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Neuroscience

वाष्प चरण में एक गंधक द्वारा गंधक रिसेप्टर सक्रियण के वास्तविक समय में विट्रो निगरानी

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

फिजिकली, ओडोरेंट रिसेप्टर्स ओडोरेंट भाप चरण में साँस अणुओं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । हालांकि, सबसे इन विट्रो सिस्टम तरल चरण ओडोरेंट उत्तेजना का उपयोग । यहां, हम एक तरीका है कि वास्तविक समय की अनुमति देता है ओडोरेंट रिसेप्टर सक्रियण के भाप चरण में गंधक उत्तेजना पर के विट्रो निगरानी वर्तमान ।

Abstract

घ्राण प्रत्यक्षण गंना रिसेप्टर्स (या) घ्राण संवेदी ंयूरॉंस (osn) द्वारा व्यक्त के साथ गंध की बातचीत के साथ शुरू होता है । गंध मांयता एक मिश्रित योजना है, जहां एक या गंध का एक सेट द्वारा सक्रिय किया जा सकता है और एक odorants ओआरएस का एक संयोजन को सक्रिय कर सकते है इस प्रकार है । इस तरह के संयोजन के माध्यम से कोडिंग, जीवों का पता लगाने और एक अस्थिर गंध अणुओं के असंख्य के बीच भेदभाव कर सकते हैं । इस प्रकार, एक दिया एकाग्रता में एक गंध ओआरएस, जो प्रत्येक गंध के लिए विशिष्ट है की एक सक्रियण पैटर्न द्वारा वर्णित किया जा सकता है । इस अर्थ में, तंत्र है कि मस्तिष्क के लिए गंध का उपयोग करता है खुर समझ गंघंत या बातचीत की आवश्यकता है । यही कारण है कि घ्राण समुदाय "de-अनाथ ize" इन रिसेप्टर्स के लिए प्रतिबद्ध है । ओडोरेंट की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक इन विट्रो सिस्टम्स-या इंटरैक्शन का उपयोग गंधों के साथ इंक्यूबैटिंग सेल मीडिया द्वारा किया जाता है, जो ओआरएस के साथ बातचीत करने से पहले नाक mucosa में वाष्प गंध के माध्यम से odors की प्राकृतिक पहचान से अलग है । यहां, हम एक नई विधि का वर्णन है कि वास्तविक समय की निगरानी के लिए की अनुमति देता है या भाप चरण odorants के माध्यम से सक्रियण । हमारी विधि glosensor परख का उपयोग कर संदीप्ति द्वारा शिविर रिहाई को मापने पर निर्भर करता है । यह vivo में और इन विट्रो दृष्टिकोण के बीच वर्तमान अंतराल पुलों और एक biomimetic अस्थिर रासायनिक संवेदक के लिए एक आधार प्रदान करता है.

Introduction

गंध की भावना स्थलीय जानवरों उनके अस्थिर रासायनिक वातावरण के साथ बातचीत करने के लिए व्यवहार और भावनाओं को ड्राइव करने की अनुमति देता है । मूल रूप से, गंध का पता लगाने की प्रक्रिया घ्राण प्रणाली के साथ ओडोरेंट अणुओं के बहुत पहले बातचीत के साथ शुरू होता है, गंधकारी रिसेप्टर्स (ओआरएस)1के स्तर पर । स्तनधारियों में, ओआरएस को व्यक्तिगत रूप से घ्राण उपकला2में स्थित घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (osns) में व्यक्त किया जाता है । वे जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) परिवार से संबंधित है और अधिक ठीक rhodopsin की तरह उप परिवार के लिए (भी कक्षा एक कहा जाता है) । उत्तेजक जी प्रोटीन जीओएलएफ के साथ ओआरएस जोड़ी जिसका सक्रियण शिविर उत्पादन की ओर जाता है और इसके बाद चक्रीय न्यूक्लियोटाइड gated चैनलों और कार्रवाई की क्षमता की पीढ़ी के उद्घाटन के द्वारा । यह स्वीकार किया जाता है कि एक गंध खतरे सक्रिय ओआरएस3,4 और इसलिए गंध मांयता के एक विशिष्ट पैटर्न पर निर्भर करता है एक मिश्रित योजना है, जहां एक या गंध का एक सेट और एक odorants सक्रिय कर सकते है द्वारा सक्रिय हो सकते है एक ओडोरेंट एक ओआरएस का संयोजन । और इस तरह के संयोजन के माध्यम से कोडन, यह माने है कि जीवों का पता लगाने और अस्थिर गंध अणुओं के असंख्य के बीच भेदभाव कर सकते हैं । कैसे odors माना जाता है समझने की चाबियां में से एक को समझने की कैसे और जो ओआरएस एक दिया गंध से सक्रिय हैं ।

