Summary
I denne protokollen, viser vi og utdype hvordan du bruker humant indusert Pluripotent stamceller for cardiomyocyte differensiering og rensing, og videre, om hvordan å forbedre sin transplantasjon effektivitet med Rho-assosiert protein kinase inhibitor forbehandling i en mus hjerteinfarkt modell.
Abstract
En avgjørende faktor i å forbedre cellulær terapi effektivitet for hjerteinfarkt regenerering er å trygt og effektivt øke celle engraftment rate. Y-27632 er en svært potent hemmer av Rho-assosiert, spiral-spiral-inneholdende protein kinase (RhoA/ROCK) og brukes til å forebygge dissosiasjon celle apoptose (anoikis). Vi viser at Y-27632 forbehandling for humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs+ ri) før implantation resulterer i en celle engraftment rate forbedring i en musemodell av akutt hjerteinfarkt (mi). Her beskriver vi en komplett prosedyre av hiPSC-CMs differensiering, rensing, og celle forbehandling med Y-27632, samt den resulterende celle sammentrekning, kalsium forbigående målinger, og transplantasjon i mus MI modeller. Den foreslåtte metoden gir en enkel, sikker, effektiv og rimelig metode som i betydelig grad øker celle engraftment rate. Denne metoden kan ikke bare brukes sammen med andre metoder for å ytterligere forbedre celle transplantasjon effektivitet, men gir også et gunstig grunnlag for studiet av mekanismene for andre hjertesykdommer.
Introduction
Stilk cellen-basert terapeut ha vist betydelig muligheter som behandling for CARDIAC skade forårsaket av MI1. Bruken av differensiert hiPSCs gir en uuttømmelig kilde til hiPSC-CMs2 og åpner døren for den raske utviklingen av banebrytende behandlinger. Men mange begrensninger på terapeutisk oversettelse gjenstår, inkludert utfordringen med alvorlig lav engraftment rate av implantert celler.
Dissociating celler med Trypsin initierer anoikis3, som bare er akselerert når disse cellene injiseres i tøffe miljøer som iskemiske myokard, der hypoxic miljøet akselererer kursen mot celle død. Av de resterende cellene, er en stor andel vasket ut fra implantation området i blodet og spredt over hele periferien. En av de viktigste apoptotisk trasé er RhoA/ROCK Pathway4. Basert på tidligere forskning, RhoA/rock Pathway regulerer utgangen cytoskjelettkomponenter Organization5,6, som er ansvarlig for celle dysfunksjon7,8. The Rock inhibitor Y-27632 er mye brukt under somatiske og stilk cellen dissosiasjon og passaging, for å øke celle vedheft og redusere celle apoptose9,10,11. I denne studien, Y-27632 brukes til å behandle hiPSC-CMs før transplantasjon i et forsøk på å øke celle engraftment rate.
Flere metoder for å forbedre celle engraftment hastighet, slik som varme sjokk og kjeller membran matrise belegg12, er etablert. Bortsett fra disse metodene, kan genetisk teknologi også fremme cardiomyocyte spredning13 eller reversere nonmyocardial celler til cardiomyocytes14. Fra bioteknologi perspektiv, cardiomyocytes er sådd på en biomaterialet stillas for å forbedre transplantasjon effektivitet15. Dessverre, de fleste av disse metodene er kompliserte og kostbare. Tvert imot, metoden foreslås her er enkel, kostnadseffektiv og effektiv, og den kan brukes som en basal behandling før transplantasjon, så vel som i Bøyning med andre teknologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer i denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham og var basert på National Institutes of Health Laboratory Animal Care og bruk retningslinjer (NIH publikasjon no 85-23).
1. utarbeidelse av kultur Media og kultur plater
-
Middels forberedelse
- For hiPSC medium, bland 400 mL av humant pluripotent stilk cellen (hPSC) basal medium (tabell av materialer 1) og 100 ml av hPSC 5x supplement; og oppbevar blandingen ved 4 ° c.
- For RPMI 1640/B27 minus insulin (RB-) medium, bland 500 mL RPMI 1640 og 10 mL B27 supplement minus insulin.
