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Neuroscience

In-vitro-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch einen Geruchsstoff in der Dampfphase in Echtzeit

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Physiologisch werden durch Geruchsstoff Moleküle in der Dampfphase eingeatmet Geruchsstoff Rezeptoren aktiviert. Jedoch verwenden die meisten in-vitro-Systeme Flüssigphase Geruchsstoff Stimulation. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die erlaubt, in-vitro-Echtzeitüberwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung bei Geruchsstoff Stimulation in der Dampfphase.

Abstract

Olfaktorischen Wahrnehmung beginnt mit dem Zusammenspiel von Riechstoffen mit Duftstoff-Rezeptoren (oder) durch olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSN) ausgedrückt. Geruch-Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff kann eine Kombination von Regionen in äußerster Randlage zu aktivieren. Organismen können durch solche kombinatorische Codierung erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. So kann ein Geruch in einer bestimmten Konzentration beschrieben werden durch ein Aktivierungsmuster von Regionen in äußerster Randlage, die ist spezifisch für jeden Geruch. In diesem Sinne knacken die Mechanismen, die das Gehirn benutzt, um Geruch erfordert Verständnis Geruchsstoff wahrnehmen-OR-Interaktionen. Deshalb die Geruchssinn Gemeinschaft verpflichtet "diese Rezeptoren de-orphanize" ist. Konventionellen in-vitro-Systeme zur Identifizierung von Duftstoff- oder Wechselwirkungen verwendet haben Inkubation Zelle Medien mit Duftstoff, die unterscheidet sich von der natürlichen Erkennung von Gerüchen über Dampf Geruchsstoffe Auflösung in Nasenschleimhaut vor Interaktion mit ORs. Hier beschreiben wir eine neue Methode, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der OR-Aktivierung per Dampfphase Geruchsstoffe. Unsere Methode basiert auf Messung cAMP Freigabe durch Lumineszenz unter Verwendung der Glosensor-Assay. Es überbrückt Lücken zwischen in vivo und in-vitro-Ansätzen und bildet die Grundlage für eine biomimetische flüchtiger chemischer Sensor.

Introduction

Der Geruchssinn ermöglicht terrestrischen Tieren interagieren mit ihren flüchtigen chemischen Umgebung Laufwerk Verhalten und Emotionen. Grundsätzlich beginnt die Geruch-Erkennung mit dem allerersten Zusammenspiel von Geruchsstoff Moleküle mit dem olfaktorischen System auf der Ebene der Geruchsstoff Rezeptoren (ORs)1. Bei Säugetieren sind individuell olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel2Regionen in äußerster Randlage zum Ausdruck gebracht. Sie gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) Familie und genauer auf die Rhodopsin-ähnliche Unterfamilie (auch als Klasse A). Regionen in äußerster Randlage paar mit der stimulierende G Protein GOlf deren Aktivierung zu Lager Produktion, gefolgt von der Eröffnung der zyklische Nukleotid geschlossene Kanäle und die Erzeugung von Aktionspotentialen führt. Es wird angenommen, dass ein Geruch der Wahrnehmung stützt sich auf ein bestimmtes Muster von aktivierten ORs3,4 und deshalb Geruch Anerkennung folgt eine kombinatorische Codierschema, wo ein OR kann durch eine Reihe von Geruchsstoffen aktiviert werden und ein Geruchsstoff aktivieren kann ein Kombination von Regionen in äußerster Randlage. Und durch solche kombinatorische Codierung wird postuliert, daß Organismen erkennen und unterscheiden können zwischen einer Vielzahl von flüchtigen Geruchsmoleküle. Ist einer der Schlüssel zum Verständnis, wie Gerüche wahrgenommen werden, zu verstehen wie und die Regionen in äußerster Randlage sind durch einen bestimmten Geruch aktiviert.