ओडोरेंट-या बातचीत को स्पष्ट करने के प्रयास में, इन विट्रो कार्यात्मक assays हैं एक आवश्यक भूमिका निभाई है । अनाथ ओआरएस (या de-अनाथाization) के लिए एगोनिस्ट सुगंधित लिगन्डों की पहचान पिछले बीस वर्षों के लिए एक बहुत सक्रिय क्षेत्र रहा है, विभिंन इन विट्रो के उपयोग के माध्यम से, पूर्व vivo में और vivo में कार्यात्मक assays हैं,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, १७।

इन विट्रो परख प्रणालियों के लिए सबसे अच्छा ओआरएस का विस्तृत कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल हैं, कार्यात्मक डोमेन और ओआरएस के महत्वपूर्ण अवशेषों की पहचान करने सहित, साथ ही साथ संभावित इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों । तथापि, ओआरएस के लिए मूल्यवान इन विट्रो प्रणालियों का आगे विकास एक चुनौती रहा है, जो कि विषमजात कोशिकाओं में ओएनएस की कृत् य और ओआरएस की कार्यात्मक अभिव्यक्ति के साथ कठिनाई के कारण हुआ है । पहली चुनौती प्रोटोकॉल है कि ओडोरेंट के मानचित्रण में कार्यात्मक ओआरएस की सतह अभिव्यक्ति या बातचीत के लिए अनुमति की स्थापना करने के लिए किया गया था । कई स्वतंत्र समूहों ने विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग किया है5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20। प्रारंभिक उपलब्धियों में से एक Krautwurst एट अल द्वारा बनाया गया था । में टैग की गईं एन-टर्मिनस रोडोप्सिन के एक छोटा अनुक्रम के साथ ओआरएस (Rho-tag) और मानव भ्रूणीय गुर्दा (HEK) कोशिकाओं में एक बेहतर सतह अभिव्यक्ति मनाया13. या अनुक्रम से अनुलग्न टैग में किए गए भिंनताएं अभी भी सुधार या अभिव्यक्ति और कार्यक्षमता के लिए पता लगाया गया पथ है19,21। उसके बाद रिसेप्टर की पहचान की-परिवहन प्रोटीन 1 (RTP1) और RTP2 जो सुविधा या अवैध व्यापार । 22 RTP1 का छोटा-सा वर्शन, जिसे RTP1S कहा जाता है, उसे मूल प्रोटीन की तुलना में और भी असरदारदिखाया गया है । एक कोशिका रेखा के विकास (Hana3A) जो stably जीओएलएफ, REEP1, RTP1, और 24RTP2 व्यक्त, चक्रीय adenosine मोनोफॉस्फेट (शिविर) संवाददाताओं के उपयोग के साथ युग्मित है गंदांत या बातचीत की पहचान सक्षम है । जिस तंत्र द्वारा आरटीपी प्रोटीन के परिवार को बढ़ावा देता है सेल सतह ओआरएस की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए रहता है ।

इन स्थापित तरीकों की एक चेतावनी है कि वे तरल चरण में गंध उत्तेजना पर भरोसा करते हैं, जिसका अर्थ है कि गंध पूर्व एक उत्तेजना माध्यम में भंग कर रहे है और माध्यम की जगह से कोशिकाओं को उत्तेजित । यह शारीरिक स्थितियों से बहुत अलग है, जहां गंध अणुओं वाष्प चरण में घ्राण उपकला तक पहुँचने और नाक mucosa में विघटन द्वारा ओआरएस को सक्रिय । करने के लिए और अधिक बारीकी से समान फिजिकली प्रासंगिक उत्तेजना जोखिम, sanz एट अल20 का प्रस्ताव एक एक प्लास्टिक सेल वेल्स के शीर्ष पर रखा फिल्म के भीतर का चेहरा नीचे लटका गंधंत समाधान की एक बूंद लगाने से भाप उत्तेजना के आधार पर परख । वे फ्लोरोसेंस तीव्रता की निगरानी के द्वारा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं दर्ज की गई । इस विधि पहले हवा चरण गंना उत्तेजना का उपयोग किया गया था, लेकिन यह एक बड़ी स्क्रीनिंग या सक्रियण की अनुमति नहीं थी ।