- For RPMI 1640/B27-medium (RB +) blander du 500 mL RPMI 1640, 10 mL B27-supplement og 5 mL penicillin-Streptomycin (penn-strep) antibiotika.
- For rensing medium16, bland 500 ml av no-glukose RPMI 1640, 10 ml B27 supplement, 5 ml penn-strep antibiotika, og 1 000 ΜL natrium DL-melkesyre løsning (ved en endelig konsentrasjon på 4 mm).
- For å nøytralisere oppløsningen, bland 200 mL av RPMI 1640, 50 mL av fosterets storfe serum (FBS), 2,5 mL av strep antibiotika, og 50 μL av Y-27632 (ved en endelig konsentrasjon på 10 μM).
- For fryse medium, bland 9 mL FBS, 1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) og 10 μL av Y-27632 (ved en siste konsentrasjon på 10 μM).
- For ekstracellulære matrise løsning (EMS), tine konsentrert ekstracellulære matrise (tabell av materialer 1) ved 4 ° c til den har nådd en jevnt konsistent væske tilstand. Forkjøle pipette tips og rør før du gjør Matrix alikvoter av 350 μL hver på is, og lagre alikvoter ved-20 ° c. Før belegg platene, fortynne en tint alikvot i 24 mL iskald DMEM/F12 medium (EMS); holde EMS i 4 ° c i opptil 2 uker.
Merk: Utfør alle belegg trinn på isen for å hindre kjeller membran matrise herding. - For Tyrode løsning, ta 90% av den endelige nødvendig volum av vev kultur grade vann, tilsett riktig mengde av følgende reagenser, og rør til oppløst. Bruk deretter 1 N NaOH for å justere pH-verdien til 7,4. Tilsett ekstra vann til en endelig konsentrasjon av 140 mmol/L natriumklorid, 1 mmol/L magnesium klorid, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L kalium klorid, 10 mmol/L glukose og 1,8 mmol/L kalsiumklorid. Sterilisere ved filtrering, ved hjelp av en 0,22 μm membran.
-
Cellekultur plate belegg
- For hiPSC kultur plater, Påfør 1 mL EMS på hver brønn av en 6-brønn plate og ruge platen i minst 1 time ved 37 ° c. Aspirer DMEM/F12-løsning før seeding celler.
- For gelatin belegg, oppløse 0,2 g av gelatin pulver i vev kultur grade vann for å gjøre en 0,2% (w/v) løsning. Steriliseres ved autoklavering ved 121 ° c, 15 PSI i 30 min. Coat hver brønn av en 6-brønn plate med 2 mL oppløsning og ruge for 1 time ved 37 ° c. Før passaging cellene, aspirer løsningen og la platen tørke i minst 1 time ved romtemperatur inne i vevet kultur panseret.
2. hiPSC vedlikehold og Cardiomyocyte Ddifferentiation
- Kultur hiPSCs i hiPSC medium (se trinn 1.1.1) med en daglig medium endring til cellene nå 80%-90% samløpet per brønn.
Merk: For vedlikeholdsformål, hiPSCs er generelt klar for passasje hver 4 dager. - Til passasje hiPSCs, aspirer mediet og vask brønnen 1x med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Tilsett 0,5 mL av løsning av stilk celle avløsning (tabell av materialer 1) til hver brønn og ruge ved 37 ° c i 5 – 7 min.
Merk: Inkubasjonstiden avhenger av tettheten av cellene og frekvensen av dissosiasjon, som kan observeres under et mikroskop. - Nøytralisere den stilk cellen avløsning løsning med 1 mL av hiPSC medium supplert med 5 μM Y-27632. Samle blandingen i et 15 mL sentrifugerør. Sentrifuger røret i 5 min ved 200 x g, aspirer supernatanten uten å forstyrre celle pellet, og deretter resuspend cellene i 1 ml hiPSC medium som inneholder 5 μM Y-27632.
- Seed den hiPSCs på en ny EMS-belagt 6-brønn plate i et forhold mellom 1:6 til 1:18. Endre mediet til hiPSC medium uten Y27632 etter 24 timer.
