Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं और कैसे cardiomycyte भेदभाव और शुद्धि के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने पर विस्तृत, और आगे, कैसे Rho-संबद्ध प्रोटीन kinase अवरोध करनेवाला के साथ अपने प्रत्यारोपण दक्षता में सुधार करने के लिए पर एक माउस मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में पूर्व उपचार।
Abstract
मायोकार्डियल पुनर्जनन के लिए सेलुलर चिकित्सा प्रभावशीलता में सुधार लाने में एक महत्वपूर्ण कारक सुरक्षित रूप से और कुशलता से सेल engraftment दर में वृद्धि करने के लिए है. Y-27632 Rho-associated, coiled-कुंडल युक्त प्रोटीन kinase (RhoA/ROCK) का एक अत्यधिक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला है और वियोजन प्रेरित सेल apoptosis (anoikis) को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि Y-27632 मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomycytes (HIPSC-CMs+RI) के लिए pretreatment तीव्र मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) के एक माउस मॉडल में एक सेल engraftment दर में सुधार में प्रत्यारोपण के परिणाम से पहले. यहाँ, हम Y-27632 के साथ hiPSC-CMs भेदभाव, शुद्धि, और सेल pretreatment की एक पूरी प्रक्रिया का वर्णन, साथ ही जिसके परिणामस्वरूप सेल संकुचन, कैल्शियम क्षणिक माप, और माउस एमआई मॉडल में प्रत्यारोपण. प्रस्तावित विधि एक सरल, सुरक्षित, प्रभावी, और कम लागत वाली विधि प्रदान करती है जो सेल engraftment दर को काफी बढ़ाती है। इस विधि केवल अन्य तरीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता आगे सेल प्रत्यारोपण दक्षता बढ़ाने के लिए, लेकिन यह भी अन्य हृदय रोगों के तंत्र के अध्ययन के लिए एक अनुकूल आधार प्रदान करता है.
Introduction
स्टेम सेल आधारित उपचार एमआई1की वजह से हृदय क्षति के लिए एक इलाज के रूप में काफी क्षमता दिखाई है. विभेदित HIPSCs का उपयोग HIPSC-CMs2 का एक अटूट स्रोत प्रदान करता है और सफलता उपचार के तेजी से विकास के लिए दरवाजे खोलता है। हालांकि, चिकित्सीय अनुवाद के लिए कई सीमाएं बनी हुई हैं, प्रत्यारोपित कोशिकाओं की गंभीर रूप से कम engraftment दर की चुनौती भी शामिल है.
ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को अलग करने से एनोकिकिस3शुरू होता है, जो केवल एक बार इन कोशिकाओं को इस्केमिक मायोकार्डियम जैसे कठोर वातावरण में इंजेक्ट किए जाने के बाद त्वरित होता है, जहां हाइपोक्सिक वातावरण सेल मौत की ओर पाठ्यक्रम को तेज करता है। शेष कोशिकाओं में से, एक बड़ा अनुपात प्रत्यारोपण साइट से खून में धोया जाता है और परिधि में फैल जाता है। एक प्रमुख apoptotic रास्ते में से एक RhoA / रॉक पथ4है. पिछले अनुसंधान के आधार पर, RhoA/ROCK मार्ग actin cytoskeletal संगठन5,6, जो सेल रोग7,8के लिए जिम्मेदार है नियंत्रित करता है. रॉक अवरोधक Y-27632 व्यापक रूप से दैहिक और स्टेम सेल वियोजन और passaging के दौरान प्रयोग किया जाता है , सेल आसंजन बढ़ाने के लिए और सेल apoptosis9को कमकरने केलिए ,10,11. इस अध्ययन में, Y-27632 सेल engraftment दर को बढ़ाने के प्रयास में प्रत्यारोपण से पहले HIPSC-सीएम के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है.
सेल engraftment दर में सुधार करने के उद्देश्य से कई तरीकों, गर्मी सदमे और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग12के रूप में, स्थापित किया गया है. इन तरीकों के अलावा, आनुवंशिक प्रौद्योगिकी भी कार्डियोमायोसाइट प्रसार को बढ़ावा कर सकते हैं13 या कार्डियोमायोसाइट्स14में nonmyocardial कोशिकाओं रिवर्स . जैव इंजीनियरिंग के नजरिए से, कार्डियोमायोसाइट्स को प्रत्यारोपण दक्षता15में सुधार करने के लिए बायोमैटेरियल पाड़ पर बीज दिया जाता है। दुर्भाग्य से, इन तरीकों के बहुमत जटिल और महंगा कर रहे हैं. इसके विपरीत, यहाँ प्रस्तावित विधि सरल, लागत कुशल, और प्रभावी है, और यह प्रत्यारोपण से पहले एक बेसल उपचार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में.
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Protocol
इस अध्ययन में सभी पशु प्रक्रियाओं बर्मिंघम में अलबामा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया और स्वास्थ्य प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देश के राष्ट्रीय संस्थानों पर आधारित थे (NIH प्रकाशन नहीं 85-23).