यहाँ, हम एक नया तरीका है कि सक्षम बनाता है वास्तविक समय निगरानी में विट्रो या सक्रियण के माध्यम से भाप चरण ओडोरेंट उत्तेजना Glosensor परख द्वारा विकसित (चित्रा 1). यह परख पहले तरल ओडोरेंट उत्तेजना के संदर्भ में इस्तेमाल किया गया है18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. luminometer की निगरानी चैंबर पहली थाली पढ़ने से पहले vaporized ओडोरेंट के साथ equilibrated है (चित्रा 1एक) । गंधी अणुओं तो बफर में विलायकयोजित रहे हैं, स्नान Hana3A कोशिकाओं को व्यक्त करने या ब्याज की, RTP1S और glosensor प्रोटीन (चित्रा 1बी). यदि गंदांत या के एक एगोनिस्ट है, या एक सक्रिय रचना को स्विच और बांध जीओएलएफ, adenylyl cyclase सक्रिय (एसी), और अंत में शिविर के स्तर को जंम के कारण । इस बढ़ती शिविर के लिए बाध्य और Glosensor प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए ल्यूसिफिनो उत्प्रेरित करना होगा । यह संदीप्ति तब संदीप्ति द्वारा दर्ज की गई है और सक्षम बनाता है या सक्रियण निगरानी । इस विधि के संदर्भ में उच्च ब्याज की है या deorphanization के रूप में यह odors की प्राकृतिक धारणा के करीब विट्रो सिस्टम में लाता है ।

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Protocol

1. Hana3A कोशिकाओं संस्कृति

  1. एक m10 तैयार (न्यूनतम आवश्यक मध्यम (mem) प्लस 10% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम (fbs)) और M10PSF (m10 प्लस १०० μg/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin और १.२५ μg/एमएल एम्फीटेरिसिन बी बी) ।
  2. संस्कृति 10 मिलीलीटर में M10PSF की एक १०० mm कोशिका संस्कृति डिश में एक इनक्यूबेटर सेट में कोशिकाओं ३७ ° c और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) ।
  3. एक 20% अनुपात में हर 2 दिन कोशिकाओं को विभाजित: जब १००% कोशिकाओं का संगम (लगभग १.१ एक्स 107 कोशिकाओं) एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है, मीडिया की ख्वाहिश और धीरे से कोशिकाओं को धोने फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) के 10 मिलीलीटर के साथ.
  4. महाप्राण पीबीएस और 3 मिलीलीटर की ०.०५% trypsin-एथिलीन डाइऐमीन tetraacetic एसिड (edta, ०.४८ मिमी) जोड़ें । लगभग 1 मिनट के लिए अधिनियम चलो, जब तक कोशिकाओं थाली से अलग करना ।
  5. M10 के 5 मिलीलीटर जोड़ें ट्रिपसिन निष्क्रिय करें सके और अंततः अभी भी ऊपर और नीचे pipetting द्वारा थाली से जुड़ी कोशिकाओं को अलग ।
  6. 5 मिनट के लिए २०० x g पर मात्रा (8 मिलीलीटर) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और केंद्रान्तरण के लिए स्थानांतरण Supernatant और M10PSF के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ऊपर और नीचे pipetting द्वारा किसी भी सेल द्रव्यमान को तोड़ने के लिए । ट्यूब में बुलबुले बनाने से बचें ।
  7. एक नए १०० mm सेल कल्चर डिश में resuspended कोशिकाओं के समाधान के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और ताजा M10PSF के 9 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ ° c और 5% CO2पर इनक्यूबेट ।

2. ट्रांफ्लेक्शन के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. संगम, या कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन, उन्हें एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत देख कर. 10% से कम संगम (लगभग १.१ x 106 कोशिकाओं) एक थाली के लिए आवश्यक है ।
  2. मीडिया को महाप्राण दें और 10 मिलीलीटर पीबीएस से कोशिकाओं को धीरे से धोएं । महाप्राण पीब्स और 3 मिलीलीटर EDTA जोड़ें । कमरे के तापमान पर लगभग 1 मिनट के लिए कार्य करते हैं, जब तक कोशिकाओं थाली से अलग करना ।
  3. M10 के 5 मिलीलीटर जोड़ें ट्रिपसिन निष्क्रिय करें सके और अंततः अभी भी ऊपर और नीचे pipetting द्वारा थाली से जुड़ी कोशिकाओं को अलग । 5 मिनट के लिए २०० x g पर मात्रा (8 मिलीलीटर) को 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें ।
  4. Supernatant और M10PSF के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से लटकाना ऊपर और नीचे pipetting द्वारा किसी भी कोशिका द्रव्यमान को तोड़ने के लिए । ट्यूब में बुलबुले बनाने से बचें ।
  5. प्लेटों की संख्या के आधार पर स्थानांतरित किया जा करने के लिए, एक जलाशय में M10PSF की उचित इसी मात्रा के साथ एक उचित मात्रा में स्थानांतरण । १ ९६-अच्छी तरह से थाली एक १००% के 1/10 के साथ चढ़ाया जाना चाहिए संगम १०० mm पकवान (लगभग १.१ x 106 कोशिकाओं) M10PSF में पतला 6 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए । १ ९६ के लिए अच्छी तरह से एक १००% संगम १०० मिमी पकवान के साथ शुरू प्लेट, resuspended कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर से ५०० μL जोड़ने के लिए ताजा M10PSF के ५.५ मिलीलीटर । कोशिकाओं को मिक्स और हवा बुलबुले पैदा किए बिना M10PSF ।
  6. Pipette निलंबित कोशिकाओं के ५० μl ९६ की एक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर थाली के प्रत्येक कुएं में । ३७ ° c और 5% CO2पर रात भर सेते ।

