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Neuroscience

En temps réel en Vitro suivi d’Activation des récepteurs de l’odeur par une substance odorante en Phase vapeur

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59446
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,3,5,6
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

Summary

Physiologiquement, les odorants récepteurs sont activés par des molécules odorantes inhalés en phase vapeur. Cependant, la plupart des systèmes in vitro utilisent une stimulation de la phase liquide odorant. Nous présentons ici une méthode qui permet un suivi en temps réel in vitro de l’activation des récepteurs odorants lors de la stimulation de la substance odorante en phase gazeuse.

Abstract

La perception olfactive commence par l’interaction des substances odorantes avec les récepteurs odorants (ou) exprimé par les neurones sensoriels olfactifs (OSN). Reconnaissance de l’odeur suit un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer une combinaison d’ORs. Grâce à ce codage combinatoire, les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Ainsi, une odeur à une concentration donnée peut être décrit par un modèle d’activation des RUP, qui est propre à chaque odeur. En ce sens, fissuration des mécanismes que le cerveau utilise pour percevoir l’odeur nécessite la compréhension odorant-interactions OR. C’est pourquoi la communauté de l’olfaction s’est engagée à « l’orphanize » ces récepteurs. Les systèmes in vitro conventionnelles permet d’identifier la substance odorante- ou interactions ont utilisé des milieux cellulaires en incubation avec odorant, qui se distingue par la détection naturelle des odeurs par dissolution de substances odorantes de vapeur dans la muqueuse nasale avant d’interagir avec les ORs. Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel de l’activation d’OR par l’intermédiaire de substances odorantes vapor phase. Notre méthode repose sur la mesure cAMP libération par luminescence à l’aide du test Glosensor. Il comble les lacunes entre les approches in vivo et in vitro et fournit une base pour un capteur chimique volatile biomimétique.

Introduction

Le sens de l’odorat permet d’interagir avec leur environnement chimique volatile d’émotions et de comportements en voiture, les animaux terrestres. Fondamentalement, le processus de détection d’odeur commence avec la première interaction des molécules odorantes avec le système olfactif, au niveau de l’odorisant récepteurs (ORs)1. Chez les mammifères, les ORs sont individuellement exprimés dans les neurones sensoriels olfactifs (OSNs) situés dans l' épithélium olfactif2. Ils appartiennent à la famille G-protéine a couplé des récepteurs (GPCR) et plus précisément à la sous-famille de type rhodopsine (également appelé classe A). ORs de couple avec le stimulateur G protéine Golf dont l’activation mène à la production d’AMPc suivie de l’ouverture des canaux nucléotide cyclique contrôlé et la génération de potentiels d’action. Il est admis qu’un percept odeur s’appuie sur un modèle spécifique d’activés ORs3,4 et reconnaissance de l’odeur suit donc un schéma de codage combinatoire, où un ou peut être activé par un ensemble de substances odorantes et une substance odorante peut activer un combinaison d’ORs. Et par le biais de ce codage combinatoire, on émet l’hypothèse que les organismes peuvent détecter et distinguer une myriade de molécules odorantes volatiles. Une des clés pour comprendre la façon dont sont perçus les odeurs est de comprendre comment et qui sor est activés par une odeur donnée.

Pour tenter d’élucider odorant- ou des interactions, des essais fonctionnels in vitro ont joué un rôle essentiel. L’identification des ligands odorant agoniste pour orphelin ORs (dé-orphanization OR) a été un champ très actif pendant les vingt dernières années, grâce à l’utilisation de divers in vitro, ex vivo et des épreuves fonctionnelles in vivo5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.