In einem Versuch, Geruchsstoff aufzuklären- oder Wechselwirkungen, in-vitro-funktionelle Untersuchungen eine wesentliche Rolle gespielt haben. Die Identifizierung der Agonist duftende Liganden für Waise ORs (OR de Orphanization) ist seit den letzten zwanzig Jahren durch den Einsatz von verschiedenen in-vitro-, ex-Vivo- und in-vivo funktionelle Assays5,6,7 ein sehr aktives Feld ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

In-vitro-Test-Systeme eignen sich am besten für die detaillierte funktionelle Charakterisierung der Regionen in äußerster Randlage, einschließlich Ermittlung der Funktionsbereiche und kritische Rückstände von Regionen in äußerster Randlage sowie mögliche technische Anwendungen. Jedoch hat weitere wertvolle in-vitro-Systeme für Regionen in äußerster Randlage eine Herausforderung, im Teil wegen Schwierigkeiten mit der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten und funktionelle Expression von ORs in heterologen Zellen entwickelt. Die erste Herausforderung gewesen, Protokolle zu etablieren, die für die Zelle Oberflächenexpression von funktionalen ORs in der Zuordnung der Geruchsstoff erlaubt-OR-Interaktionen. Eine Reihe von unabhängigen Gruppen haben verschiedene Ansätze5,6,7,8,9,10,11,12genutzt, 14,18,19,20. Eine der frühesten Errungenschaften wurde von Krautwurst Et Al. in der N-Terminus von Regionen in äußerster Randlage mit einem verkürzten Abfolge von Rhodopsin (Rho-Tag) markiert und eine verbesserte Oberflächenexpression in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen13beobachtet. Variationen gemacht, um den Tag angebracht, die OR-Sequenz ist immer noch ein Weg zur Verbesserung der OR Ausdruck und Funktionalität19,21erkundet. Saito Et Al. dann Rezeptor-der Transport von Protein 1 (RTP1) identifiziert und RTP2 die OR Handel erleichtern. 22 eine kürzere Version des RTP1, genannt RTP1S, hat auch gezeigt, sogar wirksamer als die ursprüngliche Protein23sein. Die Entwicklung einer Zelllinie (Hana3A), stabil GOlfausdrückt, REEP1, RTP1 und RTP2 24, gepaart mit dem Einsatz der zyklischen Adenosin Monophosphate (cAMP) Reporter ermöglichte Identifizierung der Duftstoff-OR-Interaktionen. Der Mechanismus, durch die die RTP-Familie von Proteinen fördert die Zelle Oberflächenexpression von Regionen in äußerster Randlage bleibt bestimmt werden.

Ein Nachteil dieser etablierten Methoden ist, dass sie verlassen sich auf Geruchsstoff Stimulation in der flüssigen Phase, d.h. Geruchsstoffe werden vorab in einer Stimulation Medium aufgelöst und stimulieren Zellen durch das Medium zu ersetzen. Dies unterscheidet sich sehr von den physiologischen Bedingungen wo Geruchsstoff Moleküle erreichen das Riechepithel in der Dampfphase und ORs durch Auflösung in der Nasenschleimhaut zu aktivieren. Um mehr physiologisch relevanten Reiz Belichtung ähneln, schlug Sanz Et Al.20 einen Assay basierend auf Dampf Stimulation durch die Anwendung eines Tropfen Duftstoff Lösung hängen unter der Innenfläche aus einer Kunststofffolie auf Zelle Brunnen gelegt. Sie nahmen die Kalzium-Reaktionen durch die Überwachung der Fluoreszenzintensität. Diese Methode war die erste Luft-Phase Geruchsstoff Stimulation verwenden, aber es war es nicht möglich eine große Vorführung der OR-Aktivierung.