3. प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन

  1. 30% और ५०% के बीच एक सेल संगम आश्वस्त करने के लिए एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत ९६-कूप प्लेट का निरीक्षण करें ।
  2. तालिका 1में वॉल्यूम के बाद पूरी थाली (RTP1S, या और glosensor प्रोटीन, सामग्री तालिकादेखें) के लिए आम plasmids शामिल है कि एक पहली ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार करें. ध्यान दें कि Rho-टैग की मात्रा या ओआरएस की संख्या से विभाजित किया जाना चाहिए अगर कई ओआरएस ।
    नोट: हम पुरजोर सलाह एक खाली वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण (यहां Rho-pCI) और किसी भी सकारात्मक नियंत्रण (या परीक्षण ओगंलेंट का जवाब करने के लिए जाना जाता है) प्रयोग की योजना को जोड़ने के लिए ।
  3. एक दूसरा ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार करें जिसमें ५०० μl मेम और lipofectamine २००० अभिकर्मक के 20 μl (१ ९६ के लिए मांय-खैर प्लेट, सामग्री तालिकादेखें) । पहले एक के लिए दूसरा मिश्रण जोड़ें, और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इंक्यूबेट द्वारा मिश्रण । M10 के 5 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे मिश्रण ।
  4. M10PSF पहले प्लैटेड ९६-कूप प्लेट में अंतिम अभिकर्मक मीडिया के ५० μl द्वारा बदलें । ३७ ° c और 5% CO2 करने के लिए सेट एक इनक्यूबेटर में सेबेट और चरण 6 में वर्णित प्रक्रिया के बाद रात भर luminometer के चैंबर वैक्यूम ।

4. सब्सट्रेट ऊष्मायन

  1. ६०% और १००% के बीच एक सेल संगम आश्वस्त करने के लिए एक चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत ९६-कूप प्लेट का निरीक्षण करें । हैंक के संतुलित लवण विलयन (एचबीएसएस) का एक उद्दीपन घोल तैयार कीजिए जिसमें 10 मिमी हाइड्रोक्येथिल पाइपेररिनेटेनेथेस्फोनिक अम्ल (हेप्स) तथा डी-ग्लूकोस की 5 मिमी होती है ।
  2. शिविर अभिकर्मक की तनु ७५ μL ( सामग्री तालिका देखें) समाधान के २.७५ मिलीलीटर उत्तेजना समाधान के लिए । ९६-कूप प्लेट से ट्रांसजेक्शन माध्यम निकालें और प्रत्येक कुएं में ५० μL ताजा उत्तेजना समाधान जोड़कर कोशिकाओं को धोएं ।
  3. उत्तेजना समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से चरण ४.२ में तैयार शिविर अभिकर्मक समाधान के 25 μL जोड़ें । एक अंधेरे और गंध मुक्त वातावरण (उदाहरण के लिए, एक साफ खाली दराज तक रसायनों या किसी भी गंध स्रोत से दूर) में कमरे के तापमान पर ९६-कूप प्लेट के लिए 2 ज सेबेट ।

5. गंना उत्तेजना

  1. सबसे पहले, अस्थिर गंधमादक अणुओं के साथ luminometer चैंबर equilibrate । ओडोरेंट को 10 मिलीलीटर खनिज तेल में वांछित सांद्रता से पतला करें (चित्र 2क) । शिविर अभिकर्मक ऊष्मायन समय के अंत से पहले, एक नया ९६-कूप प्लेट (नहीं कोशिकाओं युक्त एक) में गंजेंत समाधान के 25 μL जोड़ें । 5 मिनट के लिए luminometer चैंबर में कमरे के तापमान पर इस गंधमादक थाली सेते (चित्रा 2बी) (कोई luminometer रिकॉर्डिंग यहां की आवश्यकता है) ।
  2. Luminometer सेट के साथ ९० की थाली मापन के 20 चक्रों के दौरान देरी के 0 एस के साथ संदीप्ति रिकॉर्ड ०.७ s चक्र के बीच अंतराल के ।
  3. सही थाली पढ़ने से पहले, गंना प्लेट को चैम्बर से निकाल दें । ९६ अच्छी तरह से कोशिकाओं युक्त थाली के कुओं के बीच गंवार के 25 μl जोड़ें (कक्षों वाले कुओं में गंना जोड़ नहीं है) और जल्दी से 30 मिनट के भीतर 20 चक्रों के लिए सभी कुओं की संदीप्ति माप शुरू (चित्रा 2सी) ।