Systèmes de test in vitro sont plus adaptés pour la caractérisation fonctionnelle détaillée de RUP, y compris l’identification des domaines fonctionnels et résidus importants de SRO, ainsi que les applications potentielles de génie. Cependant, outre développement des systèmes in vitro précieux pour ORs a été un défi, en partie en raison de la difficulté avec OSNs culture et expression fonctionnelle d’ORs en cellules hétérologues. Le premier défi a été d’établir des protocoles permettant l’expression en surface cellulaire de SRO fonctionnelle dans le mappage de substance odorante-interactions OR. Un certain nombre de groupes indépendants ont utilisé diverses approches5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20. Une des premières réalisations a été faite par Krautwurst et coll. dans le tag N-terminal du sor avec une séquence raccourcie de la rhodopsine (Rho-tag) et observé une expression de surface améliorée de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)13. Modifications apportées à l’étiquette associée à la séquence de l’OR est toujours un chemin exploré pour améliorer OR expression et la fonctionnalité de19,21. Saito et al.. alors identifié la protéine du récepteur-transport 1 (RTP1) et RTP2 qui facilitent le trafic d’OR. 22 une version courte de RTP1, appelé RTP1S, a également démontrée pour être encore plus efficace que l’original de protéine23. Le développement d’une lignée cellulaire (Hana3A) qui exprime stablement Golf, REEP1, RTP1 et RTP2 24, associée à l’utilisation de reporters de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) a permis l’identification de la substance odorante-interactions OR. Le mécanisme par lequel la famille RTP de protéines favorise l’expression à la surface cellulaire de SRO reste à déterminer.

Une mise en garde de ces méthodes est qu’ils s’appuient sur la stimulation de la substance odorante en phase liquide, ce qui signifie que les composés malodorants sont préalablement dissous dans un milieu de stimulation et stimulent les cellules en remplaçant le milieu. C’est très distincte de l’état physiologique, où les molécules odorantes atteignent l’épithélium olfactif en phase gazeuse et activer l’ORs par dissolution dans la muqueuse nasale. Pour ressembler plus étroitement à exposition relance physiologiquement pertinents, Sanz et coll.20 a proposé une analyse basée sur la stimulation de la vapeur en appliquant une goutte de solution d’odorants à accrocher sous la face intérieure d’un film plastique sur le dessus du puits de la cellule. Ils ont enregistré les réponses de calcium en contrôlant l’intensité de la fluorescence. Cette méthode a été le premier à utiliser la stimulation odorante phase aérienne, mais elle ne permettait pas une grande projection d’activation de l’OR.

Ici, nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surveiller en temps réel d’activation in vitro d’OR via la stimulation de vapor phase odorant par le dosage de la Glosensor (Figure 1). Ce test a été utilisé précédemment dans le contexte du liquide odorant stimulation18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31. la chambre suivie du luminomètre est tout d’abord équilibrée avec vaporisé odorante avant plaque lecture (Figure 1A). Molécules odorantes sont solvatés dans la mémoire tampon, baignade Hana3A cellules exprimant l’OR d’intérêt, les RTP1S et les Glosensor de protéines (Figure 1B). Si l’odeur est un agoniste de l’OR, l’OR va passer à une conformation activée lier le Golf, activation de l’adénylate cyclase (AC) et finir par provoquer des taux d’AMPc à augmenter. Ce cAMP montante va se lier à et activer la protéine Glosensor pour générer la luminescence catalysant la luciférine. Cette luminescence est ensuite enregistrée par le luminomètre et permet la surveillance d’activation OR. Cette méthode est d’un grand intérêt dans le cadre de deorphanization d’OR car elle apporte des systèmes in vitro plus près à la perception naturelle des odeurs.

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Protocol

1. Culture de cellules de Hana3A

  1. Préparer la M10 (milieu essentiel Minimum (MEM) plus 10 % v/v foetale de sérum bovin (FBS)) et M10PSF (M10 plus 100 µg/mL de pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL, amphotéricine B).
  2. La culture des cellules dans 10 mL de M10PSF dans une boîte de Petri de cellule de 100 mm dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
  3. Diviser les cellules tous les 2 jours à un taux de 20 % : lorsque 100 % confluence des cellules (environ 1,1 x 107 cellules) est observée au microscope à contraste de phase, aspire les médias et laver les cellules doucement avec 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Aspirer les PBS et ajouter 3 mL d’acide 0.05 % trypsine-éthylène diamine tétraacétique (EDTA, 0,48 mM). Laisser agir pendant environ 1 min, jusqu'à ce que les cellules se dissocient de la plaque.
  5. Ajouter 5 mL de M10 à inactiver la trypsine et finit par se détacher les cellules encore attachés à la plaque de pipetage de haut en bas.
  6. Transférer le volume (8 mL) dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de M10PSF en pipettant également, haut et bas pour casser n’importe quelle cellule massive. Évitez de créer des bulles dans le tube.
  7. Transférer 1 mL de la solution de cellules resuspendues dans une nouvelle boîte de Petri de cellule 100 mm et ajouter 9 mL de M10PSF frais. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.