1. संस्कृति मीडिया और संस्कृति प्लेट्स की तैयारी
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मध्यम तैयारी
- HIPSC माध्यम के लिए, मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) बेसल मध्यम (सामग्री की तालिका 1) और 100 एमएल एचपीएससी 5x पूरक के मिश्रण; मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- RPMI 1640/B27 ऋण इंसुलिन (आरबी-) माध्यम के लिए, आरपीएमआई 1640 के 500 एमएल और बी 27 पूरक ऋण इंसुलिन के 10 एमएल मिश्रण.
- RPMI 1640/B27 (RB+) माध्यम के लिए, आरपीएमआई 1640 के 500 एमएल, बी 27 पूरक के 10 एमएल, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) एंटीबायोटिक के 5 एमएल को मिलाएं।
- शुद्धि माध्यम के लिए16, मिश्रण 500 एमएल नहीं-ग्लूकोज RPMI 1640, B27 पूरक के 10 एमएल, कलम-स्ट्रेप एंटीबायोटिक के 5 एमएल, और सोडियम डीएल-लैक्टेट समाधान के 1,000 $L (4 एमएम की एक अंतिम एकाग्रता पर)।
- समाधान को निष्क्रिय करने के लिए, आरपीएमआई 1640, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल, कलम-स्ट्रेप एंटीबायोटिक के 2.5 एमएल, और वाई-27632 के 50 डिग्री एल (10 डिग्री सेल्सियस की अंतिम एकाग्रता पर) का मिश्रण करें।
- हिमन माध्यम के लिए, एफबीएस के 9 एमएल, डाइमेथिल सल्फाइड (डीएमएसओ) का 1 एमएल और 10 डिग्री सेल्सियस का Y-27632 (10 डिग्री सेल्सियस) का अंतिम सांद्रता मिलाएं।
- बाह्यीय मैट्रिक्स विलयन (ईएमएस) के लिए, यह एक समान रूप से संगत द्रव अवस्था तक नहीं पहुंच जाता है, जब तक कि वह 4 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (सामग्रीकी सारणी 1) तक केंद्रित न हो जाए। पहले से कूल पिपेट युक्तियाँ और ट्यूब 350 डिग्री सेल्सियस के मैट्रिक्स aliquots बनाने से पहले बर्फ पर प्रत्येक, और -20 डिग्री सेल्सियस पर alicuots की दुकान. प्लेटों को कोटिंग से पहले, बर्फ ठंडा DMEM/F12 मध्यम (ईएमएस) के 24 एमएल में एक thawed aliquot पतला; अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में ईएमएस रखने के लिए।
नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स solidification को रोकने के लिए बर्फ पर सभी कोटिंग कदम प्रदर्शन. - Tyrode के समाधान के लिए, ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के अंतिम आवश्यक मात्रा का 90% ले, निम्नलिखित अभिकर्मकों की उचित मात्रा में जोड़ने के लिए, और भंग जब तक हलचल. उसके बाद, pH को 7.4 में समायोजित करने के लिए 1 N NaOH का उपयोग करें। 140 mmol/L सोडियम क्लोराइड, 1 mmol/L मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L पोटेशियम क्लोराइड, 10 mmol/L ग्लूकोज, और 1.8 mmol/L कैल्शियम क्लोराइड की अंतिम सांद्रता में अतिरिक्त जल जोड़ें। निस्पंदन द्वारा बाँझ, एक 0.22 डिग्री झिल्ली का उपयोग कर.
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सेल संस्कृति प्लेट लेपन
- HIPSC संस्कृति प्लेटकेलिए, 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं पर 1 एमएल ईएमएस लगाएं और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 h के लिए इनक्यूबेट करें। बीज कोशिकाओं से पहले Aspirate DMEM/
- जिलेटिन कोटिंग के लिए, ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी में 0.2 ग्राम जिलेटिन पाउडर को भंग करके 0ण्2% (w/v) घोल बनाते हैं। 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई पर ऑटोक्लेवद्वारा बंध्याकरण करें। समाधान के 2 एमएल के साथ 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं passaging से पहले, समाधान aspirate और प्लेट ऊतक संस्कृति हुड के अंदर कमरे के तापमान पर कम से कम 1 एच के लिए सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं।
2. HIPSC रखरखाव और कार्डियोमायोसाइट भेदभाव
- HIPSC माध्यम में hiPSCs संस्कृति (चरण 1.1.1) एक दैनिक मध्यम परिवर्तन के साथ देखें जब तक कोशिकाओं को 80%-90% अच्छी तरह से प्रति संगम तक पहुँचने.
नोट: रखरखाव प्रयोजनों के लिए, hiPSCs आम तौर पर हर 4 दिनों में पारित होने के लिए तैयार हैं। - HIPSCs पारित करने के लिए, मध्यम aspirate और 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ अच्छी तरह से धो लें। प्रत्येक कुएं में 0ण्5 एमएल स्टेम सेल टुकड़ी विलयन (सामग्रीकी सारणी 1) जोड़ें और 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: ऊष्मायन समय कोशिकाओं के घनत्व और वियोजन की दर पर निर्भर करता है, जिसे सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखा जा सकता है। - स्टेम सेल टुकड़ी समाधान hiPSC मध्यम के 1 एमएल के साथ बेअसर 5 डिग्री एम Y-27632 के साथ पूरक. मिश्रण को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लीजिए। 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, सेल गोली को परेशान किए बिना सुपरनेंट को प्रेरित करें, और फिर, 5 डिग्री एम वाई-27632 युक्त HIPSC माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से चालू करें।
- एक नया ईएमएस लेपित 6-वेल प्लेट पर 1:6 से 1:18 के बीच के अनुपात में hiPSCs बीज. 24 ज के बाद Y27632 बिना hiPSC माध्यम के लिए माध्यम बदलें।
- कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, ठंड के माध्यम में अलग किए गए hiPSCs को 0.5-1 मिलियन/500 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता पर पुन: स्फूर्त करें, क्रायोविएल्स में निलंबन रखें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। जमे हुए शीशियों को 24 ज के बाद तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
- अंतर करने के लिए, HIPSC माध्यम को 2 एमएल आरबी-मध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें, जो 10 $M GSK-3] अवरोधक CHIR99021 (CHIR) के साथ 80%-90% सेल-संगम पर पूरक है। 24 ज के बाद आरबी- मध्यम के 3 एमएल के साथ मध्यम को बदलें और एक अतिरिक्त 48 एच (दिन 3) के लिए इनक्यूबेट करें।
- 3 दिन, आरबी के 3 एमएल के लिए मध्यम बदलने के लिए मध्यम- मध्यम के साथ 10 $M Wnt अवरोध कनेर IWR1 48 h (दिन 5) के लिए, और फिर आरबी के 3 एमएल के साथ मध्यम की जगह- मध्यम और 48 एच (दिन 7) के लिए बनाए रखने.
- 7 दिन, आरबी माध्यम के 3 एमएल के साथ मध्यम की जगह और मध्यम हर 3 दिन आगे जा बदल जाते हैं. दिन 7-10 के बीच HIPSC-CMs की सहज पिटाई देखी जानी चाहिए।
3. HIPSC-CMs शुद्धि और छोटे अणु पूर्व उपचार
नोट: अति शुद्ध, पुनः संयोजक कोशिका-वियोजन एंजाइम (सामग्री की तालिका 1) hiPSC-CMs को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
- 21 दिन HIPSC-CM भेदभाव के बाद, मध्यम aspirate और बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं 1x धो लो. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए सेल-वियोजन एंजाइमों के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके सेल सस्पेंशन को बार-बार पाइपेट करें।
- कोशिकाओं के अलग होने के बाद, प्रत्येक कुएं में विलयन को निष्क्रिय करने के 1 एमएल को मिलाकर, सेल मिश्रण को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्रित करें और 200 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रण करें। सुपरनेंट को त्याग दें और कोशिकाओं को उदासीन करने वाले घोल में फिर से डालें।
- प्रति अच्छी तरह से 2 लाख कोशिकाओं के घनत्व पर जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर कोशिकाओं को पुन: रोपण।
- 24-48 ज के बाद, 3-5 दिनों के लिए शुद्धि माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह.
नोट: शुद्धि पूरा हो गया है जब प्रत्येक माइक्रोस्कोप दृश्य क्षेत्र में कोशिकाओं के 90% से अधिक पिटाई कर रहे हैं. कार्डियोमायोसाइट्स को और अधिक नुकसान को रोकने के लिए, 5 दिनों से अधिक शुद्धि अवधि का विस्तार न करें। यदि पहले दौर में आवश्यक शुद्धता नहीं मिलती है, तो शुद्धि माध्यम को 1 दिन के लिए आरबी + माध्यम से बदलें, और फिर शुद्धि के दूसरे दौर को पूरा करें। - प्रत्यारोपण से पहले, आरबी में 12 एच के लिए उपचार समूह में कोशिकाओं संस्कृति + मध्यम 10 डिग्री एम वाई-27632 के साथ पूरक. इसी प्रकार, आरबी + माध्यम में कोशिकाओं पर वेरापामिल उपचार करें जिसमें 12 एच (आईपीएससी-सीएम+वर) के लिए 1 डिग्री एम वेरापैमिल है।
- उपचार के बाद, पीबीएस के साथ HIPSC-CMs 1x धो लें और कोशिकाओं को अधिकतम 2 मिनट के लिए प्रति सेल-वियोजन एंजाइमों के 0.5 एमएल के साथ इनक्यूबेट करें। कोशिका निलंबन को बार-बार पिपेट करें, 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, कोशिकाओं को अच्छी तरह से अलग करने के लिए। समाधान को निष्क्रिय करने वाले कोशिकाओं को निष्क्रिय करें, 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल मिश्रण एकत्र करें, और 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें। इंजेक्शन के लिए तैयारी में पीबीएस में कोशिकाओं को 0.1 मिलियन कोशिकाओं/5 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता पर पुन: निलंबित करें।
4. मायोकार्डियल इन्फेक्शन और सेल ट्रांसप्लांटेशन
नोट: सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों autoclave के साथ presterilized कर रहे हैं और एक गर्म मनका sterilizer के माध्यम से कई सर्जरी के दौरान aseptic हालत में बनाए रखा जाता है (सामग्री की तालिका 2).
- एनओडी/स्किड चूहों (सामग्री की तालिका 2) श्वास आइसोफ्लुरेन (1.5%-2%) के साथ एनेस्थेटाइज करें। एक अंगुली चुटकी करने के लिए चूहों की प्रतिक्रियाओं द्वारा संज्ञाहरण के स्तर की निगरानी करें। सर्जरी के दौरान उन्हें सुखाने से रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक ऑप्टिकल मरहम रखें।
- सर्जरी से पहले दर्द प्रबंधन के लिए आपूर्ति 0.1 मिलीग्राम/किलोग्राम buprenorphine subcutaneously.
- स्थिति और एक गर्म ऑपरेटिंग टेबल पर एक supine स्थिति में माउस को सुरक्षित, अधर गर्दन क्षेत्र और एक depilatory क्रीम का उपयोग कर छोड़ दिया छाती से बाल हटा दें, त्वचा का पर्दाफाश, और यह 70% शराब के साथ कीटाणुरहित.
- सर्जिकल कैंची का उपयोग कर गर्दन के केंद्र में एक 0.5 सेमी चीरा कट, बाँझ संदंश के साथ subcutaneous वसा अलग, और श्वासनली का पर्दाफाश. श्वासनली में मौखिक रूप से intubation cannula परिचय, एक छोटे जानवर वेंटीलेटर के लिए cannula कनेक्ट, और वेंटिलेशन सेटिंग्स को समायोजित (पर ज्वारीय मात्रा सेट 100-150 $L और श्वसन दर 100x-150x प्रति मिनट) पर.
- माउस स्थिर होने के बाद, बाएं छाती की त्वचा के बीच में 0.5 सेमी चीरा काट ें। छाती गुहा का पर्दाफाश करने के लिए मांसपेशियों की परत को कुंद रूप से अलग करने और पांचवें इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए संदंश का उपयोग करें। वक्ष गुहा खोलने के लिए और बाएं अवरोही कोरोनरी धमनी (एलएडी) का पता लगाने के लिए चीरा में आकुंचक रखें। एक विच्छेदन शल्य माइक्रोस्कोप के तहत, एक 8-0 के साथ लाड ligate अशोषक सीवन.
- एमआई प्रेरण के तुरंत बाद, 5 $L hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs+RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs+VER,या प्रत्येक साइट पर माउस के मायोकार्डियम में पीबीएस के बराबर मात्रा (3 x 105 कोशिकाओं/ कोशिकाओं /साइट), infarct क्षेत्र में एक और दो infarct के आसपास के क्षेत्रों में.
नोट: चूंकि 5 डिग्री सेल्सियस बहुत छोटी मात्रा है, यह सीधे एक सिरिंज के साथ चूसने से मात्रा को सही ढंग से नियंत्रित करने के लिए आसान नहीं है। एक बाँझ पेट्री डिश के ढक्कन पर दिया जा सकता है, और कोशिकाओं के 5 डिग्री एल पहले एक पिपेट के साथ ढक्कन पर जमा किया जा सकता है। सतह तनाव के कारण, यह नहीं फैल जाएगा, लेकिन एक छोटे तरल द्रव्यमान में गाढ़ा होगा। यह आसानी से अवशोषित किया जा सकता है और माउस के मायोकार्डियम में इंजेक्शन. - इसे गर्म आइसोटोनिक लवण समाधान के साथ भरकर वक्ष गुहा में अवशिष्ट हवा को हटा दें। एक 6-0 अवशोषित सीवन के साथ अनुक्रम में पसलियों, मांसपेशियों, और त्वचा सिलाई। आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण इंजेक्शन बंद करें। हीटिंग पैड पर सर्जरी जानवरों रखें और बारीकी से उन्हें निरीक्षण करते हुए वे पूरी चेतना हासिल. फिर, जानवरों को एक साफ पिंजरे में रखें। जब तक वे पूरी तरह से बरामद कर रहे हैं अन्य जानवरों की कंपनी के लिए जानवरों को वापस मत करो।
- सर्जरी के बाद, चूहों को लगातार 3 दिनों के लिए हर 12 एच buprenorphine (0.1 mg/kg) के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें और उन्हें एक दिन के लिए हर 12 एच इबूप्रोफेन (5 मिलीग्राम/किग्रा) के साथ इंजेक्ट करें। निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर अनुवर्ती विश्लेषण अध्ययन करें।
नोट: analgesia के लिए अपने स्थानीय पशु देखभाल समिति के दिशा निर्देशों का पालन करें.
5. कैल्शियम क्षणिक और संकुचन रिकॉर्डिंग
- ऑटोक्लेव 15 मिमी-व्यास कवरलिप्स (सामग्री की तालिका 2) और एक छोटे गिलास बीकर में 121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 15 साई को कवर लिप्स और चितने को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकूल करें।
- छायक का उपयोग करके, कवरस्लिप को 12-वेल प्लेट में रखें और प्रत्येक कवरस्लिप पर अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स के 300 डिग्री एल में रखें।
नोट: मैट्रिक्स कोटिंग राशि को कम करने को रोकने के लिए मैट्रिक्स को कवरस्लिप के किनारे से अधिक न होने दें। 1 ज के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 12-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें। - शुद्ध HIPSC-CMs के साथ जिलेटिन लेपित 6-वेल प्लेट में माध्यम को प्रेरित करें, इसे पीबीएस के साथ 1x धो लें, और फिर इसे 1.5 मिनट के लिए सेल-डिसोएशन एंजाइमों के 0.5 एमएल के साथ पचाएं। 1 एमएल को निष्क्रिय करने के लिए 1 एमएल जोड़ें, पिपेट को 1 एमएल पिपेट के साथ 5x-10x से अधिक नहीं के लिए बार-बार। , और 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर मिश्रण centrifuge.
- कवरलिप्स से लेपित बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स को प्रेरित करें। कक्ष संख्या की गणना करें और 40,000/300$L की सांद्रता के लिए तटस्थ समाधान में कक्षों को पुन: निलंबित करें, और फिर प्रत्येक कवरस्लिप पर सेल निलंबन का 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कल्चर करें।
- 24 ज के बाद, धीरे से बेअसर समाधान aspirate, प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए आरबी + मध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, और 2 दिनों के लिए संस्कृति जारी है.
- वाई-27632 (10 डिग्री सेल्सियस), रो काइनेस एक्टिवेटर (आरए, 100 एनएम), वेरापैमिल (1 डिग्री सेल्सियस), या पीबीएस की एक समान मात्रा को HIPSC-Cm की संस्कृति माध्यम में जोड़ें, कैल्शियम क्षणिक और संकुचन का पता लगाने से पहले 12 एच।
नोट: 12 एच रासायनिक उपचार के बाद कोशिकाओं के कैल्शियम क्षणिक और संकुचन का पता लगाने के अलावा, इन मापदंडों का पता लगाने में भी रासायनिक वापसी के बाद 12, 24, 48, और 72 एच पर परीक्षण किया गया था। - प्लेट निकाल िये, मीडियम निकाल िये से निकाल लीजिये, और प्लेट को पीबीएस से धो लीजिये. एक फीनोल-लाल मुक्त DMEM के लिए माध्यम बदलें जिसमें 0.02% (w/v) सर्फैक्टेंट पॉलीओल (सामग्रीकी तालिका 1), 5 डिग्री सेल्सियस कैल्शियम सूचक ( सामग्री की तालिका1), और इसी Y-27632 (10M), आरए (100 एनएम), विरापाल (1 $M), या एक समान मात्रा पीबीएस की, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट।
- supernatant छोड़ें, डाई मुक्त DMEM माध्यम के साथ कोशिकाओं 3x धोने, और 30 मिनट के लिए मध्यम आराम करने के लिए मानचित्रण डाई de-esterify.
- एक खुले स्नान कक्ष में सेल-सीड कवरस्लिप रखें और कक्ष को एक माइक्रोइनक्यूबेशन सिस्टम में सम्मिलित करें जो एक स्वचालित तापमान नियंत्रक (सामग्री2 की तालिका)के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक बराबर है, इसे Tyrode के समाधान के साथ perfuse, और लगातार जोड़ें रो kinase अवरोध करनेवाला (आरआई), आरए, या perfusion समाधान करने के लिए पीबीएस.
- एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें (सामग्री की तालिका 2) और एक लेजर स्कैनिंग सिर ( सामग्री की तालिका2) एक एक्स-टी लाइन स्कैन को रोजगार द्वारा सहज कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्ड करने के लिए, डाई उत्तेजना के लिए एक 488 एनएम आर्गन लेजर का उपयोग कर और एक 515 - 10 एनएम बाधा फिल्टर उत्सर्जन प्रकाश इकट्ठा करने के लिए। confocal माइक्रोस्कोप के विभेदक हस्तक्षेप विपरीत कार्यक्षमता का उपयोग कर HIPSC-CMs के सहज संकुचन रिकॉर्ड (सामग्री की तालिका 2).
नोट: कैल्शियम क्षणिक रिकॉर्डिंग संसाधित और MATLAB R2016A सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया (सामग्री की तालिका 4). सेल संकुचन परिवर्तन परख ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया (सामग्री की तालिका 4).
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Representative Results
इस अध्ययन में प्रयुक्त HIPSC-CMs luciferase रिपोर्टर जीन के साथ मानव मूल से प्राप्त किए गए थे; अतः जीवाणो में प्रतिरोपित कोशिकाओं की जीवित रहने की दर बायोल्युमिनसेंस इमेजिंग (बीआईएल)17 (चित्र1क, बी) द्वारा पाई गई थी। हिस्टोलॉजिकल हृदय वर्गों के लिए, मानव-विशिष्ट कार्डियक ट्रोपोनिन टी (एचटीएनटी) और मानव परमाणु प्रतिजन (एचएनए) डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को एनग्रेप्ड हिपीएससी-सीएम (चित्र 1 सी) के रूप में वर्गीकृत किया गया था। दोनों परिणामों से संकेत मिलता है कि Y-27632 pretreatment काफी सेल engraftment दर में सुधार हुआ. हिपीएससी-सीएम+आरआई समूह की ल्यूसिफरेस गतिविधि प्रत्यारोपण के बाद दिन 3, 7 और 28 पर लगभग छह गुना बढ़ गई थी, जबकि HIPSC-CM-RI समूह (चित्र 1B) की तुलना में। इसके अलावा, एचसीपीएससी-सीएम+आरआई समूह में एचसीटीएनटी/एचएनए अभिव्यक्ति सात गुना के करीब बढ़ गई, इसके सापेक्ष HIPSC-CM-RI समूह (चित्र 1C)।
परिणाम भी संकेत दिया है कि Y-27632 pretreatment विनियमित cytoskeletal प्रतिरोपित कोशिकाओं में परिवर्तन. प्रत्यारोपण के 7 और 28 दिनों पर, HIPSC-CMs+ आरआई एक बड़ा और अधिक परिभाषित रॉड के आकार cytoskeletal संरचना का प्रदर्शन किया hiPSC-CMs-RI (चित्र 1D) की तुलना में.
इसके अलावा, Y-27632 pretreatment vivo में प्रत्यारोपित HIPSC-CM apoptosis को कम करने की क्षमता है. TUNEL धुंधला से पता चला है कि TUNEL-positive कोशिकाओं की संख्या काफी hiPSC-CM+RI समूह में उस के सापेक्ष में कमी आई थी HIPSC-CM-RI समूह में प्रतिरोपण के बाद 2 दिन (चित्र 1E) .
रॉक निषेध प्रत्यारोपित कोशिकाओं के आसंजन को बढ़ावा दिया और आगे प्रशासन स्थलों पर प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अवधारण को बढ़ाने की क्षमता थी. पश्चिमी धब्बा और हृदय ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग ने सुझाव दिया कि Y-27632 pretreatment reversibly integrin की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को बढ़ावा दिया $ 1 और एन-कैडेरिन और फॉस्फो-मायोसिन प्रकाश श्रृंखला 2 (पी-एमएलसी 2) की अभिव्यक्ति में कमी आई (चित्र2A,B ).
माउस सेल लाइन HL-1 इन विट्रो सेल अनुलग्नक प्रयोगों के लिए नियंत्रण मुख्य पुलिस के रूप में चुना गया था। परिणामों से संकेत मिलता है कि Y-27632 pretreatment काफी HL-1 के सापेक्ष HIPSC-CM पालन में वृद्धि हुई. इन निष्कर्षों की और पुष्टि करने के लिए, HIPSC-CMs+RI को N-cadherin या integrin के साथ इनक्यूबेट किया गया था , जिसके परिणामस्वरूप 1 h के लिए एंटीबॉडी को निष्क्रिय किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप पहले देखा गया उन्नत आसंजन का गायब हो गया था (चित्र 2C)।
HIPSC-CM-RI समूह के साथ तुलना में, hiPSC-CM+RI समूह में अनुबंध बल 32% से कम किया गया था, और hiPSC-CM+RA समूह में (HIPSC-CMs रॉक उत्प्रेरक, सामग्री की तालिका 1के साथ पूर्व व्यवहार), यह 42% की वृद्धि हुई थी ( चित्र 3A). इस बीच, HIPSC-CM-RI समूह के साथ तुलना में, पीक कैल्शियम क्षणिक फ्लोरोसेंट (पीक [F/F0) HIPSC-CM+ आरआई समूह के लिए 41% से कम किया गया था, और कैल्शियम क्षणिक अवधि (CATD50) 11% से कम किया गया था (चित्र3B , सी). इसके विपरीत, HIPSC-CM+RA समूह के लिए पीक $F/F0 48% की वृद्धि हुई थी, और CATD50 13% की वृद्धि हुई थी (चित्र3 B, C)।
इसके अलावा, प्रत्यारोपण से पहले 12 एच के लिए Y-27632 के साथ कार्डियोमायोसाइट्स का प्रीट्रीट काफी कम सीटीएनआई और सीटीएनटी (चित्रा 3 डी) की अभिव्यक्ति को कम कर देता है, दोनों ट्रोपोनिन (Tn) उपइकाइयां हैं जो कार्डियोमायोसाइट संकुचन को विनियमित करती हैं।
Y-27632 के समान, एक verapamil pretreatment (1 $M, 12 ज) काफी प्रेरित एमआई चूहों में hiPSC-Cm के engraftment दर में वृद्धि हुई. परिकल्पना की पुष्टि जैव-दीप्ति परख में एक बढ़ी हुई ल्यूसिफरेस सिग्नल के प्रेक्षण के माध्यम से की गई थी (चित्र 4क) और सेल प्रत्यारोपण के बाद 7 और 28 दिनों में एच सी टी/एचए डबल पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई (चित्र 4 बी)
चित्र 1: Y-27632 pretreatment MI चूहों दिल में HIPSC-सीएम के engraftment दर में वृद्धि हुई. (ए) बीआईएल माप का मानक वक्र। (B) पीबीएस, HIPSC-CMs-RI,या HIPSC-CMs+RI के साथ इलाज किया NOD/scid चूहों में Luciferin संकेत दिन 3, 7, और 28 सर्जरी के बाद. द प्रति समूह 6-9 चूहे। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम पीबीएस; ] पी एंड 0.05 बनाम HIPSC-CMs-RI| (सी) एच.सी.टी.टी. और एचएनए के लिए हृदय की धाराओं का प्रतिरक्षण। स्केल बार्स ] 100 डिग्री मी (10x छवियां); 20 डिग्री (40x छवियों). द प्रति समूह 5 चूहे। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-आरआई| (डी) हृदय वर्गों के प्रतिनिधि चित्र फलादीन और एच.सी.टी.टी. स्केल बार $ 20 [m. n ] 5 चूहे प्रति समूह। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-आरआई| (ई) TUNEL धुंधला के लिए दिल वर्गों के प्रतिनिधि छवियों. स्केल बार - 20 डिग्री उ. द - 4-6 चूहे प्रति समूह। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-आरआई| यह आंकड़ा झाओ एट अल18से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: Y-27632 आसंजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के द्वारा HIPSC-CMs के आसंजन बढ़ाया. (ए और बी) अतिप्रज्ञ-सीएम में आरआई के साथ और गैर व्यवहार वाले HIPSC-CMs में MLC2 (p-MLC2) के integrin की अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. (सी) एच सी टी एन टी इम्यूनोफ्लोरेसी -आरआई और +आरआई हिपीएससी-सीएम का विश्लेषण और एंटी-एन-कैड (एन-कैड) और एंटी-इंटेग्रिन (इंटेग) एंटीबॉडी के बिना। स्केल बार्स ] 100 डिग्री मी. *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम hiPSC-CMs-RI; ] पी एंड 0.05 बनाम HIPSC-CMs+ आरआई| यह आंकड़ा झाओ एट अल18से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: Y-27632 के साथ पूर्व उपचार ने HIPSC-CMs की संकुचनक्षमता को कम कर दिया और कार्डियक ट्रोपोनिन उपइकाइयों की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। (क) आरआई और आरए उपचार के संपर्क में आई पी एस सी-सीएम के छोटे होने के प्रतिशत का परिमाणीकरण। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-RI; ] पी एंड 0.05 बनाम HIPSC-CMs+ आरआई| (बी और सी) आरआई और आरए और एक गैर-उपचारित समूह के साथ उपचारित HIPSC-CMs के कैल्शियम क्षणिक माप के प्रतिनिधि चित्र और परिमाणीकरण। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-RI; ] पी एंड 0.05 बनाम HIPSC-CMs+ आरआई| (घ) आरआई और आरए और गैर-उपचारित समूह में उपचारित आईपीएससी-सीएम में कार्डियक ट्रोपोनिन उपइकाइयों (सीटीएनसी, सीटीएनटी और सीटीएनआई) की अभिव्यक्ति का पश्चिमी दाग विश्लेषण। यह आंकड़ा झाओ एट अल18से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: वेरापामिल प्रीट्रीट ने एमआई चूहों में HIPSC-CMs की engraftment दर में सुधार किया। (A ) पीबीएस, HIPSC-CMs-VER,या HIPSC-CMs+ VER के साथ इलाज किया NOD/scid चूहों में Luciferin संकेत दिन 3, 7, और 28 सर्जरी के बाद. द प्रति समूह 8 चूहे। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम पीबीएस; ] पी एंड 0.05 बनाम HIPSC-CMs-VER| (बी) एच.सी.टी.टी. और एचएनए के लिए हृदय की धाराओं का प्रतिरक्षण। 10x छवियों के लिए, स्केल बार $ 100 $m (10x छवियाँ); 20 डिग्री (40x छवियों). द प्रति समूह 5 चूहे। *पी एंड एलटी; 0.05 बनाम HIPSC-CMs-VER| यह आंकड़ा झाओ एट अल18से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस अध्ययन के प्रमुख कदमों में शुद्ध HIPSC-CMs प्राप्त करना, Y-27632 pretreatment के माध्यम से HIPSC-CMs की गतिविधि में सुधार, और अंत में, एक माउस एमआई मॉडल में HIPSC-सीएम की एक सटीक राशि प्रत्यारोपण शामिल हैं.
यहाँ संबोधित प्रमुख मुद्दों थे कि, पहले, हम ग्लूकोज मुक्त शुद्धि विधियों19 अनुकूलित और एक उपन्यास कुशल शुद्धि प्रणाली की स्थापना की. प्रणाली प्रक्रिया सेल वियोजन एंजाइमों लागू करने, जिलेटिन लेपित प्लेटों में कोशिकाओं replanting शामिल, replating के बाद 24 एच के लिए तटस्थीकरण माध्यम में कोशिकाओं culturing, और प्रत्यारोपण से पहले कोशिकाओं के पाचन समय को कम करने, सभी जिनमें से शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त करते समय कोशिकाओं की उच्चतम गतिविधि को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया।
दूसरा, हमने सेल इंजेक्शन से पहले 12 बजे Y-27632 के साथ HIPSC-CMs के pretreatment पर विस्तार से बताया। anoikis आमतौर पर कोशिकाओं के आसंजन प्रोटीन के संशोधन से प्रेरित है, जैसे कि integrins4,20 और एन-कैडेरिन21, जो apoptotic मार्ग के सक्रियण के लिए नेतृत्व. हमने दिखा दिया है कि Y-27632 pretreatment hiPSC-CMs के आसंजन को बढ़ावा देने के लिए कर सकता है प्रत्यारोपण साइट के लिए integrin की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के माध्यम से $ 1 और N-cadherin, पी-MLC2 की अभिव्यक्ति को दबाने, जो cytoskeletal में परिवर्तन से संबंधित है वास्तुकला22,23. HIPSC-CM प्रत्यारोपण के सात दिन बाद, HIPSC-CMs+RI एक अधिक सेल engraftment क्षेत्र में हुई, बेहतर परिभाषित रॉड आकार, और एक अधिक पूरा cytoskeletal संगठन hiPSC-CMs की तुलना में-RI (चित्र 1B-D).
तीसरा, हम माउस एमआई मॉडल में एक उपन्यास intracellular इंजेक्शन प्रणाली की स्थापना की, इंजेक्शन बिंदु प्रति 5 $L के साथ सही कोशिकाओं की आवश्यक संख्या इंजेक्ट करने के लिए, जबकि अत्यधिक इंजेक्शन की मात्रा के कारण माउस अस्तित्व की दर में कमी से बचने.
चौथा, हमने आरआई या आरए के साथ प्रीउपचार के बाद HIPSC-CMs में सेल संकुचन और कैल्शियम क्षणिक में परिवर्तन को निर्धारित करने के बारे में विस्तार से बताया। हमने पाया कि Y-27632 reversibly कोशिका संकुचन और कैल्शियम क्षणिका को कम कर सकते हैं. यहाँ परिकल्पना यह है कि प्रतिरोपित कोशिकाओं की कम ऊर्जा आवश्यकताओं के कारण, engraftment दर में वृद्धि हुई. इसी तरह के प्रभाव कैल्शियम चैनल अवरोधक verapamil का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. संविदा पर रोक लगाने के परिणामस्वरूप प्रस्तावित तंत्र यह है कि वाई-27632 हिपीएससी-सीएम में ट्रोपोनिन उप-इकाइयों सीटीएनटी और सीटीएनआई की अभिव्यक्ति को कम करता है।
मुख्य सीमा है कि Y-27632 केवल प्रत्यारोपण के दौरान एक क्षणिक भूमिका निभाई है. कैसे एक लंबी अवधि के लिए Rho kinase को बाधित करने के लिए, इस प्रकार आगे HIPSC-सीएम के प्रत्यारोपण दक्षता में सुधार, भविष्य में हल किया जा करने के लिए एक समस्या है। इस विधि के अधिक अनुप्रयोगों के लिए के रूप में, रॉक अवरोध करनेवाला न केवल प्रत्यारोपण के दौरान cardiomycytes की गतिविधि में सुधार कर सकते हैं, लेकिन यह भी अन्य कोशिकाओं की गतिविधि में वृद्धि; इसलिए, यह भी अन्य कोशिकाओं के प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं में pretreatment के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण हृदय रोग पर अधिक शोध के लिए एक अच्छा प्रयोगात्मक आधार देता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों कृपया उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Fluc-GFP निर्माण और डॉ Yanwen लियू प्रदान करने के लिए डॉ जोसेफ सी वू (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. इस अध्ययन के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों RO1 अनुदान HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (जे.जेड.) के लिए, और HL121206A1 (एल.जेड.), वैज्ञानिक अनुदान HL14267 (एक अमेरिकी अनुदान के लिए) द्वारा समर्थित है 16SDG30410018, और बर्मिंघम संकाय विकास अनुदान में अलबामा विश्वविद्यालय (W.$).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
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