6. Luminometer के अंदर शेष गंदांत के हटाने

  1. ज्योमीटर का दरवाजा खोलो । वैक्यूम पंप से जुड़े ट्यूब डालें ।
  2. रीडिंग चैंबर में वैक्यूम गंधक बड़े पैमाने पर (कम से कम 2 घंटे, अधिमानतः रातोंरात) दो गंध के बीच एक प्रयोग से एक और करने के लिए गंध volatiles के पार संदूषण से बचने के लिए । अगले गंना को इनक्यूबैटिंग करने से पहले 5 मिनट के दौरान संपीड़ित हवा भेजकर ताजी हवा से बदलें ।

7. डेटा विश्लेषण

  1. Luminometer सॉफ्टवेयर से डेटा निर्यात ।
  2. एक ही या प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय के लिए प्रतिकृति औसत । किसी भी अंतिम नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत या प्रतिसाद की गणना करें (उदा., रिक्त वेक्टर, चित्रा 3एक और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग) नियंत्रण का औसत मूल्य प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय पर या औसत मान को विभाजित करके (चित्र 3B और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग) ।
  3. प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय प्रतिक्रिया करने के लिए औसत या प्रतिक्रिया 0 s पर विभाजित करके प्रत्येक या उनके बेसल गतिविधि करने के लिए प्रतिक्रिया सामान्य ( चित्रा 3सी और प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें).
  4. प्रत्येक के वक्र के तहत क्षेत्र की गणना या एक एकल या प्रतिक्रिया मान प्राप्त करने के लिए । ऐसा करने के लिए, प्रत्येक के लिए प्रत्येक रिकॉर्डिंग समय के सभी संदीप्ति मूल्यों योग या ।

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Representative Results

हम तीन माउस ओआरएस, Olfr746, Olfr124 और सिनेमाल्डिहाइड वाष्प उत्तेजना का उपयोग कर Olfr1093 की प्रतिक्रिया की जांच की (चित्रा 3) । इसके साथ ही, हम एक खाली वेक्टर नियंत्रण (Rho-पीसीआईघड़ी) का इस्तेमाल किया आश्वासन दिया है कि ओडोन्ट-परीक्षण ओआरएस के प्रेरित गतिविधियों विशिष्ट थे (चित्रा 3ए) । वाष्प गंध उत्तेजना पर ओआरएस की वास्तविक समय सक्रियण 20 मापन चक्र पर नजर रखी थी । प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए डेटा पहले खाली सदिश नियंत्रण के लिए सामांयीकृत थे प्रत्येक चक्र के लिए औसत मूल्य (चित्रा 3बी) । यह ध्यान दें कि ओआरएस एक या-निर्भर तरीके से इस परख में बेसल गतिविधि के चर स्तर दिखा सकते है महत्वपूर्ण है और यह भी इस पैरामीटर के लिए अपनी प्रतिक्रिया को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है (चित्रा 3सी). एक का औसत मूल्य या एक टी = 0 एस पर अपनी प्रतिक्रिया से विभाजित किया जा सकता है, के लिए ओआरएस के बीच की तुलना की अनुमति । प्रत्येक के लिए एकल सक्रियण मान या प्रत्येक के लिए वक्र (AUC) के अंतर्गत क्षेत्र की गणना करके या सभी मापन चक्र मानों को जोड़कर परिकलित किया जा सकता है (चित्र 3D) ।

अतिरिक्त रूप से, खुराक पर निर्भर प्रतिक्रियाओं को बढ़ती गंवार खुराकों का उपयोग कर इस विधि का उपयोग करके मापा जा सकता है । हम एक ही प्रक्रिया के बाद acetophenone उत्तेजना दर्ज की Olfr1377 की प्रतिक्रिया प्रस्तुत (चित्रा 4). Acetophenone अस्थिरता अपने वाष्प दबाव है, जो 25 डिग्री सेल्सियस पर ०.४४ mm Hg के बराबर है द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । एक दिए गए तापमान पर, एक उच्च वाष्प दबाव रखने गंदान्त एक कम वाष्प दबाव के साथ एक गंदाहट की तुलना में अधिक अस्थिर है । एसीटोफेनोन, परिणाम में, एक मध्यम वाष्पशील ओडोरेंट है और शुद्ध कोशिका के संपर्क में है और 10-2, 10-4, 10-6 और 10-8पर पतला है । केवल तीन उच्च सांद्रता (शुद्ध, 10-2 और 10-4) को सक्रिय करने में सक्षम है Olfr1377 (चित्रा 4ए) । हम यह भी ध्यान दे सकते है कि शुद्ध यौगिक उत्तेजना एक प्रवृत्ति से पता चलता है या समय के दौरान प्रतिक्रिया में कमी, संभावना कोशिका विषाक्तता के कारण, के रूप में यह एक हाल ही में३२प्रकाशन में eugenol के लिए दिखाया गया है । फिर भी, हम Olfr1377 की एक ठेठ खुराक निर्भरता व्यवहार का पालन कर सकते हैं (चित्रा 4बी), दिखा रहा है कि इस विधि के लिए या अस्थिर यौगिक के लिए EC50 का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.