Hier entwickelten wir eine neue Methode, die es ermöglicht Echtzeit-Überwachung von in-vitro-OR-Aktivierung über Dampf Phase Geruchsstoff Stimulation durch die Glosensor-Assay (Abbildung 1). Dieser Test hat früher im Zusammenhang mit der flüssigen Duftstoff Stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. Überwachung Handelskammer die Luminometer ist zunächst equilibriert mit verdampftem Geruchsstoff vor der Platte lesen (Abb. 1A). Duftstoff-Moleküle sind dann solvatisierte in den Puffer, Baden Hana3A Zellen mit dem Ausdruck oder der Zinsen, RTP1S und die Glosensor Proteine (Abbildung 1B). Wenn der Geruchsstoff ein Agonist des OPS ist, wird OP wechseln Sie zu einer aktivierten Konformation GOlf, Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) zu binden und letztlich dazu führen, dass cAMP Stufen zu steigen. Diese steigende Campingplätze zu binden und aktivieren das Glosensor Protein um Lumineszenz katalysieren Luciferin zu generieren. Diese Lumineszenz wird dann durch die Luminometer aufgezeichnet und OR Aktivierung Überwachung ermöglicht. Diese Methode ist von großem Interesse im Rahmen der OR Deorphanization, da es die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen in-vitro-Systeme näher bringt.

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Protocol

(1) Hana3A Zellen Kultur

  1. Bereiten Sie M10 (Minimum wesentliches Medium (MEM) zuzüglich 10 % V/V fetalen bovine Serum (FBS)) und M10PSF (M10 plus 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B).
  2. Kulturzellen Sie in 10 mL M10PSF in der Kulturschale 100 mm Zelle in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) festgelegt.
  3. Alle 2 Tage bei einem Verhältnis von 20 % der Zellen zu teilen: Wenn 100 % Zusammenfluss von Zellen (ca. 1,1 x 107 Zellen) unter dem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet wird, streben die Medien und die Zellen sanft mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu waschen.
  4. Aspirieren Sie PBS und 3 mL 0,05 % Trypsin-Ethylen-Diamin-Tetraacetic Säure (EDTA, 0,48 mM). Lassen Sie ca. 1 min einwirken, bis die Zellen von der Platte zu distanzieren.
  5. Fügen Sie 5 mL M10 zu inaktivieren die Trypsin und schließlich lösen die Zellen noch durch Pipettieren rauf und runter an der Platte befestigt.
  6. Übertragen Sie die Lautstärke (8 mL) auf eine 15 mL-Tube und Zentrifugieren bei 200 X g für 5 min. Aspirat überstand und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL M10PSF von oben und unten, um jede Zelle Masse brechen pipettieren. Vermeiden Sie Luftblasen in der Röhre.
  7. Überführen Sie 1 mL der Lösung resuspendierte Zellen in eine neue Zelle Kulturschale 100 mm und 9 mL frisches M10PSF. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.

2. Vorbereitung der Zellen zur Transfektion

  1. Bewerten Sie Zusammenfluss oder die Anzahl der Zellen, indem sie unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zu beobachten. Mindestens 10 % Zusammenfluss (ca. 1,1 x 106 Zellen) braucht man für eine Platte.
  2. Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen sanft mit 10 mL PBS. Aspirieren Sie PBS und 3 mL EDTA. Lassen Sie für etwa 1 min bei Raumtemperatur, handeln, bis die Zellen von der Platte zu distanzieren.
  3. Fügen Sie 5 mL M10 zu inaktivieren die Trypsin und schließlich lösen die Zellen noch durch Pipettieren rauf und runter an der Platte befestigt. Die Lautstärke (8 mL) eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min zu übertragen.
  4. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL M10PSF von oben und unten, um jede Zelle Masse brechen pipettieren. Vermeiden Sie Luftblasen in der Röhre.
  5. Abhängig von der Anzahl der Platten zu transfiziert werden übertragen einer entsprechenden Menge an Zellen in einem Stausee mit dem richtigen entsprechenden Volumen des M10PSF. Eine 96-Well-Platte sollte mit 1/10 der 100 % konfluierende 100 mm Platte (ca. 1,1 x 106 -Zellen) in M10PSF zu einem Gesamtvolumen von 6 mL verdünnt plattiert. Fügen Sie für eine 96-Well-Platte mit einer 100 % Zusammenfluss 100 mm Schale ab 500 µL aus 5 mL resuspendierte Zellen 5,5 mL frisches M10PSF hinzu. Mischen Sie die Zellen und M10PSF ohne Luftblasen zu generieren.
  6. Pipette 50 µL der suspendierten Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette. Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.

(3) Plasmid Transfektion

  1. Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop einen Zelle Zusammenfluss zwischen 30 % und 50 % versichern.
  2. Bereiten Sie eine erste Transfektion Mischung, die die Plasmiden üblich, die gesamte Platte enthält (RTP1S, oder und Glosensor Protein, siehe Tabelle of Materials) nach Volumen in Tabelle 1. Beachten Sie, dass die Menge der Rho-Tags OR sollten geteilt durch die Anzahl der Regionen in äußerster Randlage, wenn mehrere Regionen in äußerster Randlage.
    Hinweis: Wir dringend Beratung der Experiment-Plan eine leerer Vektor Negativkontrolle (hier Rho-pCI) und eine Positivkontrolle (OR bekannt reagieren auf den getesteten Geruchsstoff) hinzu.
  3. Bereiten Sie eine zweite Transfektion Mischung mit 500 µL MEM und 20 µL des Reagenz Lipofectamine 2000 (gültig für eine 96-Well-Platte, siehe Tabelle der Materialien). Erstens, die zweite Mischung hinzufügen und vorsichtig von oben und unten Pipettieren mischen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. 5 mL M10 hinzugeben und vorsichtig mischen.
  4. Ersetzen Sie die M10PSF in die zuvor einengender 96-Well-Platte von 50 µL der endgültigen Transfektion Medien. Brüten in einem Inkubator auf 37 ° C und 5 % CO2 und Vakuum-Kammer Luminometer Übernachtung folgende in Schritt 6 beschrieben.

(4) Substratinkubation

  1. Beobachten Sie die 96-Well-Platte unter dem Phasenkontrast-Mikroskop einen Zelle Zusammenfluss zwischen 60 % und 100 % versichern. Bereiten Sie eine Stimulation Lösung von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 10 mM Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) und 5 mM D-Glucose.
  2. 75 µL des Lagers Reagenz zu verdünnen (siehe Table of Materials) Lösung für 2,75 mL der Lösung Stimulation. Die Transfektion Medium aus der 96-Well-Platte entfernen und Waschen der Zellen durch Zugabe von 50 µL frische Stimulation Lösung in jede Vertiefung.
  3. Entfernen Sie die Stimulation-Lösung und fügen Sie 25 µL cAMP Reagenzlösung in Schritt 4.2 in jede Vertiefung vorbereitet hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte bei Raumtemperatur in einer dunklen und Geruchs-Umgebung (z. B. einer leeren Schublade fernab von Chemikalien oder einer beliebigen Geruchsstoff Quelle) für 2 h.

5. Geruchsstoff Stimulation

  1. Erstens equilibrate Luminometer Kammer mit flüchtigen Geruchsstoff Moleküle. Verdünnen Sie den Geruchsstoff, die gewünschte Konzentration in 10 mL von Mineralöl (Abb. 2A). Fügen Sie vor dem Ende der Inkubationszeit cAMP Reagenz 25 µL der Duftstoff-Lösung in eine neue 96-Well-Platte (nicht den mit den Zellen). Inkubieren Sie diese Geruchsstoff Platte bei Raumtemperatur in der Luminometer Kammer für 5 min (Abbildung 2B) (keine Luminometer Aufnahme ist hier erforderlich).
  2. Setzen die Luminometer aufzunehmen die Lumineszenz mit 0 s Verzögerung während 20 Zyklen der Platte Messung von 90 s mit 0,7 s des Intervalls zwischen den Zyklen.
  3. Direkt vor dem Lesen der Plattenrandes, entfernen Sie die Geruchsstoff aus der Kammer. 25 µL Geruchsstoff zwischen den Brunnen von den 96-Well-Platte mit den Zellen (den Geruchsstoff in den Vertiefungen der Zellen nicht hinzufügen) hinzufügen und schnell beginnen die Lumineszenz-Messung alle Brunnen für 20 Zyklen innerhalb von 30 min (Abbildung 2C).