2. préparation des cellules pour la Transfection

  1. Évaluer la confluence, ou le nombre de cellules, par leur observation au microscope à contraste de phase. Au moins 10 % confluence (environ 1,1 x 106 cellules) est nécessaire pour une seule plaque.
  2. Aspirer les médias et laver les cellules doucement avec 10 mL de PBS. Aspirer les PBS et ajouter 3 mL d’EDTA. Laisser agir pendant environ 1 min à température ambiante, jusqu'à ce que les cellules se dissocient de la plaque.
  3. Ajouter 5 mL de M10 à inactiver la trypsine et finit par se détacher les cellules encore attachés à la plaque de pipetage de haut en bas. Transférer le volume (8 mL) dans un tube de 15 mL et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
  4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de M10PSF en pipettant également, haut et bas pour casser n’importe quelle cellule massive. Évitez de créer des bulles dans le tube.
  5. Selon le nombre de plaques à transfecter, transférer une quantité appropriée de cellules dans un réservoir avec le bon volume correspondant de M10PSF. Une plaque à 96 puits doit être plaquée avec 1/10 d’un plat de confluentes 100 mm 100 % (environ 1,1 x 106 cellules) dilué dans M10PSF pour atteindre un volume total de 6 mL. Pour une plaque à 96 puits commençant par un plat de 100 mm 100 % confluence, ajouter 500 µL de la 5 mL de cellules resuspendues à 5,5 mL de M10PSF frais. Mélanger les cellules et les M10PSF sans générer des bulles d’air.
  6. Distribuer 50 µL des suspension cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.

3. Transfection de plasmide

  1. Observer la plaque de 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 30 % et 50 %.
  2. Préparer un mélange de transfection première contenant des plasmides communs à la plaque entière (RTP1S, ou et la protéine Glosensor, voir la Table des matières) suivant les volumes dans le tableau 1. Notez que la quantité d’OR Rho-tag devrait être divisé par le nombre d’ORs si plusieurs ORs.
    Remarque : Nous avons fortement conseils pour ajouter un contrôle négatif vecteur vide (ici Rho-pCI) et tout contrôle positif (OR connu pour répondre à la substance odorante testée) pour le plan de l’expérience.
  3. Préparer un mélange de transfection deuxième contenant 500 µL de MEM et 20 µL de réactif de Lipofectamine 2000 (valable pour une plaque à 96 puits, voir Table des matières). Ajouter le deuxième mélange au premier et mélanger doucement en pipettant également de haut en bas et incuber pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 5 mL de M10 et mélanger doucement.
  4. Remplacer le M10PSF dans la plaque à 96 puits précédemment tressée par 50 µL des médias transfection final. Incuber dans un jeu d’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 et vide la chambre du luminomètre durant la nuit suivant la procédure décrite à l’étape 6.

4. substrat Incubation

  1. Observer la plaque de 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 60 % et 100 %. Préparer une solution de stimulation de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) contenant 10 mM de l’acide piperazineethanesulfonic hydroxyéthyl (HEPES) et 5 mM de D-glucose.
  2. Diluer 75 µL de réactif au cAMP (voir Table des matières) solution à 2,75 mL de la solution de stimulation. Retirer le support de transfection de la plaque à 96 puits et laver les cellules en ajoutant 50 µL de solution de stimulation douce à chaque puits.
  3. Enlever la solution de stimulation et ajouter 25 µL de solution de réactif cAMP établie à l’étape 4.2 dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits dans un environnement sombre et sans odeur (par exemple, un tiroir vide propre loin des produits chimiques ou de n’importe quelle source d’odeur) pendant 2 h à température ambiante.

5. Stimulation de la substance odorante

  1. Tout d’abord, équilibrer la chambre luminomètre avec les molécules odorantes volatiles. Diluer la substance odorante de la concentration désirée dans 10 mL d’huile minérale (Figure 2A). Avant la fin de la période d’incubation de cAMP réactif, ajouter 25 µL de la solution de la substance odorante dans une nouvelle plaque de 96 puits (pas celui contenant les cellules). Incuber cette plaque odorant à température ambiante dans la chambre de luminomètre pendant 5 min (Figure 2B) (aucun enregistrement de luminomètre n’est nécessaire ici).
  2. Définissez le luminomètre pour enregistrer la luminescence avec 0 s de retard au cours de 20 cycles de mesure de la plaque de 90 s avec 0,7 s d’intervalle entre les cycles.
  3. Juste avant la lecture de la plaque, retirez la plaque de substance odorante de la chambre. Ajouter 25 µL d’odeur entre les puits de la plaque à 96 puits contenant les cellules (ne pas ajouter la substance odorante dans les puits contenant les cellules) et commencer rapidement la mesure de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 minutes (Figure 2C).

6. Elimination des odorants restant à l’intérieur le luminomètre

  1. Ouvrez la porte du luminomètre. Insérer le tube relié à la pompe à vide.
  2. Odorisants vide dans la lecture de chambre longuement (au moins 2 h, de préférence la nuit) entre deux substances odorantes pour éviter la contamination croisée des volatiles odeur d’expérience d’un à l’autre. Remplacez par l’air frais en envoyant de l’air comprimé pendant 5 min avant incubation la prochaine odorant.

7. analyse de données

  1. Exporter les données depuis le logiciel luminomètre.
  2. Moyenne de la réplique du même sexe ou pour chaque durée d’enregistrement. Calculer la réponse OR normalisée à tout contrôle éventuel (p. ex., vecteur vide, Figure 3A et article résultats représentatifs) en divisant la valeur du contrôle en moyenne pour l’OR était en moyenne de valeur à chaque temps d’enregistrement (Figure 3B et section résultats représentatifs).
  3. Normaliser la chaque réponse d’OR à leur activité basale en divisant la réponse d’OR en moyenne à 0 s à chaque enregistrement temps de réponse (voir la Figure 3C et article de résultats représentatifs).
  4. Calculer l’aire sous la courbe de chaque OR afin d’obtenir une seule valeur de réponse d’OR. Pour ce faire, additionner toutes les valeurs de luminescence de chaque temps d’enregistrement pour chaque OR.

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Representative Results

Nous avons projeté la réponse des trois ORs de souris, Olfr746, Olfr124 et Olfr1093 en utilisant une stimulation vapor Cinnamaldéhyde (Figure 3). En même temps, nous avons utilisé une lutte antivectorielle vide (Rho-pCI) pour assurer que les activités induite par l’odeur des RUP testés étaient spécifiques (Figure 3A). L’activation en temps réel des RUP sur relance de vapeur odorante a été surveillé mesure plus de 20 cycles. Les données pour chaque bien ont été tout d’abord normalisées à la valeur de contrôle était en moyenne de vecteur vide pour chaque cycle (Figure 3B). Il est important de noter que ORs peuvent montrer des niveaux variables de l’activité basale dans cet essai d’une manière OR-dépendante, et il peut être important de normaliser aussi leur réponse à ce paramètre (Figure 3C). La valeur moyenne d’un RC peut être divisée par sa réponse à t = 0 s, permettant de comparer entre les RUP. Valeurs d’activation unique pour chaque ou aussi peuvent être calculées qu’en calculant l’aire sous la courbe (AUC) pour chacun ou en additionnant toutes les valeurs de cycle de mesure (Figure 3D).

En outre, dose-dépendante les réponses peuvent être mesurés à l’aide de cette méthode à l’aide de doses croissantes de substance odorante. Nous présentons la réponse d’Olfr1377 à la stimulation de l’acétophénone enregistrée suivant la même procédure (Figure 4). L’acétophénone volatilité peut être évaluée par sa pression de vapeur, qui est égal à 0,44 mm Hg à 25 ° C. À une température donnée, une substance odorante qui possèdent une pression de vapeur plus élevée est plus volatile qu’une substance odorante avec une plus faible pression de vapeur. L’acétophénone est, en conséquence, une odeur moyennement volatil et est exposée à la cellule pure et diluée à 10-2, 10-4, 10-6 et 10-8. Seulement trois concentrations supérieures (pure, 10-2 et 10-4) sont capables d’activer Olfr1377 (Figure 4A). On remarquera également que la stimulation composée pure montre une tendance à diminuer la réponse de l’OR au cours du temps, probablement en raison de la toxicité cellulaire, car il a été démontré pour l’eugénol dans une récente publication32. Néanmoins, nous pouvons observer un comportement de dépendance de dose typique de Olfr1377 (Figure 4B), montrant que cette méthode peut aussi servir pour déterminer la CE50 d’ou de composés volatils.

Notez que lorsque la dose-dépendante des expériences sont effectuées, nous n’aspirez pas nettoyer la chambre luminomètre. Cependant, les expériences sont toujours effectuées de faible à odeur forte, croissante doses afin de minimiser les contaminations. En outre, étant donné que la concentration réelle de molécules odorantes dans les médias de la cellule n’est pas connue, la EC50s obtenue par cette méthode ne sont pas nécessairement comparables à ceux obtenus par la stimulation du liquide. Les valeurs de CE50 déterminées par notre méthode de tenir compte de la volatilité de la substance odorante, la cinétique de dissolution de la substance odorante dans le milieu de la solubilité de la substance odorante et l’affinité entre l’odeur et l’OR, qui sont plus proches de la perception naturelle de l’odeur. Pour notre exemple de la stimulation de la Olfr1377 de l’acétophénone, la valeur CE50 de notre relation dose-effet de la vapeur est 161 µM (0.001874 %), qui est environ 50 fois supérieure à la stimulation liquide (3,28 µM de Saito et al.6). Cette différence entre liquide et vapeur stimulations a été également rapportée par Sanz et coll.20 dans leur essai de stimulation de vapeur où la stimulation vapeur donne 100 à 1000 fois plus faible CE50 que la stimulation liquide.

Figure 1
Figure 1 : Principe de la surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants par odorant vapored. (A), la plaque à 96 puits a été mis dans le déjà équilibré avec chambre luminomètre odeur (nuage violet). (B) vaporisé des molécules odorantes (violet) à la surface de la mémoire tampon de médias cellulaire dissous dedans pour atteindre la cavité de l’OR, à la surface de membrane cellulaire Hana3A. La protéine RTP1S (grise) a été transfectée ainsi, afin de favoriser l’expression à la surface cellulaire de la ro. Si la molécule odorante est un agoniste de l’OR, l’OR passé à un état activé et lié au Golf, déclenchant l’activation de l’adénylate cyclase (AC) et la production d’AMP cyclique (cAMP ; vert). La protéine Glosensor (luciférase) possède un site de liaison pour le cAMP qui, une fois lié, permet à la protéine de lier son ligand, la luciférine (jaune). Le complexe final Glosensor protéine/luciférine/cAMP produit la luminescence qui a été enregistrée pour contrôler l’activation de l’OR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Schématiques protocoles pour la surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants par odorant vapored. La substance odorante (violet) a été diluée à la concentration voulue dans l’huile minérale (A). La solution est ensuite plaquée dans une nouvelle plaque 96 puits, qui a été placée dans la chambre de luminomètre pendant 5 min équilibrer le volume avec vapored odorant après contrôle de la plaque à 96 puits transfectée (B). La solution de la substance odorante a été reversée dans chaque espace entre les puits de la plaque à 96 puits transfectée (voir zoom). La plaque est alors lire pendant 20 cycles dans la chambre de luminomètre équilibrés vapeur odorante (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple de normalisation qui peut être effectuée après l’enregistrement de données. (A) un vecteur vide (négatif) contrôle a été inséré dans le plan de transfection pour être capables d’identifier n’importe quel potentiel activations non-ou odeur spécifique de cellules. Également fourni des renseignements sur la luminescence de fond de la plaque. (B) ou chaque réponse a été normalisée puis en divisant la valeur d’émission de chaque puits de la valeur moyenne du vecteur contrôle dans chaque assiette. Les valeurs de luminescence de chaque OR ont ensuite étés le long des cycles de mesure. (C) ou réponses également puis peuvent être normalisées pour leur activité basale en autre divisant chaque cycle de valeur par la valeur moyenne du cycle 1st de mesure (t = 0 s). (D) l’AUC peut être calculé en additionnant les valeurs d’émission de chaque cycle de mesure. Pour B, C et D, les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM, n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Exemple de doses dépendantes réponses obtenues avec la méthode. (A) la réponse d’Olfr1377 à l’acétophénone a été enregistrée pour les cinq différentes dilutions dans l’huile minérale (10010-2, 10-4, 10-6, 10-8) et sans odeur (0) et normalisé suivant le protocole de normalisation illustré à la Figure 3. (B) les données pendant la mesure cycles a été traduit en une valeur AUC pour chaque dilution. Ce chiffre a été modifié par Kida et al.,32. Ce chiffre est sous un Creative Commons Attribution 4.0 International (CC de 4.0). Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM, n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Par plaque à 96 puits
MEM 500 ΜL
pGlosensor 10 ng
RTP1S 5 ng
OU 75 ng

Tableau 1 : Mix pour la transfection. Quantités de plasmides (protéine de Glosensor, RTP1S et ou) ajouter à MEM à transfecter à une plaque à 96 puits.

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Discussion

La perception des odeurs dépend fondamentalement de l’activation de l’ORs. En conséquence, il faut comprendre leur fonctionnalité pour casser les mécanismes complexes qui le cerveau permet de percevoir son environnement chimique volatile. Cependant, la compréhension de ce processus a été entravée par les difficultés à établir une méthode robuste pour le répertoire de l’OR pour la fonctionnalité contre Odorisants in vitro. d’écran Cellule de surface et hétérologue expression de sor a été partiellement résolue par la création de récepteurs tagged13,19 et par la découverte et l’optimisation des protéines récepteur-transport (SPTR) exprimée en OSNs22 , 23. les premières études de dépistage est apparu ensuite, apportant de nouvelles connaissances à notre compréhension de la fonction ou comme leur substance odorante reconnaissance modèle6,7,26,33, activation mécanisme de34,35, structure tridimensionnelle théorique36,37, évolution38,39, odeur espace40,41, 42et les implications dans la détection d’odeur43,44,45,46. Nous croyons qu’améliorer les méthodes in vitro pourrait stimuler le déchiffrage de l’odeur de codage. Par conséquent, nous avons développé ici une nouvelle méthode de dosage fonctionnel pour permettre la surveillance de l’activation de l’OR en molécules odorantes vaporisé.

Le succès de cette méthode dépend de plusieurs étapes cruciales. Malgré une amélioration ces dernières années, expression hétérologue de certains ORs reste difficile, qui peut influencer la réactivité OR à odeur. L’expression de SRO à la membrane cellulaire peut être évaluée dans une expérience parallèle utilisant l’écoulement cytometry19,24. Notez que les faibles niveaux d’expression à la surface peuvent les réponses robustes encore présents dans la cellule hétérologue systèmes35. Un autre point critique est pour éviter la contamination de la substance odorante. Compte tenu de la sensibilité de ce test, les molécules odorantes de parfum, de nourriture ou test précédent peuvent polluer l’expérience en induisant des réponses d’OR incontrôlées. C’est pourquoi nous vous conseillons de passer l’aspirateur la chambre du luminomètre pendant au moins 2 h, de préférence la nuit, avant d’effectuer un test avec une odeur différente. Il est également important de considérer une cytotoxicité potentielle de la substance odorante utilisée pour l’expérience. Une diminution possible de la réponse de l’OR au cours de la surveillance de 30 min peut montrer que la substance odorante lui-même a un effet négatif sur la santé de la cellule. La cytotoxicité odorantes peut être évaluée en effectuant une analyse de viabilité de cellules après avoir exposé les cellules à la substance odorante. Pour atténuer ce problème, il est possible de n'envisager que les 10 premières min du temps d’enregistrement pour l’analyse des données, la fin de la culture. Nous avons remarqué que la toxicité de la substance odorante survient principalement lorsque la substance odorante est testée pur ou à des concentrations très élevées. La sensibilité de notre essai permet la détection d’odorant dilué dans de l’huile minérale. La concentration optimale pour susciter une réaction maximale varie d’une substance odorante à l’autre, mais nous avons observé qu’une dilution de 1 % suffit à provoquer une saturation d’une réponse d’OR32. Toutefois, certaines molécules odorantes peuvent posséder à faible pression de vapeur (et donc faible volatilité) et peuvent avoir besoin de quelques ajustements à apporter au protocole présenté. Le temps d’incubation de l’odeur dans la chambre de luminomètre ici est situé à 5 min. Nous avons supposé que ce laps de temps suffisant pour équilibrer la chambre avec les molécules volatiles odorantes, mais faible volatilité Odorisants peut exiger des temps d’incubation plus longues.

En dehors de ces points critiques, cette méthode apporte de nombreuses nouvelles possibilités à explorer les relations structure-fonction de substance odorante-interactions OR. L’aspect surveillance en temps réel de cette méthode permet aussi de mieux comprendre la cinétique des événements qui se produisent au cours d’une perception de l’odeur. À titre d’exemple, nous avons utilisé le protocole pour explorer les fonctionnalités d’une enzyme du métabolite, l’estérase carboxyle 1D (Ces1d), trouve à s’exprimer dans la muqueuse olfactive de mammifères,47. Cette enzyme est connue pour convertir des esters d’acide carboxylique et alcool48. La transfection co de Ces1d a montré une modulation des réponses d’OR in vitro de composes d’ester,32 , ce qui démontre que ce nouveau protocole est efficace dans l’exploration de l’importance des enzymes métaboliques dans la détection de la substance odorante. En outre, utiliser cette plateforme pour enquêter sur des mélanges odorants et la façon dont les odeurs sont présentés dans les milieux qui est plus naturels, permettra de futures études dans la compréhension des interactions plus complexes d’odorant. Enfin, la détection des molécules odorantes par ORs est également d’un grand intérêt dans le développement d’un capteur d’odeur. Après avoir montré que notre système peut détecter des molécules odorantes, présentés lors d’une phase vapeur, cette méthode est une première étape dans le processus de développement d’un biocapteur miniaturisé.

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Disclosures

Y.F., H. K et H.M. ont déposé une demande de brevet pertinentes à ce travail sur 27 octobre 2016.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC014423 et DC016224) et le Defense Advanced Research Office RealNose le projet. FJ est resté à l’Université Duke avec l’appui financier du programme JSPS pour faire progresser des réseaux stratégiques International accélérer la Circulation des chercheurs talentueux (R2801). Nous remercions Sahar Kaleem pour l’édition du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % trypsin-EDTA Gibco 25300-054 0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4°C
100 mm cell culture dish  BD Falcon 353003 100 mm x 20 mm cell culture dish 
15 mL tube BD Falcon 352099 17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate Corning 3843 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin Gibco 15290-018 Amphotericin B 250 µg/mL - store at 4 °C
centrifuge machine Jouan C312 Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood NUAIRE NU-407-500 fumehood for cell culturing
FBS Gibco 16000-044 Fetal Bovine Serum - store at -20 °C
GloSensor cAMP Reagent Promega E1290 GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20 °C
Incubator 37 °C; 5 % CO2 Fisher Scientific 11-676-604 Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4 °C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMG LABTECH discontinued 96 well plate reader for luminescence
Mineral oil Sigma M8410 Solvent for odorants - store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM) Corning cellgro 10-010-CV Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine - store at 4 °C
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333 Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20 °C
pGlosensor Promega E2301 pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4 °C
Phase contrast microscope Leica 090-131.001 phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S H. Matsunami lab - 100 ng/µL plasmid - store at 4 °C

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References

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de March, C. A., Fukutani, Y.,… More

de March, C. A., Fukutani, Y., Vihani, A., Kida, H., Matsunami, H. Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase. J. Vis. Exp. (146), e59446, doi:10.3791/59446 (2019).

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