ध्यान दें कि जब खुराक पर निर्भर प्रयोगों प्रदर्शन कर रहे हैं, हम निर्वात नहीं luminometer चैंबर साफ. हालांकि, प्रयोगों हमेशा कम से उच्च करने के लिए किया जाता है, contaminations को कम करने के लिए गंध की खुराक में वृद्धि. इसके अलावा, सेल मीडिया में गंध अणुओं की वास्तविक एकाग्रता ज्ञात नहीं है, के बाद से इस विधि द्वारा प्राप्त EC50s तरल उत्तेजना से प्राप्त उन लोगों के लिए जरूरी तुलनीय नहीं हैं । EC50 हमारे विधि द्वारा निर्धारित मूल्यों को ध्यान में गंघीय अस्थिरता, माध्यम में गंना विघटन की कैनेटीक्स, है गंधकारी घुलनशीलता, और गंना और या, जो गंध के प्राकृतिक धारणा के करीब है के बीच आत्मीयता । Acetophenone द्वारा Olfr1377 उत्तेजना के हमारे उदाहरण के लिए, हमारे वाष्प खुराक से EC50 मूल्य-प्रतिक्रिया १६१ μM (०.००१८७४%), जो लगभग ५० तरल उत्तेजना से अधिक गुना है (Saito एट अल.6से ३.२८ μm) । तरल और वाष्प stimulations के बीच यह अंतर भी Sanz एट अल20 द्वारा उनके वाष्प उत्तेजना परख में सूचित किया गया था, जहां भाप उत्तेजना १०० १००० गुना कम तरल उत्तेजना से EC50 मूल्यों दिया ।

Figure 1
चित्रा 1 : वाष्प् त गंधक द्वारा गंधक रिसेप्टर सक्रियण के वास्तविक समय की निगरानी के सिद्धांत । (क) ९६-कूप प्लेट को गंध (वायलेट बादल) ल्यूममीटर चैम्बर के साथ पहले से ही साम्य में रखा गया था । (ख) सेल मीडिया बफर की सतह पर वाष्णित ओडोरेंट अणु (वायलेट) Hana3A कोशिका झिल्ली की सतह पर या गुहा तक पहुँचने के लिए इसे में भंग कर दिया । गौण प्रोटीन RTP1S (ग्रे) के रूप में अच्छी तरह से transfected, के लिए या की कोशिका सतह अभिव्यक्ति एहसान था । यदि गंदांत अणु एक या एगोनिस्ट था, या एक सक्रिय राज्य के लिए बंद है और जीओएलएफबाध्य, adenylyl cyclase (एसी) और चक्रीय AMP के उत्पादन (शिविर, ग्रीन) के सक्रियण ट्रिगर । Glosensor प्रोटीन (luciferase) के पास शिविर के लिए एक बाध्यकारी साइट है कि, एक बार बाध्य, प्रोटीन बांधने के लिए अनुमति देता है इसके ligand, luciferase (पीला). अंतिम जटिल glosensor प्रोटीन/ल्यूकेफिइन/शिविर का उत्पादन किया है कि या सक्रियण पर नजर रखने के लिए रिकॉर्ड किया गया था संदीप्ति. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : Vapored गंधक द्वारा गंधक रिसेप्टर सक्रियण के वास्तविक समय की निगरानी के लिए योजनाबद्ध प्रोटोकॉल । गंध (वायलेट) खनिज तेल (ए) में वांछित एकाग्रता पर पतला था । समाधान तो एक नया ९६-अच्छी थाली है, जो luminometer चैंबर में 5 मिनट के लिए रखा गया था में चढ़ाया गया था vapored गंधमादक के साथ मात्रा equilibrate को ९६ transfected निगरानी से पहले अच्छी तरह से थाली (बी) । गंवार समाधान transfected ९६ के कुओं के बीच प्रत्येक अंतरिक्ष में pipetted था अच्छी तरह से थाली (ज़ूम देखें) । इसके बाद यह प्लेट 20 चक्रों के लिए luminometer चैंबर समलिब्रित वाष्प गंदांत (सी) में पढ़ा गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : सामांयीकरण का उदाहरण जो डेटा रिकॉर्डिंग के बाद किया जा सकता है । (क) कोशिकाओं के किसी संभावित गैर या विशिष्ट गंध सक्रियणों की पहचान करने में सक्षम होने के लिए ट्रांसजेक्शन योजना में एक खाली वेक्टर (नकारात्मक) नियंत्रण डाला गया था । यह भी थाली की पृष्ठभूमि संदीप्ति पर जानकारी प्रदान की है । (इ) प्रत्येक अथवा अनुक्रिया को प्रत्येक प्लेट में नियंत्रण सदिश के औसत मूल्य द्वारा प्रत्येक कूप के उत्सर्जन मूल्य को विभाजित करके सामान्यीकृत किया गया था । प्रत्येक के संदीप्ति मान या फिर मापन चक्रों के साथ औसत थे । (ग) या प्रतिक्रियाओं को भी फिर उनके बेसल गतिविधि के लिए सामांयीकृत किया जा सकता है और प्रत्येक चक्र के मूल्य के औसत मूल्य के मापन के 1st चक्र (t = 0 s) । (घ) एओसी की गणना प्रत्येक मापन चक्र के उत्सर्जन मानों को संक्षेप में करके की जा सकती है । B, C और D के लिए, त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM, n = 3) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . खुराक निर्भर प्रतिक्रियाओं का उदाहरण विधि के साथ प्राप्त की । (क) एसिटोफेनोन के Olfr1377 की प्रतिक्रिया खनिज तेल (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8), और बिना गंध (0) में पांच विभिन्न dilutions के लिए दर्ज किया गया था, और के बाद सामान्यीकृत सामान्यीकरण प्रोटोकॉल चित्र 3में दिखाया गया है । (ख) मापन चक्रों के दौरान डेटा का प्रत्येक तनुकरण के लिए एक auc मान में अनुवाद किया गया था । यह आंकड़ा Kida एट अल३२से संशोधित किया गया है । यह आंकड़ा एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण ४.० इंटरनेशनल (४.० द्वारा CC) के तहत लाइसेंस प्राप्त है । त्रुटि पट्टियां माध्य (SEM, n = 3) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

प्रति ९६-कूप प्लेट
Mem ५०० μL
pGlosensor 10 एनजी
RTP1S 5 एनजी
या ७५ एनजी

तालिका 1: ट्रांसफैक्शन के लिए मिश्रण । Plasmids की मात्रा (Glosensor प्रोटीन, RTP1S और या) १ ९६-अच्छी तरह से थाली करने के लिए transfect करने के लिए MEM में जोड़ने के लिए ।

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Discussion

गंध की धारणा मूल रूप से ओआरएस के सक्रियण पर निर्भर है । नतीजतन, उनकी कार्यक्षमता की समझ के लिए जटिल तंत्र है कि मस्तिष्क को अपने अस्थिर रासायनिक पर्यावरण अनुभव का उपयोग दरार की आवश्यकता है । हालांकि, इस प्रक्रिया की समझ के लिए एक मजबूत विधि स्थापित करने में कठिनाइयों द्वारा बाधित किया गया है इन विट्रो में गंध के खिलाफ कार्यशीलता के लिए या प्रदर्शनों की सूची। ओएनएस के कोशिका सतह और विषमजात अभिव्यक्ति आंशिक रूप से टैग रिसेप्टर्स13,19 के निर्माण के द्वारा और खोज और रिसेप्टर परिवहन प्रोटीन (rtps) के अनुकूलन के द्वारा हल किया गया है osns में व्यक्त22 , 23. पहले स्क्रीनिंग अध्ययन तो दिखाई दिया, हमारी समझ या समारोह के लिए नई अंतर्दृष्टि लाने जैसे उनके गंधकारी मांयता पैटर्न6,7,26,३३, सक्रियकरण तंत्र३४,३५, सैद्धांतिक त्रिआयामी संरचना३६,३७, विकास३८,३९, गंध अंतरिक्ष४०,४१, ४२, और गंध का पता लगाने में निहितार्थ४३,४४,४५,४६। हमें विश्वास है कि इन विट्रो तरीकों में सुधार गंध कोडिंग के गूढ़ रहस्य बढ़ावा सकता है । जैसे, हम यहां एक नया कार्यात्मक परख विकसित करने की निगरानी या vaporized ओगंती अणुओं द्वारा सक्रियण की अनुमति ।

इस विधि की सफलता कई महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करता है । हालांकि हाल के वर्षों में सुधार, कुछ ओआरएस के heterologous अभिव्यक्ति मुश्किल है, जो प्रभावित या गंदापन के लिए जवाबदेही हो सकती है । कोशिका झिल्ली पर ओआरएस की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन एक समानांतर प्रयोग में किया जा सकता है । ध्यान दें कि सतह अभिव्यक्ति का निंन स्तर अभी भी heterologous सेल सिस्टंस३५में मजबूत प्रतिक्रियाएं मौजूद कर सकते हैं । एक और महत्वपूर्ण बिंदु को गंना संदूषण से बचने के लिए है । इस परख की संवेदनशीलता को देखते हुए, किसी भी इत्र, भोजन, या पिछले परख से गंध अणुओं अनियंत्रित या प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण द्वारा प्रयोग अपवित्र कर सकते हैं । यही कारण है कि हम के लिए luminometer के चैंबर निर्वात की सलाह कम से कम 2 एच, अधिमानतः रातोंरात, एक अलग गंधमादक के साथ एक परख प्रदर्शन से पहले । यह भी प्रयोग में इस्तेमाल किया गंना की एक संभावित साइटोटॉक्सिसिटी पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । की प्रतिक्रिया की एक संभावित कमी या 30 मिनट की निगरानी के दौरान दिखा सकते है कि गंना ही कोशिका स्वास्थ्य पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है । गंना साइटोटॉक्सिसिटी एक कोशिका व्यवहार्यता परख करने के बाद गंना कोशिकाओं को उजागर करके मूल्यांकन किया जा सकता है । इस समस्या को कम करने के लिए, डेटा के विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग समय के केवल पहले 10 मिनट पर विचार करने के लिए संभव है, अंत फसल. हमने देखा कि गंना विषाक्तता मुख्य रूप से तब होता है जब गंध शुद्ध या बहुत उच्च सांद्रता पर परीक्षण किया है । हमारे परख की संवेदनशीलता गंध का पता लगाने की अनुमति देता है खनिज तेल में पतला । अधिकतम प्रतिक्रिया प्रकाश में लाने के लिए इष्टतम एकाग्रता एक गंदापन से दूसरे करने के लिए भिन्न होता है, लेकिन हम एक 1% कमजोर पड़ने के एक या प्रतिक्रिया३२की एक संतृप्ति प्रकाश में लाना करने के लिए पर्याप्त है कि देखा. हालांकि, कुछ गंध अणुओं कम वाष्प दबाव के अधिकारी कर सकते हैं (और इसलिए कम अस्थिरता) और प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए किया जा करने के लिए कुछ समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. यहां के luminometer चैंबर में गंधमादक का ऊष्मायन समय 5 मिनट के लिए सेट है । हम यह मान लिया कि समय की इस राशि के लिए गंध वाष्पशील अणुओं के साथ चैंबर equilibrate करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन कम अस्थिरता गंध अब ऊष्मायन समय की आवश्यकता हो सकती है ।

इन महत्वपूर्ण बिंदुओं के अलावा, इस विधि की संरचना की खोज करने के लिए कई नई संभावनाएं लाता है-गंना-या बातचीत के समारोह संबंधों । इस विधि का वास्तविक समय निगरानी पहलू भी घटनाओं है कि एक गंध धारणा के दौरान घटित की कैनेटीक्स की समझ के लिए अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में, हम एक metabolite एंजाइम की कार्यक्षमता का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, कार्बोक्सिल esterase 1d (Ces1d), स्तनधारियों४७के घ्राण म्यूकोसा में व्यक्त किया जा पाया. इस एंजाइम को एस्टर को कार्बोक्सिलिक अम्ल और अल्कोहल४८में परिवर्तित करने के लिए जाना जाता है । Ces1d के सह transfection में एक मॉडुलन दिखाया विट्रो या जवाब एस्टर यौगिकों के लिए,३२ का प्रदर्शन है कि इस नए प्रोटोकॉल गंधंत का पता लगाने में चयापचय एंजाइमों के महत्व की खोज में कुशल है । इसके अलावा, odors मिश्रण की जांच करने के लिए इस मंच का उपयोग, और जिस तरह से गंध और अधिक प्राकृतिक रहे है कि सेटिंग्स में प्रस्तुत कर रहे हैं, अधिक जटिल गंधों बातचीत को समझने में भविष्य के अध्ययन को सक्षम करेगा । अंत में, ओर द्वारा गंध अणुओं का पता लगाने के भी एक गंध संवेदक के विकास में उच्च ब्याज की है । दिखा रहा है कि हमारी प्रणाली गंवार एक वाष्प चरण में प्रस्तुत अणुओं का पता लगा सकते हैं, इस विधि एक लघुकृत biosensor के विकास की प्रक्रिया में एक पहला कदम है ।

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Disclosures

Y.F., H. K और एच. एम. एक पेटेंट आवेदन 27 अक्टूबर २०१६ पर इस काम के लिए प्रासंगिक दायर की ।

Acknowledgments

यह काम NIH (DC014423 और DC016224) और रक्षा उंनत अनुसंधान परियोजना एजेंसी RealNose परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया । YF सामरिक अंतरराष्ट्रीय नेटवर्क आगे बढ़ाने के लिए प्रतिभाशाली शोधकर्ताओं (R2801) के संचलन में तेजी लाने के लिए JSPS कार्यक्रम से वित्तीय सहायता के साथ ड्यूक विश्वविद्यालय में रहे । हम सहर कलीम को पांडुलिपि के संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

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References

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de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

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