6. Entfernung der restlichen Geruchsstoff innerhalb der Luminometer

  1. Öffnen Sie die Tür von der Luminometer. Legen Sie das Rohr an der Vakuumpumpe angeschlossen.
  2. Vakuum Geruchsstoffe in der Lesung Kammer ausführlich (mindestens 2 Stunden, am besten über Nacht) zwischen zwei Geruchsstoffe Kreuzkontamination von Volatiles Geruch aus einem Experiment zum anderen zu vermeiden. Ersetzen Sie durch Frischluft per Druckluft während 5 min vor den nächsten Geruchsstoff bebrüten.

7. die Datenanalyse

  1. Exportieren Sie die Daten aus der Luminometer Software.
  2. Durchschnitt der Wiederholungen desselben oder für jede Aufnahme. Berechnen Sie die normalisierten OR Reaktion auf eventuelle Steuerelemente (z. B. leerer Vektor, Abbildung 3A und repräsentative Ergebnisse Abschnitt) durch Division der gemittelt Kontrollwert in den OP Wert bei jeder Aufnahme (Abbildung 3Bgemittelt und repräsentative Ergebnisse Abschnitt).
  3. Normalisieren der einzelnen OR auf ihre basale Aktivität dividiert die gemittelte OR Antwort auf 0 s zu jeder Aufnahme Zeitverhalten (siehe Abbildung 3C und repräsentative Ergebnisse Abschnitt).
  4. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve jeder OP, einen einzelnen Wert oder Antwort zu erhalten. Dazu addieren Sie die Lumineszenz-Werte jedes Aufnahmezeit für jede OP.

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Representative Results

Wir sehen die Reaktion der drei Maus ORs, Olfr746, Olfr124 und Olfr1093 mit Zimtaldehyd Dampf Stimulation (Abbildung 3). Gleichzeitig verwendet wir eine leere Vektorregelung (Rho-pCI) um sicherzustellen, dass die Duftstoff-induzierten Aktivitäten der getesteten Regionen in äußerster Randlage bestimmte waren(Abbildung 3). Die Echtzeit-Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage auf Dampf Geruchsstoff Reiz war überwachten über 20 Messzyklen. Die Daten für jede wurden auch zuerst auf den leeren Vektor Steuerung im Durchschnitt Wert für jeden Zyklus (Abbildung 3B) normalisiert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Regionen in äußerster Randlage können Variable Ebenen der basale Aktivität in diesem Assay in einer OR-abhängigen Weise zeigen und es kann wichtig sein, auch ihre Reaktion auf diese Parameter (Abb. 3C) normalisieren. Der durchschnittliche Wert der OR teilbar durch seine Reaktion bei t = 0 s, so dass um zwischen den Regionen in äußerster Randlage zu vergleichen. Aktivierung der einzelnen Werte für jede OP können auch durch die Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC) für die einzelnen oder durch Addition aller Zyklus Messwerte (Abbildung 3D) berechnet werden.

Darüber hinaus können mit dieser Methode mit zunehmenden Duftstoff Dosen dosisabhängige Reaktionen gemessen werden. Wir präsentieren die Reaktion des Olfr1377 auf Acetophenon Stimulation aufgenommen nach dem gleichen Verfahren (Abbildung 4). Acetophenon Volatilität kann durch den Dampfdruck ausgewertet werden, dies entspricht 0,44 mm Hg bei 25 ° C. Bei einer gegebenen Temperatur ist ein Duftstoff, besitzen einen höheren Dampfdruck volatiler als ein Geruchsstoff mit niedrigeren Dampfdruck. Acetophenon ist infolgedessen ein mäßig flüchtige Duftstoff und die Zelle ausgesetzt ist pur und verdünnt auf 10-2und 10-4, 10-6 10-8. Nur die drei höheren Konzentrationen (rein, 10-2 und 10-4) sind in der Lage, Olfr1377 zu aktivieren (Abb. 4A). Wir können auch feststellen, dass die reine zusammengesetzte Stimulation Tendenz die OR-Antwort während der Zeit, wahrscheinlich wegen der Giftigkeit der Zelle, zeigt siehe für Eugenol in einer jüngsten Veröffentlichung32. Dennoch können wir eine typische Dosis Abhängigkeit Verhalten des Olfr1377 beobachten (Abbildung 4B), zeigen, dass diese Methode auch verwendet werden, kann die EC50 oder flüchtige Verbindung zu bestimmen.

Beachten Sie, dass wenn dosisabhängig Experimente durchgeführt werden, wir nicht sauber Luminometer Kammer Vakuum. Experimente werden jedoch immer von niedrig zu hoch, zunehmende Geruchsstoff Dosen um Verunreinigungen zu minimieren durchgeführt. Weiter, da die wirkliche Konzentration der Geruchsstoff Moleküle in die Zelle Medien nicht bekannt ist, sind die EC50s, die durch diese Methode erhalten nicht unbedingt vergleichbar mit denen, die durch flüssige Stimulation. Mit unserer Methode ermittelten EC50-Werte berücksichtigen die Geruchsstoff Volatilität, die Kinetik der Geruchsstoff Auflösung in das Medium, den Geruchsstoff Löslichkeit und die Affinität zwischen den Geruchsstoff und OP, die sind näher an die natürliche Wahrnehmung von Gerüchen. In unserem Beispiel der Olfr1377 Stimulation von Acetophenon ist der EC50-Wert von unseren Dosis-Wirkungs-Dampf 161 µM (0.001874 %), die rund 50 ist höher als die flüssigen Stimulation (3,28 µM von Saito Et Al.6) Falten. Dieser Unterschied zwischen Flüssigkeit und Dampf Stimulationen berichtete auch Sanz Et Al.20 in ihren Dampf Stimulation Assay wo Dampf Stimulation 100 bis 1000 Falte niedrigere EC50-Werte als die flüssigen Stimulation gab.

Figure 1
Abbildung 1 : Prinzip der Echtzeit-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung durch vapored Geruchsstoff. (A) die 96-Well-Platte wurde gelegt in die bereits äquilibriert mit Geruch (violette Wolke) Luminometer Kammer. (B) verdampft Geruchsstoff Moleküle (violett) an der Oberfläche der Zelle Medienpuffer auflöst, OR Hohlraum, an der Hana3A Zellmembran Oberfläche zu erreichen. Das Zubehör-Protein RTP1S (grau) wurde als auch um zu Gunsten der Zelle Oberflächenexpression des OR transfiziert. Wenn das Molekül Geruchsstoff Agonist OR war, OP in einen aktivierten Zustand geschaltet und gebunden GOlf, die Aktivierung der Adenylyl-Cyclase (AC) und die Produktion von zyklisches AMP (cAMP; grün) auszulösen. Das Glosensor Protein (Luciferase) besitzt eine Bindungsstelle für Lager, das einmal gebunden, das Protein seinen Liganden, die Luciferin (gelb) binden kann. Die abschließende komplexe Glosensor Protein/Luciferin/cAMP produziert die Lumineszenz, die aufgezeichnet wurde, um die OR-Aktivierung zu überwachen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Schematische Protokolle zur Echtzeit-Überwachung der Duftstoff-Rezeptor-Aktivierung von vapored Geruchsstoff. Der Geruchsstoff (violett) wurde bei der gewünschten Konzentration in Mineralöl (A) verdünnt. Die Lösung wurde dann in eine neue 96-Well-Platte, vergoldet, die in der Kammer Luminometer für 5 min bis das Volumen mit vapored Geruchsstoff equilibrate vor der Überwachung der transfizierten 96-Well-Platte (B) gestellt wurde. Der Duftstoff-Lösung wurde in jedem Raum zwischen den Vertiefungen der transfizierten 96-Well-Platte pipettiert (siehe zoom). Die Platte wurde dann lesen für 20 Zyklen in der Kammer Luminometer Dampf Geruchsstoff (C equilibriert). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Beispiel für Normalisierung, die nach Erfassung der Daten durchgeführt werden kann. (A) ein leerer Vektor (negativ) Kontrolle wurde eingefügt in die Transfektion Plan in der Lage sein, alle möglichen-oder spezifischen Geruch Aktivierungen von Zellen zu identifizieren. Es hat auch Informationen zu den Hintergrund-Lumineszenz der Platte. (B) jede oder Antwort wurde dann durch Division der Emissionswert von jedem Bohrloch durch den durchschnittlichen Wert des Vektors Kontrolle in jeder Platte normalisiert. Die Lumineszenz-Werte jedes OP wurden dann entlang der Messzyklen gemittelt. (C) oder Antworten können auch dann auf ihre basale Aktivität durch weitere Teilung jeder Zyklus-Wert durch den Mittelwert des Zyklus der Messung 1St normalisiert werden (t = 0 s). (D) die AUC kann durch Addition die Emissionswerte von jedem Meßzyklus berechnet werden. Für B, C und D, Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM, n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Beispiel für Dosis abhängige Antworten, die mit der Methode. (A) die Reaktion der Olfr1377 auf Acetophenon wurde für fünf verschiedene Verdünnungen in Mineralöl aufgenommen (100, 10-2, 10-4, 10-610-8), und ohne Duftstoff (0), und normalisiert, nach der Normalisierung Protokoll in Abbildung 3dargestellt. (B) die Daten während der Messung Zyklen wurde in ein AUC-Wert für jede Verdünnung übersetzt. Diese Zahl wurde von Kida Et Al.32geändert. Diese Zahl ist unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International (CC von 4.0) lizenziert. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM, n = 3). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Pro 96-Well-Platte
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
ODER 75 ng

Tabelle 1: Mix zur Transfektion. Mengen von Plasmiden (Glosensor Protein, RTP1S und oder) MEM zu transfizieren, einer 96-Well-Platte hinzu.

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Discussion

Die Wahrnehmung der Geruch ist wesentlich abhängig von der Aktivierung der Regionen in äußerster Randlage. Infolgedessen ist Verständnis ihrer Funktionalität erforderlich, um die komplexen Mechanismen, mit denen das Gehirn seine flüchtige chemische Umgebung wahrnehmen zu knacken. Jedoch wurde das Verständnis dieses Prozesses durch die Schwierigkeiten bei der Einrichtung einer robusten Methode der OR-Repertoire für Funktionalität gegen Riechstoffe in-vitro-. auf dem Bildschirm behindert Zelle Oberfläche und heterologen Expression von Regionen in äußerster Randlage hat teilweise gelöst, durch die Schaffung von tagged Rezeptoren13,19 und die Entdeckung und die Optimierung von Rezeptor-der Transport von Proteinen (Rendite) ausgedrückt in Korrelationsmöglichkeiten22 , 23. die ersten Screening-Studien dann erschien, bringen neue Erkenntnisse zum Verständnis der Funktion oder wie ihre Geruchsstoff Anerkennung Muster6,7,26,33, Aktivierung Mechanismus34,35, theoretische dreidimensionalen Struktur36,37, Evolution38,39, Geruch Platz40,41, 42und Implikationen im Geruch Erkennung43,44,45,46. Wir glauben, dass die Verbesserung der in-vitro-Methoden der Entzifferung der Geruch Codierung zu steigern. Als solche haben wir hier eine neue funktionelle Assays ermöglichen die Kontrolle der OR-Aktivierung durch verdampfte Geruchsstoff Moleküle entwickelt.

Der Erfolg dieser Methode hängt von mehrere wichtige Schritte. In den letzten Jahren zwar verbessert, bleibt heterologen Expression von einigen Regionen in äußerster Randlage schwierig OR Reaktionsfähigkeit auf Geruchsstoff beeinflussen kann. Der Ausdruck der Regionen in äußerster Randlage an der Zellmembran kann in einem parallelen Experiment mit Flow Cytometry19,24ausgewertet werden. Beachten Sie, dass niedrige Oberflächenexpression noch vorhandene robuste Antworten im heterologen Zelle Systeme35können. Ein weiterer kritischer Punkt ist Geruchsstoff Kontamination zu vermeiden. Angesichts der Sensibilität des Assays, können Geruchsstoff Moleküle von Parfüm, Lebensmittel, oder vorherigen Test das Experiment durch Induktion unkontrollierte OR Antworten verschmutzen. Deshalb empfehlen wir, die Kammer des Luminometer für mindestens 2 h am besten über Nacht vor der Durchführung eines Tests mit verschiedenen Duftstoff Vakuum. Es ist auch wichtig zu überlegen, eine potenzielle Zytotoxizität von den Geruchsstoff in das Experiment verwendet. Eine mögliche Abnahme der Reaktion des OP während der 30 min. Überwachung kann zeigen, dass der Geruchsstoff selbst wirkt sich negativ auf die Gesundheit hat. Die Duftstoff Zytotoxizität kann durch Ausführen eines Zelle Lebensfähigkeit Assays nach Freilegung der Zellen zu den Geruchsstoff ausgewertet werden. Um dieses Problem zu umgehen, ist es möglich, nur die erste 10 min der Aufnahmezeit für die Analyse von Daten, Zuschneiden Ende betrachten. Wir haben festgestellt, dass Geruchsstoff Toxizität vor allem tritt bei der Geruchsstoff reine getestet wird oder bei sehr hohen Konzentrationen. Die Empfindlichkeit von unserem Test ermöglicht die Erkennung von Geruchsstoff in Mineral Öl verdünnt. Die optimale Konzentration, um maximale Reaktion auslösen variiert von einem Geruchsstoff zur anderen, aber wir beobachteten, dass eine Verdünnung von 1 % ausreicht, um eine Sättigung ein OR Antwort32zu entlocken. Jedoch einige Geruchsstoff Moleküle besitzen können, geringen Dampfdruck (und damit geringe Volatilität) und eventuell einige Anpassungen an den vorgestellten Protokoll vorgenommen werden. Die Inkubationszeit von den Geruchsstoff im Saal hier Luminometer ist auf 5 Minuten eingestellt. Wir davon ausgegangen, dass die angegebene Zeit ausreichend ist, um die Kammer mit Duftstoff flüchtige Moleküle equilibrate, aber niedriger Volatilität Geruchsstoffe längere Inkubationszeiten erfordern.

Abgesehen von diesen kritischen Punkten, diese Methode bringt viele neue Möglichkeiten zur Erforschung der Struktur-Funktions-Beziehungen von Duftstoff-OR-Interaktionen. Die Echtzeit-Überwachung Aspekt dieser Methode ermöglicht auch das Verständnis der Kinetik von Ereignissen, die während einer Geruch Wahrnehmung auftreten. Als Beispiel haben wir das Protokoll um die Funktionalität eines Enzyms Metabolit, der Carboxylgruppen Esterase 1D (Ces1d), ausgedrückt in der olfaktorischen Schleimhaut von Säugetieren47gefunden zu erkunden. Dieses Enzym ist Ester konvertieren Carbonsäure und Alkohol48bekannt. Die Co-Transfektion von Ces1d zeigte eine Modulation von in-vitro-OR Antworten auf Ester-Verbindungen,32 zeigt, dass dieses neue Protokoll erforschen die Bedeutung der metabolische Enzyme bei Geruchsstoff Erkennung effizient ist. Darüber hinaus wird mit Hilfe dieser Plattform um zu untersuchen, Geruchsstoff Mischungen und die Art und Weise die Gerüche in den Einstellungen dargestellt werden, die natürlicher, Zukunftsstudie für das Verständnis komplexer Geruchsstoff Interaktionen ermöglichen. Schließlich ist die Erkennung Geruchsstoff Moleküle von Regionen in äußerster Randlage auch von großem Interesse in der Entwicklung von einem Geruchssensor. Diese Methode ist haben gezeigt, dass unser System Geruchsstoff Moleküle präsentiert in einer Dampfphase erkennen kann, ein erster Schritt bei der Entwicklung von miniaturisierten Biosensor.

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Disclosures

Eine Patentanmeldung eingereicht für diese Arbeit am 27. Oktober 2016 relevant, Y.F., H. K und H.M.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom NIH (DC014423 und DC016224) und der Defense Advanced Research Agentur RealNose Projekt unterstützt. YF blieb an der Duke University mit finanzieller Unterstützung von JSPS Programm zur Förderung der strategischen internationale Netzwerke, die Zirkulation der talentierte Forscher (R2801) zu beschleunigen. Sahar Kaleem danken wir für die Bearbeitung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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