Summary
Физиологически одорант рецепторы активируются одоранта молекул вдыхается в паровой фазе. Однако большинство в пробирке систем используют жидкой фазы одоранта стимуляции. Здесь мы представляем метод, который позволяет в реальном времени в пробирке мониторинга одоранта рецептор активации после стимуляции одоранта в паровой фазе.
Abstract
Обонятельные восприятие начинается с взаимодействием отдушки с рецепторами одоранта (или) выраженные обонятельной сенсорных нейронов (ОСН). Запах признание следующим комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. Через такие комбинаторной кодирования, организмы можно обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Таким образом запах при данной концентрации можно описать активации шаблон СПР, который специфичен для каждого запаха. В этом смысле, растрескивание механизмы, которые мозг использует для восприятия запахов требует понимания одоранта-или взаимодействия. Вот почему обоняние сообщество привержено «де orphanize» эти рецепторы. Обычные в пробирке систем, используемых для идентификации одоранта- или взаимодействия использовали инкубирования ячейки СМИ с одоранта, который отличается от естественной обнаружения запахи через пара отдушки растворения в слизистую оболочку носа до взаимодействия с СПР. Здесь мы опишем новый метод, который позволяет для реального времени наблюдения или активации через паровой фазы отдушки. Наш метод основан на измерения лагеря выхода люминесценции, используя Glosensor assay. Он ликвидирует нынешние пробелы между подходами в vivo и in vitro и обеспечивает основу для biomimetic летучих химических датчика.
Introduction
Обоняние позволяет наземных животных взаимодействовать с их летучие химические среды привод поведения и эмоции. По существу процесс обнаружения запаха начинается с самого первого взаимодействия молекул одоранта с обонятельной системы, на уровне одоранта рецепторов (СПР)1. В млекопитающих ORs индивидуально выражаются в обонятельной сенсорных нейронов (OSNs), расположенный в обонятельного эпителия2. Они принадлежат к семейству рецепторов (GPCR) G-протеин и более точно родопсин как суб семье (также называемый класса A). СПР пара с стимулирующее G протеина GФОО чьи Активация приводит к лагеря производства последовали открытия циклических нуклеотидов воротами каналов и поколения потенциалы действия. Принято что ощутили запах опирается на определенный шаблон активированного СПР3,4 и поэтому запах признание комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. И через такие комбинаторной кодирования, постулируется, что организмы может обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Один из ключей к пониманию, как воспринимают запахи — чтобы понять, как и ORs активируются данной запах.
В попытке прояснить одоранта- или взаимодействия, в пробирке функциональных анализов играют важную роль. Идентификация агонист пахучих лигандов для сирот ORs (или де orphanization) был очень активное поле за последние двадцать лет, с использованием различных в пробирке, ex vivo и в естественных условиях функциональных анализов5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,,1516, 17.
В пробирке пробирного системы лучше всего подходит для подробных функциональных характеристик ПРС, включая определение функциональные домены и критических остатков СПР, а также потенциал инженерных приложений. Однако дальнейшее развитие ценных в пробирке систем для СПР был вызов, отчасти из-за трудностей с культивирования OSNs и функциональных выражение ORs в гетерологичных клеток. Первая задача заключалась в создании протоколов, которые разрешены для клеток поверхности выражения функциональной ORs в сопоставлении одоранта-или взаимодействия. Ряд независимых групп использовали различные подходы5,6,,78,9,10,11,12, 14,18,19,20. Одним из первых достижений было сделано, Krautwurst et al. в меткой N-конечная СПР с укороченной последовательность родопсина (Ро тегов) и наблюдается улучшение поверхности выражение в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)13. Изменения, сделанные в тег придает последовательность или все еще путь для улучшения или выражение и функциональность19,21. Сайто et al. затем определил транспортировки рецептора протеина 1 (RTP1) и RTP2, который содействует или торговле. 22 сокращенный вариант RTP1, называемый RTP1S, также было показано быть даже более эффективным, чем оригинальный белка23. Разработка клеточной линии (Hana3A), которая стабильно выражает GФОО, REEP1, RTP1 и RTP2 24, в сочетании с использованием Репортеры циклический аденозинмонофосфат (лагерь) позволило идентификации одоранта-или взаимодействия. Механизм, по которому RTP семейство белков способствует клеток поверхности выражение ORs предстоит определить.
Одно предостережение этих установленных методов является, что они полагаются на стимуляции одоранта в жидкой фазе, что означает отдушки предварительно растворяют в средство стимуляции и стимулировать клетки путем замены носителя. Это очень отличается от физиологических условиях где одоранта молекулы достигают обонятельного эпителия в паровой фазе и активировать ORs путем растворения в слизистой оболочки носа. Для больше напоминают воздействия физиологически соответствующие стимулы, Sanz et al.20 предложил assay основанный на стимуляции пара путем нанесения капли раствора одоранта повесить под с внутренней стороны пластиковой пленки, размещены на верхней части клетки скважин. Они записали кальция ответы путем мониторинга интенсивности флуоресценции. Этот метод был первым для использования воздуха фаза одоранта стимуляции, но она не позволяет большой показ или активации.
Здесь мы разработали новый метод, который позволяет в режиме реального времени мониторинг в пробирке или активации через паров этапе одоранта стимуляции Glosensor пробу (рис. 1). Этот assay был использован ранее в контексте жидких одоранта стимуляции18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. Мониторинг палаты Люминометр сначала достижение равновесного уровня с испаряется одоранта до пластины чтения (рис. 1А). Одорант молекулы, затем сольватированного в буфер, купание Hana3A клетки, выражая или интерес, RTP1S и Glosensor белков (рис. 1Б). Если одорант агонистов или, или переключиться на активированные конформации и привязать GФОО, активации гуанилатциклазы adenylyl (AC) и в конечном итоге вызывают повышение уровня лагеря. Этот рост лагерь будет связывать и активировать Glosensor белка для создания свечения, катализирующих люциферин. Это свечение затем регистрируется с помощью люминометра и позволяет осуществлять мониторинг или активации. Этот метод является большой интерес в контексте или deorphanization, как он приносит в пробирке систем ближе к естественной восприятие запахов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hana3A клетки культуры
- Подготовить M10 (минимум основных средних (MEM) плюс 10% v/v плода бычьим сывороточным (ФБС)) и M10PSF (М10 плюс 100 мкг/мл пенициллин стрептомицином и амфотерицин B 1,25 мкг/мл).
- Культура клетки в 10 мл M10PSF в 100 мм ячейку культуры блюдо в инкубаторе в 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2).
- Деление клетки каждые 2 дня в соотношении 20%: при 100% слияния клеток (примерно 1.1 x 107 клеток) наблюдается под микроскопом фазово контрастной, стремятся СМИ и вымыть клетки мягко с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
- Аспирационная PBS и добавить 3 мл 0,05% трипсина этилена диамин tetraacetic кислоты (ЭДТА, 0.48 мм). Пусть закон для примерно 1 мин, до тех пор, пока клетки отмежеваться от пластины.
- Добавьте 5 мл M10 инактивирует трипсина и в конечном итоге отсоединить клетки еще привязаны к пластине, закупорить вверх и вниз.
- Перевод тома (8 мл) в 15 мл трубку и центрифуги на 200 x g 5 мин аспирата супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл M10PSF, закупорить вверх и вниз, чтобы сломать любую ячейку массы. Избегайте создания пузырьков в трубе.
- Передача 1 мл раствора ресуспензированы клетки в новое блюдо культуры клеток 100 мм и добавьте 9 мл свежих M10PSF. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
2. Подготовка Transfection клетки
- Оцените слияния, или количество клеток, наблюдая их под микроскопом фазово контрастной. По крайней мере 10% слияния (примерно 1,1 х 106 клеток) необходима для одной пластины.
- Аспирационная СМИ и вымыть клетки мягко с 10 мл ФСБ. Аспирационная PBS и добавить 3 мл раствора ЭДТА. Пусть закон для примерно 1 мин при комнатной температуре, до тех пор, пока клетки отмежеваться от пластины.
- Добавьте 5 мл M10 инактивирует трипсина и в конечном итоге отсоединить клетки еще привязаны к пластине, закупорить вверх и вниз. Перевод тома (8 мл) 15 мл трубки и центрифуги на 200 x g за 5 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл M10PSF, закупорить вверх и вниз, чтобы сломать любую ячейку массы. Избегайте создания пузырьков в трубе.
- В зависимости от количества пластин, котор нужно transfected передавать соответствующее количество клеток в водоеме с надлежащей соответствующим томом M10PSF. Одна пластина 96-луночных следует покрытием с 1/10 из 100% блюдо вырожденная 100 мм (примерно 1,1 х 106 клеток) разводят в M10PSF для достижения общего объема 6 мл. За одну плиту 96-луночных начиная с 100% слияния 100 мм блюдо добавьте 500 мкл от 5 мл ресуспензированы клеток до 5,5 мл свежего M10PSF. Сочетание клетки и M10PSF без формирования пузырьков воздуха.
- Пипетка 50 мкл приостановлено клеток в каждой скважине 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
3. плазмида Transfection
- Наблюдать за 96-луночных пластины под микроскопом фазово контрастной заверить слияния ячеек между 30% и 50%.
- Подготовить первый микс трансфекции, который содержит плазмиды, общие для всей пластине (RTP1S, или и Glosensor белков, смотрите Таблицу материалы) после тома в таблице 1. Обратите внимание, что количество Ро тегами или следует разделить на количество ORs, если несколько ORs.
Примечание: Мы настоятельно рекомендуем для добавления пустой вектор отрицательный контроль (здесь Ро pCI) и любой положительный контроль (или известный ответить на испытания одоранта) план эксперимента. - Подготовить второй трансфекции смеси, содержащие MEM 500 мкл и 20 мкл Реагента Lipofectamine 2000 (действительны для одного 96-луночных пластины, смотрите Таблицу материалы). Добавьте второй смеси к первому и осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Добавьте 5 мл M10 и осторожно перемешать.
- Замените M10PSF в пластину ранее накладное 96-луночных 50 мкл окончательного трансфекции СМИ. Инкубировать в наборе инкубатора 37 ° C и 5% CO2 и вакуумной камере Люминометр ночи следующие процедуры, описанные в шаге 6.
4. субстрат инкубации
- Наблюдать за 96-луночных пластины под микроскопом фазово контрастной заверить слияния ячеек между 60% и 100%. Приготовляют раствор стимуляции из Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) содержащий 10 мм гидроксиэтилкрахмала piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES) и 5 мм D-глюкозы.
- Разбавить 75 мкл Реагента лагеря (см. таблица материалов) решение 2,75 мл раствора стимуляции. Удалите средство трансфекции с 96-луночных пластины и вымыть клетки путем добавления 50 мкл раствора свежие стимуляции каждой скважины.
- Удаление решения стимуляции и 25 мкл лагеря реагент раствором, приготовленным на шаге 4.2 в каждой скважине. Инкубируйте 96-луночных пластины в темных и запаха окружающей среды (например, чистые пустой ящик далеко от химических веществ или любого источника одоранта) за 2 ч при комнатной температуре.
5. одоранта стимуляции
- Во-первых сбалансировать зале Люминометр с молекулами летучих одоранта. Разбавьте одоранта в нужной концентрации в 10 мл минерального масла (рисA). До конца время инкубации лагеря реагент добавьте 25 мкл раствора одоранта в новой пластинкой 96-луночных (не один содержащие клетки). Инкубируйте этого одоранта пластины при комнатной температуре в камере Люминометр 5 мин (рис. 2B) (не Люминометр записи требуется здесь).
- Установите Люминометр для записи люминесценции с 0 s задержки во время 20 циклов измерения плита 90 s с 0,7 s интервал между циклами.
- Прямо перед чтением пластину, удалите пластину одоранта из камеры. 25 мкл одоранта между скважинами 96-луночных пластины, содержащие клетки (не добавляйте одоранта в скважинах, содержащие клетки) и быстро начать измерения люминесценции всех скважин для 20 циклов в течение 30 мин (рис. 2C).
6. Удаление оставшихся одоранта внутри Люминометр
- Откройте дверь люминометра. Вставьте трубку, подключенных к вакуумному насосу.
- Вакуумные одорантов в чтении палата активно (по крайней мере 2 часа, желательно на ночь) между двумя отдушки, чтобы избежать перекрестного загрязнения запах летучих веществ из одного эксперимента на другой. Замените свежим воздухом, отправив сжатым воздухом в течение 5 мин до инкубации следующий одоранта.
7. анализ данных
- Экспорт данных из Люминометр программного обеспечения.
- Средняя реплицирует одного и того же или для каждой записи времени. Вычислить нормализованных ответ или любого возможного элемента управления (например, пустой вектор, Рисунок 3A и раздел представительных результатов), разделив значение элемента управления в среднем или среднем значение в каждой записи время (рис. 3B и раздел представительных результатов).
- Нормализовать каждый ответ или их базальной активности путем деления усредненный ответ или на 0 s для каждой записи время реагирования (см. рис. 3C и раздел представительных результатов).
- Вычислите площадь под кривой каждого или для получения одного значения или ответ. Сделать это, сумма всех значений люминесценции каждой записи времени для каждого или.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы показан ответ три мыши ORs, Olfr746, Olfr124 и Olfr1093 с помощью оксима пара стимуляции (рис. 3). Одновременно, мы использовали элемент пустой вектор (Ро pCI), чтобы заверить, что одоранта индуцированной деятельности протестированных ОРС были конкретные (рисA). Реальном времени активации ORs после пара одоранта стимул был контроль более чем 20 измерений циклов. Данные для каждого хорошо были впервые нормализовано к значению элемента управления в среднем пустой вектор для каждого цикла (рис. 3B). Важно отметить, что СПР может показать переменных уровня базальной активности в этот assay образом OR-зависимой, и это может быть важно нормализовать также их реакции на этот параметр (рис. 3C). Среднее значение или могут быть разделены его ответ при t = 0 s, позволяющий сравнивать между ОРС. Одноместный активации значения для каждого или также может быть вычислена, путем расчета площадь под кривой (AUC)) для каждого или путем суммирования всех цикла измерений (рис. 3D).
Кроме того ответы от дозы может быть измерена с помощью этого метода, с помощью увеличения дозы одоранта. Мы представляем ответ Olfr1377 для стимуляции ацетофенон Записанная в том же порядке (рис. 4). Ацетофенон волатильность может оцениваться его давление пара, который равен 0,44 мм Hg при 25 ° C. При данной температуре одоранта, обладающие более высоким давлением пара более неустойчивыми, чем одоранта с низким давлением пара. Ацетофенон является, следовательно, умеренно летучих одоранта и подвергается ячейки чистой и разбавленные на 10-2, 10-4, 10-6 и 10-8. Только три более высокие концентрации (чистый, 10-2 и 10-4) способны активировать Olfr1377 (рис. 4A). Мы также можем заметить, что чистого соединения стимуляции показывает тенденцию к уменьшению или ответ в течение времени, скорее всего из-за токсичности клеток, как это было показано для эвгенол в недавней публикации32. Тем не менее, мы можем наблюдать поведение зависимости Типичная доза Olfr1377 (рис. 4B), показаны, что этот метод может также использоваться для определения ЭК50 или летучих соединений.
Обратите внимание, что когда дозозависимый эксперименты, мы не пылесосьте чистой Люминометр камеры. Однако эксперименты всегда выполняются с низкой высокой, увеличивая одоранта доз для сведения к минимуму загрязнений. Кроме того поскольку реальная Концентрация одоранта молекул в средствах массовой информации клетки не известно, EC50s, полученные этим методом не обязательно аналогичны полученным жидкого стимуляции. Значения ЭК50, определяется наш метод принимать во внимание волатильность одоранта, кинетики растворения одоранта в среднесрочной, одорант растворимость и сходство между одоранта и OR, которые находятся ближе к естественной восприятие запаха. Для нашего примера Olfr1377 стимуляции, ацетофенон значение ЭК50 от нашего пара доза ответ — 161 мкм (0.001874%), который составляет около 50 раз выше, чем жидкие стимуляции (3.28 мкм от Сайто et al.6). Это различие между жидкостью и паром стимуляцию также сообщили20 Sanz et al. в assay стимуляции их паров, где пара стимуляция дали значения ЭК50 100 до 1000 раз меньше чем жидкий стимуляции.
Рисунок 1 : Принцип реального времени мониторинга одоранта активации рецептора, паровые одоранта. (A) 96-луночных плита была помещена в уже уравновешенной с камерой Люминометр запаха (фиолетовые облака). (B) испаренное одоранта молекул (фиолетовый) на поверхности клеток СМИ буфера растворенного в нее, чтобы достичь полости или на поверхности клеточной мембраны Hana3A. Аксессуар белок RTP1S (серый) был transfected также, в пользу клеток поверхности выражение OR. Если одоранта молекулы или агонист, или перешли в состояние активации и связаны GФОО, запуск производства ЦАМФ (лагерь; зеленый) и активации гуанилатциклазы adenylyl (AC). Glosensor белка (Люцифераза) обладает привязки сайта для лагеря, позволяющая, один раз связанный, белка, чтобы привязать его лиганда, Люциферин (желтый). Окончательный комплекс Glosensor белка/люциферин/лагерь производится люминесценции, который был записан для мониторинга или активации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема протоколы мониторинга реального времени активации рецептора одоранта, паровые одоранта. Одоранта (фиолетовый) был разведен в нужной концентрации в минеральном масле (A). Решение было затем покрытием в новую плиту 96-луночных, который был помещен в камеру Люминометр на 5 минут, чтобы сбалансировать громкость с паровые одоранта до мониторинга transfected 96-луночных плита (B). Одорант решение было накапаны в каждой пространство между скважинами transfected 96-луночных плиты (см. масштаб). Плита была затем чтение для 20 циклов в зале Люминометр достижение равновесного уровня пара одоранта (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Пример нормализации, которая может быть выполнена после записи данных. (A) пустой вектор (отрицательный) управления был вставлен в плане трансфекции, чтобы иметь возможность выявить любые потенциальные-или специфический запах активации клеток. Он также представил информацию о фон свечения пластины. (B) каждая или ответ затем нормализуется путем деления значения выбросов каждой скважины среднее значение управления вектора в каждой плиты. Люминесценция значения каждого или были затем среднем вдоль циклов измерений. (C) или ответы также могут быть нормированы их базальной активности путем дальнейшего деления каждого цикла значение среднее значение 1st цикла измерения (t = 0 s). (D) AUC можно рассчитать путем суммирования значений выбросов каждого цикла измерений. B, C и D, погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM, n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Пример доза зависит от ответов, полученных с помощью метода. (A) ответ Olfr1377 ацетофенон был записан для пяти различных разведениях в минеральном масле (100, 10-2, 10-4, 10-6, 10-8) и без одоранта (0) и нормализуется после нормализация протокол, показанный на рисунке 3. (B) данные во время измерения циклов была переведена на значение AUC для каждого разведения. Этот рисунок был изменен с Kida et al.32. Эта цифра лицензирована под Creative Commons Attribution 4.0 международной (CC на 4.0). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM, n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| На 96-луночных пластину | |
| МЕМ | 500 МКЛ |
| pGlosensor | 10 нг |
| RTP1S | 5 нг |
| ИЛИ | 75 нг |
Таблица 1: смесь для transfection. Количество плазмидов (Glosensor белок, RTP1S и или) для добавления MEM transfect один 96-луночных пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Восприятие запаха принципиально зависит от активации ORs. Следовательно для того чтобы треснуть сложные механизмы, использующие мозг воспринимать его летучие химические среды требуется понимание их функциональность. Однако понимание этого процесса сдерживается трудностями в создании надежного метода для экран или справочника для функциональности против одорантов в пробирке. Клеток поверхности и гетерологичных выражение ORs частично решена путем создания тегами рецепторов13,19 и обнаружения и оптимизации транспортировки рецептор белков (ИУП) выражена в OSNs22 , 23. Затем появились первый скрининговых исследований, принося новые идеи для нашего понимания или функции, например их одоранта признание шаблон6,7,26,33, активации механизм,3435, теоретические трехмерная структура36,37, эволюция38,39, запах пространство40,41, 42и последствия в запах обнаружения43,,4445,46. Мы считаем, что улучшение методов в пробирке может повысить расшифровка кодирования запахов. Таким образом мы здесь разработали новые функциональные пробирного чтобы мониторинг или активации испаряется одоранта молекул.
Успех этого метода зависит от нескольких критических шагов. Хотя в последние годы улучшилось, гетерологичных выражение некоторых ОРС остается сложным, который может повлиять или реагировать одоранта. Выражение ORs в клеточной мембраны может оцениваться в параллельных эксперимент с использованием потока цитометрии19,24. Обратите внимание, что низкий уровень поверхности выражения можно еще присутствует надежные ответы в гетерологичных клетки систем35. Другой критической точки, чтобы избежать загрязнения одоранта. Учитывая чувствительность этот assay, одорант молекул от духов, еда или предыдущего анализа может загрязнять эксперимент, вызывая неконтролируемого или ответы. Именно поэтому мы советуем вакуумные камеры Люминометр для по крайней мере 2 h, желательно на ночь, перед выполнением assay с различными одоранта. Важно также рассмотреть потенциальные цитотоксичность одоранта, используемых в эксперименте. Потенциальное сокращение ответа или в течение 30 мин мониторинг может показать, что одоранта, сам имеет негативное влияние на здоровье клеток. Цитотоксичность одоранта может оцениваться путем выполнения assay жизнеспособности клетки после разоблачения клетки одоранта. Чтобы устранить эту проблему, можно считать только первые 10 мин записи времени для анализа данных, обрезка конца. Мы заметили, что токсичность одоранта в основном происходит когда одорант испытывается чисто или при очень высоких концентрациях. Чувствительность нашего анализа позволяет обнаружение одоранта, разбавляют в минеральном масле. Оптимальная концентрация для получения максимальной реакции варьируется от одного одоранта в другую, но мы наблюдали, что 1% раствора достаточно, чтобы добиться насыщения ответ или32. Однако некоторые одоранта молекулы могут обладать низким давлением пара (и поэтому низкой волатильности) и может потребоваться некоторые коррективы необходимо внести в представленный протокол. Время инкубации одоранта в зале Люминометр расположен в 5 мин. Мы предполагали, что это количество времени достаточно, чтобы сбалансировать в камеру с одоранта летучих молекул, но низкой волатильности отдушки может потребоваться более длительное время инкубации.
Помимо этих критических точек, этот метод приносит много новых возможностей для изучения структуры функция отношения одоранта-или взаимодействия. В реальном времени мониторинг аспект этого метода позволяет также понимание кинетики событий, которые происходят во время восприятие запаха. В качестве примера мы использовали протокол изучить функциональность метаболит фермента, карбоксильных эстеразы 1d (Ces1d), установлено, что выражается в обонятельной слизистой оболочки млекопитающих47. Этот фермент известен с конвертировать эфиры карбоновых кислот и алкоголя48. Совместное transfection Ces1d показал модуляции в пробирке или ответы на Эстер соединений,32 , демонстрируя, что этот новый протокол является эффективным в изучении важность метаболических ферментов в одоранта обнаружения. Кроме того с помощью этой платформы для расследования одоранта смеси и то, что запахи представлены в настройках, которые являются более естественными, даст возможность будущего исследования понимания более сложных взаимодействий одоранта. Наконец обнаружение одоранта молекул по ORs также представляет большой интерес в развитии датчик запаха. Показав, что наша система может обнаруживать одоранта молекул в паровой фазе, этот метод является первым шагом в процессе разработки миниатюрных биодатчик.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ю.Ф, H. K и H.M. подал заявку на патент отношение к этой работе на 27 октября 2016.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантов от них (DC014423 и DC016224) и обороны передовых исследований агентства RealNose проекта. YF остался в университете Дьюка при финансовой поддержке программы JSP-страницы для продвижения стратегических международных сетей для ускорения циркуляции талантливых исследователей (R2801). Мы благодарим Sahar Калима для редактирования рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C |
| 100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
| 96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C |
| centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
| Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum - store at -20 °C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C |
| Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C |
| Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants - store at room temperature |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C |
| Phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
- Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432 (2015).
- Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
- Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446 (2015).
- Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455 (2015).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81 (2017).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758 (2013).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402 (2008).
- Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831 (2017).
- Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
- Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
- Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
- Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
- Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556 (2018).
- Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
- de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
- de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
- Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
- de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821 (2012).
- Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114 (2014).
- Meister, M.
- Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
- Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127 (2015).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468 (2007).
- McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
- Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
- Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).
