUC her ölçüm döngüsü emisyon değerlerini toplayarak hesaplanır. B, C ve D için standart hata ortalamaya hata çubukları temsil (SEM, n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Doz bağımlı yanıt yöntemi ile elde edilen örneği. (A) Olfr1377 yanıt acetophenone için beş farklı dilutions mineral yağı için kaydedilmiştir (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8) ve propil (0), olmadan ve normalleştirilmiş takip şekil 3' te gösterilen normalleştirme protokolü. (B) ölçüm sırasında veri döngüsü, AUC değeri her seyreltme için tercüme. Bu rakam Kida vd.32değiştirildi. Bu rakam bir Creative Commons Attribution 4.0 uluslararası altında (CC 4.0) lisansı verilir. Hata çubukları temsil ortalama, standart hata (SEM, n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

96-şey plaka
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
OR 75 ng

Tablo 1: transfection için karışımı. Plazmid miktarlarda (Glosensor protein, RTP1S ve ya da) bir 96-şey plakasına transfect MEM eklemek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Koku algı temelde ORs etkinleştirme üzerinde bağlıdır. Sonuç olarak, anlayış işlevleriyle beyin kullanın uçucu kimyasal çevresine algıladıkları için karmaşık mekanizmaları çatlamak için gereklidir. Ancak, bu işlem anlayış tarafından OR repertuar odorants tüp bebek. karşı işlevsellik için ekran için sağlam bir yöntem oluşturulmasında zorluklar engel Hücre ORs yüzey ve kapaklı ifade kısmen çözüldü etiketli reseptörleri13,19 oluşturulması ve keşif ve optimizasyon OSNs22 reseptör taşıma proteinlerin (RTPs) tarafından , 23. ilk tarama çalışmaları sonra onların propil tanıma desen6,7,26,33, harekete geçirmek gibi OR işlevi anlayışımızı yeni anlayışlar getirerek ortaya çıktı mekanizması34,35, teorik tridimensional yapısı36,37, evrim38,39, koku alan40,41, 42ve koku algılama43,44,45,46etkileri. Tüp Bebek yöntemleri geliştirmek koku kodlama deşifre artırmak olduğunu düşünüyoruz. Bu nedenle, biz burada OR aktivasyonu buharlaşmış propil moleküller tarafından izleme izin vermek için yeni bir işlev tahlil geliştirilmiştir.

Bu yöntemin başarısı üzerinde birkaç önemli adımlar bağlıdır. Her ne kadar son yıllarda geliştirilmiş, hangi propil OR kavramaları etkileyebilecek zor, bazı ORs Contegra ifade kalır. ORs ifade, hücre zarının Akış Sitometresi19,24kullanarak paralel bir deneyde değerlendirilebilir. Yüzey ifade seviyesinin düşük kapaklı cep sistemleri35hala mevcut güçlü tepkiler olabilir dikkat edin. Propil kirlenmesini önlemek için başka bir kritik nokta olduğunu. Bu tahlil hassasiyeti göz önüne alındığında, propil molekülleri herhangi bir parfüm, yiyecek, ya da önceki tahlil kontrolsüz OR yanıt inducing tarafından deneme kirletmektedir. Bu yüzden luminometer için en az 2 h, TMMOB tercihen bir gecede, bir tahlil ile farklı bir propil gerçekleştirmeden önce vakum için tavsiye ediyoruz. Denemede kullanılan propil potansiyel bir sitotoksisite dikkate almak önemlidir. 30 dk izleme sırasında olası bir düşüş veya yanıtının propil kendisi hücre sağlık üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olduğunu gösterebilir. Propil sitotoksisite propil hücrelere açığa sonra hücre canlılığı tahlil gerçekleştirerek değerlendirilebilir. Bu sorunu gidermek için sadece ilk 10 dakika kayıt süresi sonunda kırpma, veri çözümlemesi için dikkate almak mümkündür. Propil toksisitesi özellikle propil saf sınanır veya çok yüksek konsantrasyonlarda oluşur fark ettik. Bizim tahlil duyarlılığını madeni yağ içinde seyreltilmiş propil algılanmasını sağlar. Bir propil maksimal yanıt temin için en uygun konsantrasyonu değişir ama biz %1 seyreltme bir doygunluk OR yanıt32temin için yeterli olduğunu görülmektedir. Ancak, bazı propil molekülleri düşük buhar basıncı (ve bu nedenle düşük volatilite) sahip ve sunulan protokolü için yapılacak bazı ayarlamalar gerekebilir. Burada luminometer odasında propil kuluçka süresi 5 min için ayarlanır. Bu kadar süre odası propil uçucu molekülleri ile equilibrate için yeterli, ama düşük volatilite odorants uzun kuluçka süreleri gerektirebilir düşünmüştük.

Bu kritik noktaları dışında bu yöntem propil yapı-fonksiyon ilişkileri keşfetmek için pek çok yeni olanaklar getiriyor-OR etkileşimleri. Bu yöntem gerçek zamanlı izleme yönünü aynı zamanda Kinetik bir koku algılama sırasında meydana gelen olayları anlayış sağlar. Örnek olarak, biz bir metaboliti enzim, karboksil Esteraz 1 d (Ces1d), memeliler47olfaktör mukoza ifade edilecek bulundu işlevselliğini keşfetmek için kullanılan protokol. Bu enzim esterleri karboksilik asit ve alkol48dönüştürmek için bilinir. Ces1d ortak transfection bir modülasyon bu yeni iletişim kuralı propil algılama Metabolik enzimler önemini keşfetmek etkili olduğunu gösteren32 ester bileşikleri, tüp bebek OR tepkileri gösterdi. Ayrıca, propil karışımları ve kokular daha doğal ayarlarında sunulmaktadır şekilde araştırmak için bu platformu kullanarak daha karmaşık propil etkileşimleri anlamak gelecekteki çalışma sağlayacaktır. Son olarak, propil molekülleri ORs tarafından tespiti de bir koku algılayıcı gelişimi yüksek ilgi olduğunu. Sistemimiz buharı aşamasında sunulan propil molekülleri algılayabilir, bu yöntem bir minyatür Biyoalgılayıcı geliştirme sürecinin ilk adımı gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y.F., H. K ve H.M. bir patent başvurusu 27 Ekim 2016 bu iş ile ilgili eğe.

Acknowledgments

Bu eser NIH (DC014423 ve DC016224) ve savunma ileri araştırma ajansı RealNose projesi hibe tarafından desteklenmiştir. YF JSP'ler Program stratejik Uluslararası ağlar, yetenekli araştırmacıların dolaşımı (R2801) hızlandırmak ilerlemek için mali desteği ile Duke Üniversitesi'nde kaldı. Sahar Kaleem yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865 (2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

Tags

Neuroscience sayı: 146 buharı stimülasyon propil reseptörleri gerçek zamanlı harekete geçirmek propil molekülleri Kombinatorik kodu fonksiyonel tahlil
Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter