Summary
이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.
Abstract
심근 재생을 위한 세포 치료 효과 향상에 있는 결정적인 요인은 세포 생착 비율을 안전하고 효율적으로 증가하는 것입니다. Y-27632는 로-관련, 코일 코일 함유 단백질 키나아제(RhoA/ROCK)의 매우 강력한 억제제이며 해리-유도 세포 세포 세포 사멸(anoikis)을 예방하는 데 사용됩니다. 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs+RI)에대한 Y-27632 전처리가 급성 심근경색(MI)의 마우스 모델에서 세포 생착율 향상을 초래한다는 것을 입증한다. 여기서, 우리는 Y-27632를 가진 hiPSC-CM 분화, 정화 및 세포 전처리의 완전한 절차, 뿐만 아니라 생성된 세포 수축, 칼슘 과도 측정 및 마우스 MI 모델로의 이식에 대해 설명합니다. 제안된 방법은 세포 생착 속도를 현저하게 증가시키는 간단하고 안전하며 효과적이며 저렴한 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 이식 효율을 더욱 향상시키기 위해 다른 방법과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 심장 질환의 메커니즘에 대한 연구에 유리한 기반을 제공합니다.
Introduction
줄기 세포 기지를 둔 치료는 MI 1에 기인한 심장손상을 위한 처리로 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 차별화된 hiPSCs의 사용은 hiPSC-CMs2의 무한한 공급원을 제공하고 획기적인 치료법의 신속한 발전을 위한 문을 엽니다. 그러나, 이식된 세포의 심각하게 낮은 생착 율의 도전을 포함하여 치료 번역에 많은 한계가 남아 있습니다.
트립신과 세포를 해리하는 것은 anoikis를시작합니다 3, 이는 이 세포가 허혈성 심근과 같은 가혹한 환경에 주입되면 가속되는, 저산소 환경은 세포 죽음을 향한 과정을 가속화. 나머지 세포의, 큰 비율은 혈 류로 이식 사이트에서 밖으로 세척 하 고 주변에 걸쳐 확산. 주요 apoptotic 경로 중 하나는 RhoA/ROCK통로 4. 이전 연구에 기초하여, RhoA/ROCK통로는 세포 기능 장애7,8을담당하는 액틴 세포골격 조직5,6을조절한다. 이 록 억제제 Y-27632는 체세포 및 줄기세포 해리 및 패시징 시 널리 사용되며, 세포 부착을 증가시키고 세포 세포 사멸을 감소시키는데9,10,11. 본 연구에서, Y-27632는 세포 생착 속도를 증가시키기 위한 시도로 이식 전에 hiPSC-CM을 치료하는 데 사용된다.
열 충격 및 지하 막 매트릭스 코팅(12)과 같은세포 생착 속도를 개선하기 위한 여러 가지 방법이 수립되었다. 이러한 방법 외에도, 유전 기술은 또한 심근세포 증식(13)을 촉진하거나 비근신세포(14)로 역전시킬 수 있다. 생명공학적 관점에서, 심근세포는 이식효율을향상시키기 위해 생체 재료 스캐폴드상에 시드된다(15). 불행히도, 이러한 방법의 대부분은 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 반대로, 여기에 제안 된 방법은 간단하고 비용 효율적이며 효과적이며 이식 전 기저 치료뿐만 아니라 다른 기술과의 활용에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
이 연구결과의 모든 동물 절차는 버밍엄에 있는 알라바마 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 건강 실험실 동물 관리 및 사용 지침의 국립 학회 (NIH 간행물 No)에 근거를 두어 85-23).
1. 문화미디어및문화판의준비
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중간 준비
- hiPSC 배지의 경우, 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 기저 배지 (재료표1) 및 hPSC 5x 보충제 의 100 mL의 400 mL를 혼합; 혼합물을 4 °C에 보관하십시오.
- RPMI 1640/B27 마이너스 인슐린(RB-) 매체의 경우, RPMI 1640 의 500 mL과 B27 보충제의 10 mL을 혼합하여 인슐린을 빼내.
- RPMI 1640/B27(RB+) 매체의 경우, RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 페니실린-스트렙토마이신(펜 스트렙) 항생제 5mL를 혼합합니다.
- 정화 매체16의경우, 무포도당 RPMI 1640, B27 보충제 10 mL, 펜 스트렙 항생제 5 mL 및 DL-젖산 나트륨 용액 1,000 μL (최종 농도 4 mM)을 혼합하십시오.
- 중화 용액의 경우, RPMI 1640, 태아 소 혈청 50 mL (FBS), 2.5 mL의 펜 스트렙 항생제, 50 μL의 Y-27632 (최종 농도 10 μM)를 혼합하십시오.
- 동결 매체의 경우, FBS 9 mL, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1mL, Y-27632 10 μL(최종 농도 10 μM)을 혼합합니다.
- 세포외 매트릭스 용액(EMS)의 경우, 4°C에서 집중된 세포외 매트릭스(재료표1)를 균일하게 일관된 액체 상태에 도달할 때까지 해동합니다. 얼음에 각각 350 μL의 매트릭스 aliquots를 만들기 전에 예냉각 파이펫 팁과 튜브, -20 °C에서 알리쿼트저장. 플레이트를 코팅하기 전에, 얼음 차가운 DMEM / F12 배지 (EMS)의 24 mL로 해동 된 알리쿼트 하나를 희석하십시오. EMS를 최대 2주 동안 4°C로 유지하십시오.
참고: 지하 멤브레인 매트릭스 응고를 방지하기 위해 얼음에 모든 코팅 단계를 수행합니다. - Tyrode의 용액의 경우, 최종 필요한 양의 조직 배양 등급의 물을 취하고, 다음 시약의 적당량을 추가하고, 용해될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 1 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 염화나트륨 140 mmol/L, 염화마그네슘 1mmol/L, 염화마그네슘 10m몰/L HEPES, 염화칼륨 5mmol/L, 염화10mmol/L, 염화칼슘 1.8mmol/L의 최종 농도에 물을 추가합니다. 0.22 μm 멤브레인을 사용하여 여과에 의한 살균.
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세포 배양 플레이트 코팅
- hiPSC 배양 플레이트의 경우, 6웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 EMS를 적용하고 37°C에서 적어도 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 세포를 시드하기 전에 흡인 DMEM / F12 용액.
- 젤라틴 코팅의 경우, 0.2 g의 젤라틴 분말을 조직 배양 등급의 물에 용해하여 0.2% (w/v) 용액을 만듭니다. 121°C, 15psi에서 30분 동안 오토클레이브하여 멸균. 용액의 2 mL로 6웰 플레이트의 각 웰을 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 통과하기 전에, 용액을 흡인하고 플레이트가 조직 배양 후드 내부의 실온에서 적어도 1 시간 동안 건조되도록한다.
2. hiPSC 유지 보수 및 심근 세포 분이
- hiPSC 배지에서 hiPSCs를 배양(단계 1.1.1 참조)을 세포가 웰당 80%-90% 합류에 도달할 때까지 일일 배지 변화를 배양합니다.
참고: 유지 보수를 위해 hiPSCs는 일반적으로 4 일마다 통과 할 준비가되어 있습니다. - hiPSCs를 통과하려면 배지를 흡인하고 1x 인산완식염수(PBS)로 잘 1x를 세척합니다. 0.5 mL의 줄기 세포 분리 용액을 추가 (재료의 표1) 각 우물에 5-7 분 동안 37 °C에서 배양.
참고: 배양 시간은 현미경으로 관찰 할 수있는 세포의 밀도와 해리 속도에 달려 있습니다. - 5 μM Y-27632로 보충된 hiPSC 배지 1 mL로 줄기 세포 분리 솔루션을 중화하십시오. 혼합물을 15 mL 원심분리기 튜브에 모읍니다. 200 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상월체를 흡인한 다음, 5 μM Y-27632를 함유하는 hiPSC 배지의 1 mL에서 세포를 재중단한다.
- hiPSCs를 1:6 에서 1:18 사이의 비율로 새로운 EMS 코팅 된 6 웰 플레이트에 시드합니다. 24시간 후에 Y27632 없이 배지를 hiPSC 매체로 변경합니다.
- 세포를 동결시키기 위해, 0.5-1백만/500 μL의 농도로 동결 배지에 해리된 hiPSCs를 다시 중단하고, 현탁액을 극저온에 놓고-80°C 냉동실에 보관하십시오. 24 시간 후에 액체 질소로 냉동 된 바이알을 옮김.
- 분화하기 위해, hiPSC 배지를 80%-90% 세포 합류에서 10 μM GSK-3β 억제제 CHIR99021(CHIR)으로 보충한 2 mL의 RB-배지로 대체한다. 배지를 24시간 후 RB-배지의 3 mL로 교체하고 추가로 48시간(3일째)을 배양한다.
- 3일째에, 48시간(5일째)에 대해 10 μM Wnt 억제제 IWR1로 배지를 3 mL로 바꾼 다음, 배지를 RB-배지의 3 mL로 교체하고 48시간(7일째)동안 유지한다.
- 7일째에는 배지를 RB 배지 3mL로 교체하고 3일마다 배지를 변경합니다. hiPSC-CMs의 자발적인 박동은 일 7-10 사이에서 관찰되어야 합니다.
3. hiPSC-CM 정화 및 소분자 전처리
참고: 고도로 정제된 재조합 세포 해리 효소(표1)를 hiPSC-CM을 해리하는 데 사용하였다.
- hiPSC-CM 분화 후 21일째에 배지를 흡인하고 세포를 멸균 된 PBS로 1 x 씻어 내다. 37 °C에서 5-7 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 세포를 철저히 해리시키기 위해 1 mL 파이펫을 사용하여 셀 현탁액을 반복적으로 피펫.
- 세포가 해리 된 후, 각 우물에 중화 용액 1 mL을 추가하고, 3 분 동안 200 x g에서 15 mL 원심 분리튜브 및 원심 분리기로 세포 혼합물을 수집합니다.
- 웰 당 2 백만 셀의 밀도에서 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 세포를 다시 심는다.
- 24-48 시간 후, 배양 배지를 3-5 일 동안 정제 배지로 대체하십시오.
참고: 각 현미경 시야에서 세포의 90% 이상이 박동할 때 정화가 완료됩니다. 심근 세포의 추가 손상을 방지하기 위해 5 일 이상 정화 기간을 연장하지 마십시오. 첫 번째 라운드가 필요한 순도를 산출하지 않으면 정제 배지를 1 일 동안 RB + 매체로 교체한 다음 두 번째 정화를 완료하십시오. - 이식 에 앞서, 10 μM Y-27632로 보충된 RB+ 배지에서 12시간 동안 치료군에서 세포를 배양하였다. 유사하게, 12 시간 동안 1 μM 베라파밀 (hiPSC-CMs +VER)로 RB+배지의 세포에 베라파밀 치료를 수행합니다.
- 처리 후, HIPSC-CMs 1x를 PBS로 세척하고 최대 2 분 동안 잘 당 0.5 mL의 세포 해리 효소로 세포를 배양하십시오. 중화 용액으로 세포를 중화시키고, 15 mL 원심 분리관에서 세포 혼합물을 수집하고, 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를. 주입을 준비하는 동안 0.1 백만 세포 / 5 μL의 농도로 PBS에서 세포를 다시 중단하십시오.
4. 심근 경색 및 세포 이식
참고: 모든 수술 기구는 오토클레이브로 사전 살균되며 뜨거운 비드 멸균기를 통해 여러 수술 중에 무균 상태로 유지됩니다 (재료표2).
- 흡입 된 이소플루란 (1.5 %-2 %)으로 NOD / scid 마우스 (재료표2)를 마취시킵니다. 발가락 핀치에 마우스의 반응에 의해 마 취 수준을 모니터링 합니다. 수술 중 건조하지 않도록 수의사에게 광학 연고를 눈에 놓습니다.
- 공급 0.1 mg/kg buprenorphine 피하 수술 전에 통증 관리를 위한.
- 가열된 수술대에 마우스를 고정시키고, 제모 크림을 사용하여 복부 목 부위와 왼쪽 흉부에서 모발을 제거하고, 피부를 노출시키고, 70% 알코올로 소독한다.
- 외과 용 가위를 사용하여 목 중앙에 0.5cm 절개를 자르고 피하 지방을 멸균 집게로 분리하고 기관을 노출시다. 기관에 구두로 삽관 캐뉼라를 도입하고, 캐뉼라를 작은 동물 인공호흡기에 연결하고, 환기 설정을 조정합니다(조수량을 100-150 μL로 설정하고 호흡 속도를 분당 100x-150x로 설정).
- 마우스가 안정된 후 왼쪽 가슴 피부 의 중간에 0.5 cm 절개를 잘라. 집게를 사용하여 근육 층을 무뚝뚝하게 분리하고 다섯 번째 늑간 공간에서 작은 절개를 하여 흉강을 노출시십시오. 절개에 리트랙터를 배치하여 흉강을 열고 왼쪽 내림차순 관상 동맥 (LAD)을 찾습니다. 해부 수술 현미경으로, 8-0으로 LAD를 리게이트 흡수할 수 없는 봉합사.
- MI 유도 직후, hiPSC-CM-RI,hiPSC-CM+RI,hiPSC-CM-VER,hiPSC-CMs+VER또는 각 부위에 마우스의 심근에 동일한 양의 PBS를 주입합니다(3 x 105 세포/동물, 1 x 105 세포 / 사이트), 경색 지역에 하나 와 경색 주변 지역에 두.
참고: 5 μL은 매우 작은 부피이기 때문에 주사기로 직접 빨아서 부피를 정확하게 제어하는 것은 쉽지 않습니다. 멸균 페트리 접시의 뚜껑을 뒤집을 수 있으며, 세포의 5 μL은 먼저 피펫으로 뚜껑에 증착 될 수있다. 표면 장력으로 인해 확산되지 않지만 작은 액체 덩어리로 응축됩니다. 이것은 마우스의 심근에 쉽게 흡수되고 주입될 수 있습니다. - 따뜻한 소독식 식염수로 채우어 흉부 구멍의 잔류 공기를 제거합니다. 6-0 흡수성 봉합사로 갈비뼈, 근육 및 피부를 순차적으로 바느질하십시오. 이소플루란 마취 주사를 끕니다. 가열 패드에 수술 동물을 유지하고 밀접하게 그들이 전체 의식을 회복하는 동안 그들을 관찰. 그런 다음 동물을 깨끗한 케이지에 놓습니다. 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 동물을 돌려보내지 마십시오.
- 수술 후, 부프레노르핀(0.1 mg/kg)으로 생쥐를 12일 동안 12회 씩 연속적으로 주입하고 12시간마다 이부프로펜(5 mg/kg)으로 주사하십시오. 지정된 시점에서 후속 해석 스터디를 수행합니다.
참고: 지역 동물 관리 위원회 지침을 따라 진통제를 확인하십시오.
5. 칼슘 과도 및 수축력 기록
- 오토클레이브 15 mm 직경 커버립 (재료의 표2) 및 핀셋은 121 ° C에서 작은 유리 비커에, 15 분 동안 15 psi. 4 °C에서 커버 립과 핀셋을 미리 냉각.
- 핀셋을 사용하여 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 각 커버슬립에 세포외 매트릭스의 파이펫 300μL을 놓습니다.
참고: 매트릭스가 매트릭스 코팅 량을 줄이는 것을 방지하기 위해 커버 슬립의 가장자리를 초과하지 마십시오. 12웰 플레이트를 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다. - 정제 된 hiPSC-CS로 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 PBS로 1 x 씻어 낸 다음 0.5 mL의 세포 해리 효소로 1.5 분 동안 소화합니다. 중화 액 1 mL을 추가하고 1 mL 파이프로 5x -10x 를 반복적으로 피펫을 추가하십시오. , 혼합물을 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리한다.
- 커버립에서 코팅 된 세포 외 매트릭스를 흡인합니다. 세포 수를 계산하고 중화 용액에서 세포를 40,000/300 μL의 농도로 다시 일시 중단한 다음 각 커버슬립에 300 μL의 셀 현탁액을 추가합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 배양하였다.
- 24 시간 후, 부드럽게 중화 된 용액을 흡인하고, 플레이트의 각 우물에 500 μL의 RB + 배지를 추가하고 2 일 동안 배양을 계속합니다.
- Y-27632 (10 μM), 로키나아제 활성제 (RA, 100 nM), 베라파밀 (1 μM) 또는 HIPSC-CM의 배양 배지에 동일한 부피의 PBS를 첨가하고, 칼슘 과도 및 수축성 검출 전에 12 시간.
참고: 화학적 처리 의 12 시간 후에 세포의 칼슘 과도 및 수축성의 검출 이외에, 이들 파라미터의 검출은 또한 화학적 금단 후 12, 24, 48 및 72 시간에서 시험되었다. - 접시를 꺼내 매체를 버리고 PBS로 플레이트를 1x 씻습니다. 계면활성제 폴리올(재료표1), 5 μM 칼슘 표시기(재료표1), 해당 Y-27632(10M), RA(100 nM), 베라파밀(1 μM) 또는 동일한 부피를 함유하는 페놀-적색 이물질이 없는 DMEM으로 배지를 변경 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양한다.
- 상판액을 버리고, 세포를 염료가 없는 DMEM 배지로 3x 세척하고, 배지를 30분 간 쉬게 하여 매핑 염료를 제거한다.
- 세포 씨드 커버슬립을 개탕 챔버에 넣고 자동 온도 조절기(재료표2)로 37°C에 평형으로 조정된 마이크로 인큐베이션 시스템에 챔버를 삽입하고 Tyrode의 용액과 함께 주입하고 지속적으로 추가합니다. 로키나아제 억제제(RI), RA, 또는 PBS를 관류 용액으로.
- 거꾸로 된 형광 현미경 (재료표2)과 레이저 스캐닝 헤드 (재료표2)를 사용하여 x-t 라인 스캔을 사용하여 자발적인 칼슘과 과도성을 기록하고, 염료 여기및 515 ± 10 nm에 대한 488 nm 아르곤 레이저를 사용하여 배리어 필터를 사용하여 방출 광을 수집합니다. 공초점 현미경의 차동 간섭 대비 기능을 사용하여 hiPSC-CM의 자발적인 수축을 기록합니다(재료표2).
참고: 칼슘 과도 기록은 MATLAB R2016A 소프트웨어(재료표 4)를사용하여 처리 및 분석하였다. 세포 수축 변화 분석제는 ImageJ 소프트웨어를사용하여 수행하였다(자료표 4).
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Representative Results
본 연구에 사용된 hiPSC-CM은 루시퍼라제 리포터 유전자를 가진 인간 기원으로부터 유래되었다; 따라서 생체 내 이식 된 세포의 생존율은 생물 발광 이미징 (BLI)17 (도 1A,B)에 의해 검출되었다. 조직학적 심장 절편을 위해, 인간 특이적 심장 트로포닌 T(hcTnT) 및 인간 핵 항원(HNA) 이중 양성세포는 이식된 hiPSC-CM으로 분류하였다(그림 1C). 두 결과 모두 Y-27632 전처리가 세포 생착 속도를 현저하게 향상시켰습니다. hiPSC-CM+RI 군의 루시퍼라아제 활성은 이식 후 3일, 7일 및 28일에 대략 6배 증가하였으며, hiPSC-CM-RI 군의 그것과 비교하였다(도 1B). 더욱이, hcTnT/HNA 발현은 hiPSC-CM+RI 군에서 7배 가까이 증가하되, hiPSC-CM-RI 군에서에 비해(도 1C).
결과는 또한 Y-27632 이식된 세포에 있는 세포골격 변경을 통제한 전처리가 표시했습니다. 이식의 7 및 28일에, hiPSC-CMs+RI는 hiPSC-CMs-RI에 비해 더 크고 더 정의된 막대 모양의 세포골격 구조를 나타내었다(도1D).
더욱이, Y-27632 전처리는 생체 내에서 이식된 hiPSC-CM 세포자멸을 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있다. TUNEL 염색은 이식 후 2일째에 hiPSC-CM-RI 군에서 그에 비해 HIPSC-CM+RI 군에서 TUNEL 양성 세포의 수가 유의하게 감소하였다는 것을 보여주었다(도 1E).
ROCK 억제는 이식된 세포의 부착을 촉진하고 투여 부위에서 이식된 세포의 보유를 더욱 증가시킬 수 있는 잠재력을 가졌다. 서양 얼룩 및 심장 조직 면역 스테인은 Y-27632 전처리가 인테그린 β1 및 N-카데린의 증가된 발현을 가역적으로 촉진하고 인포스포미오신 경망 2(p-MLC2)의 발현을 감소시켰다(그림2A,B) ).
마우스 세포주 HL-1은 시험관내 세포 부착 실험을 위한 대조군 CS로서 선택되었다. 결과는 Y-27632 전처리가 HL-1에 비해 hiPSC-CM 순응도를 현저하게 증가시켰다는 것을 나타냈다. 이러한 발견을 추가로 확인하기 위해, hiPSC-CMs+RI는 N-카데린 또는 인테그린 β1 중화 항체를 1시간 동안 배양하였고, 그 결과 이전에 보였던 향상된 접착력의 소실을 초래하였다(도2C).
hiPSC-CM-RI 군과 비교하여, hiPSC-CM+RI 군의 수축력이 32% 감소하였고, hiPSC-CM+RA군(ROCK 활성제, 표1)에서 42% 증가하였다( 그림3A). 한편, hiPSC-CM-RI 군과 비교하여, hiPSC-CM+RI 군에 대한 피크 칼슘 과도 형광(Peak ΔF/F 0)은 41% 감소하였고, 칼슘 과도 지속시간(CaTD50)은 11% 감소하였다(그림 3B) ,C)를참조하십시오. 대조적으로, hiPSC-CM+RA 군에 대한 피크 ΔF/F0은 48% 증가하였고, CaTD50은 13% 증가하였다(도3B,C).
또한, 이식 전 12시간 동안 Y-27632를 가진 심근세포의 전처리는 cTnI 및 cTnT(그림3D)의 발현을 현저히 감소시켰으며, 둘 다 심근세포 수축을 조절하는 트로포닌(Tn) 소단위이다.
Y-27632와 유사하게, 베라파밀 전처리(1 μM, 12h)는 유도된 MI 마우스에서 hiPSC-CM의 생착 속도를 현저히 증가시다. 가설은 생물발광 분석(도4A)에서증가된 루시퍼라아제 신호의 관찰을 통해 확인되었으며, 세포 이식 후 7일과 28일에 hcTnT/HNA 이중 양성 세포의 수가 증가하였다(도4B).
도 1: Y-27632 전처리는 MI 마우스 심장에서 hiPSC-CM의 생착 속도를 증가시었다. (A) BLI 측정의 표준 곡선. (B) 수술 후 3일, 7일 및 28일에 PBS, hiPSC-CM-RI 또는 hiPSC-CMs+RI로 처리된 NOD/scid 마우스에서루시페린 신호를 시그널. n = 그룹당 6-9마우스. *P < 0.05 대 PBS; • • P < 0.05 vs. hiPSC-CM-RI. (C) hcTnT 및 HNA에 대한 심장 절편면역 염색. 배율 막대 = 100 μm (10x 이미지); 20 μm (40x 이미지). n = 그룹당 5마우스. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI. (D) 남근과 hcTnT로 얼룩진 심장 부분의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 20 μm. n = 그룹당 5마우스. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI. (E) TUNEL 염색을 위한 하트 섹션의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 20 μm. n = 그룹당 4-6 마우스. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI. 이 그림은 Zhao 등 에서 수정되었습니다.18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Y-27632는 접착 단백질의 발현을 유지함으로써 hiPSC-CM의 접착력을 향상시켰습니다. (A 및 B)RI로 처리된 HIPSC-CM에서 의 인테그린 ß1, N-카데린 및 인산화의 인산화및 비처리 hiPSC-CM에서의 서방 블롯 분석. n=5군당 복제. (C) hcTnT 면역형광 염색 분석 -RI 및 +RI hiPSC-CM의 항-N-Cad(N-Cad) 및 항인테그린 ß1(Integ) 항체의 전처리 유무에 관계없이. 배율 막대 = 100 μm. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI; • • P < 0.05 vs. hiPSC-CM+RI. 이 그림은 Zhao 등 에서 수정되었습니다.18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Y-27632를 가진 전처리는 hiPSC-CMs의 수축성을 감소시키고 심장 트로포닌 소단위의 표정을 아래로 조절했습니다. (A) RI 및 RA 치료에 노출된 hiPSC-CM의 단축 비율의 정량화. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI; • • P < 0.05 vs. hiPSC-CM+RI. (B 및 C)RI 및 RA및 비처리군으로 처리된 hiPSC-CM의 대표적인 이미지와 칼슘 과도 측정의 정량화. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-RI; • • P < 0.05 vs. hiPSC-CM+RI. (D) RI 및 RA로 처리된 hiPSC-CM에서 심장 트로포닌 소단위(cTnC, cTnT 및 cTnI)의 발현을 서방 블롯 분석 및 비처리군에서. 이 그림은 Zhao 등 에서 수정되었습니다.18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: Verapamil 전처리는 MI 마우스에서 hiPSC-CM의 생착 속도를 향상하였다. (A) 수술 후 3일, 7일 및 28일에 PBS, hiPSC-CM-VER또는 hiPSC-CM+VER로 처리된 NOD/scid 마우스에서 루시페린 신호를 시그널. n = 그룹당 8개의 마우스. *P < 0.05 대 PBS; • • P < 0.05 vs. hiPSC-CM-VER . (B) hcTnT 및 HNA에 대한 심장 절편면역 염색. 10x 이미지의 경우 배율 막대 = 100 μm(10x 이미지); 20 μm (40x 이미지). n = 그룹당 5마우스. *P < 0.05 대 hiPSC-CM-VER . 이 그림은 Zhao 등 에서 수정되었습니다.18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구의 주요 단계는 순수한 hiPSC-CM을 획득하고, Y-27632 전처리를 통해 hiPSC-CM의 활성을 개선하고, 마지막으로 정확한 양의 hiPSC-CM을 마우스 MI 모델로 이식하는 것을 포함합니다.
여기서 해결된 주요 이슈는 우선 포도당 없는 정제 방법19를 최적화하고 새로운 효율적인 정화 시스템을 구축했다는 것입니다. 시스템 절차에는 세포 해리 효소를 적용하고, 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 이식하고, 반응 후 24 시간 동안 중화 배지에서 세포를 배양하고, 이식 전에 세포의 소화 시간을 최소화하는 것이 포함되었습니다. 그 중 순수한 심근 세포를 얻는 동안 세포의 가장 높은 활성을 달성하기 위해 수행되었다.
둘째, 우리는 세포 주입 전에 12 시간에서 Y-27632를 가진 hiPSC-CM의 전처리에 정교하게 했습니다. anoikis는 일반적으로 세포 '접착 단백질의 변형에 의해 유도, 인테그린등 4,20 및 N-cadherin21,그 세포 자멸 경로의 활성화로 이어질. 우리는 Y-27632 전처리가 세포골격의 변화와 관련된 p-MLC2의 발현을 억제하여 인테그린 β1 및 N-카데린의 발현을 유지함으로써 이식 부위에 hiPSC-CM의 부착을 촉진할 수 있음을 입증했습니다. 아키텍처22,23. hiPSC-CM 이식 후 7일 후, hiPSC-CMs+RI는 hiPSC-CMs-RI에 비해 더 큰 세포 생착 영역, 더 미세한 정의된 막대 모양 및 보다 완전한 세포골격 조직(도 1B-D)을 초래하였다.
셋째, 마우스 MI 모델에서 새로운 세포 내 주사 시스템을 구축하되, 주사 당 5 μL을 정확하게 주입하여 필요한 수의 세포를 정확하게 주입하는 동시에 과도한 주사 량으로 인한 마우스 생존율의 감소를 피하였다.
넷째, 우리는 RI 또는 RA를 가진 전처리 후에 hiPSC-CM에 있는 세포 수축 그리고 칼슘 과도에 있는 변경을 결정하는 방법에 정교하게 했습니다. 우리는 Y-27632가 세포 수축성과 칼슘 과도성을 가역적으로 감소시킬 수 있다는 것을 발견했습니다. 여기서 가설은 이식된 세포의 낮은 에너지 요구량으로 인해 생착 속도가 증가한다는 것입니다. 유사한 효과는 칼슘 채널 억제제 verapamil를 사용하여 달성될 수 있다. 수축성 억제의 결과로 제안된 메커니즘은 Y-27632가 hiPSC-CM에서 트로포닌 소단위 cTnT 및 cTnI의 발현을 감소시킨다는 것입니다.
주요 제한은 Y-27632만 이식 하는 동안 일시적인 역할을 했다. 로키나아제의 장기간 저해하는 방법은, hiPSC-CM의 이식 효율을 더욱 향상시켜, 향후 해결해야 할 문제이다. 이 방법의 더 많은 응용 프로그램에 관해서는, ROCK 억제제는 이식 하는 동안 심근 세포의 활동을 향상 시킬 뿐만 아니라 다른 세포의 활동을 향상 시킬 수 있습니다.; 따라서, 그것은 또한 다른 세포의 이식 과정에서 전처리 중에 사용될 수있다. 또한, 여기에 제시 된 접근은 심장 질환에 대한 더 많은 연구를위한 좋은 실험 기반을 마련.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 조셉 C. 우 박사에게 감사드립니다 (스탠포드 대학) 친절하게 Fluc-GFP 구조와 박사 얀웬 리우 우수한 기술 지원을 제공. 이 연구는 국립 보건원 에서 지원되는 HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (J.Z.), HL121206A1 (L.Z.), R56 보조금 HL142627 (미국 하트 협회) 16SDG30410018, 버밍엄 학부 개발 보조금에서 앨라배마 대학 (W.Z.에).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