- For å fryse cellene, resuspend dissosiert hiPSCs i fryse medium ved en konsentrasjon på 0,5 – 1 million/500 μL, plasser fjæringen i cryovials og oppbevar dem i en-80 ° c fryser. Overfør de frosne hetteglassene til flytende nitrogen etter 24 timer.
- For å differensiere, erstatte hiPSC medium med 2 mL RB-medium supplert med 10 μM GSK-3β inhibitor CHIR99021 (CHIR) ved 80%-90% celle-samløpet. Bytt medium med 3 mL RB-medium etter 24 h og ruge for ytterligere 48 h (dag 3).
- På dag 3, endre medium til 3 mL RB-medium med 10 μM wnt inhibitor IWR1 for 48 h (dag 5), og deretter erstatte mediet med 3 mL RB-medium og vedlikeholde for 48 h (dag 7).
- På dag 7, erstatte mediet med 3 mL RB medium og endre mediet hver 3 dager fremover. Spontan juling av hiPSC-CMs bør observeres mellom dager 7-10.
3. behandling av hiPSC-CMs og små molekyl forbehandling
Merk: Svært renset, rekombinant Cell-dissosiasjon enzymer (tabell av materialer 1) ble brukt til å distansere HiPSC-CMs.
- På dag 21 etter hiPSC-CM differensiering, aspirer mediet og vask cellene 1x med steril PBS. Ruge cellene med 0,5 mL av celle dissosiasjon enzymer per brønn i 5 – 7 min ved 37 ° c. Flere ganger pipette celle fjæringen ved hjelp av en 1 mL pipette for å distansere grundig cellene.
- Etter at cellene er dissosiert, tilsett 1 mL nøytralisere løsning på hver brønn, samle celle blandingen i en 15 mL sentrifugerør og sentrifuger på 200 x g i 3 min. forkaste supernatanten og resuspend cellene i nøytralisere løsning.
- Plante cellene på gelatin-belagt 6-brønn plater i en tetthet på 2 000 000 celler per brønn.
- Etter 24 – 48 timer, Erstatt kultur mediet med rensing medium for 3 – 5 dager.
Merk: Rensing er fullført når mer enn 90% av cellene i hvert mikroskop vise feltet er juling. For å hindre ytterligere skade på cardiomyocytes, ikke forlenge rensing varigheten utover 5 dager. Hvis den første runden ikke gir den nødvendige renhet, erstatte rensing medium med RB + medium for 1 dag, og deretter fullføre en ny runde med rensing. - Før transplantasjon, kultur cellene i behandlingsgruppen for 12 h i RB + medium supplert med 10 μM Y-27632. På samme måte kan du utføre verapamil behandling på cellene i RB +-mediet med 1 μM-verapamil for 12 timer (hiPSC-CMs+ ver).
- Etter behandling, vask hiPSC-CMs 1x med PBS og ruge cellene med 0,5 mL av celle-dissosiasjon enzymer per brønn for maksimalt 2 min. gjentatte ganger Pipetter cellen suspensjon, ved hjelp av en 1 mL pipette, å grundig distansere cellene. Nøytralisere cellene med nøytralisere løsning, samle celle blandingen i en 15 mL sentrifugerør, og sentrifuger ved 200 x g i 3 min. Resuspend CELLENE i PBS ved en konsentrasjon av 100 000 celler/5 μL i forberedelse til injeksjon.
4. hjerteinfarkt og celle transplantasjon
Merk: Alle kirurgiske instrumenter er presterilized med autoklav og vedlikeholdes i aseptisk tilstand under flere operasjoner via en varm perle steriliseringsapparat (tabell av materialer 2).
- Bedøve NOD/scid mus (tabell over materialer 2) med inhalert isoflurane (1,5% – 2%). Monitor anestesi nivåer av musene svar på en tå knipe. Plasser veterinær optisk salve på øynene for å hindre dem fra å tørke under operasjonen.
- Supply 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant for smertebehandling før kirurgi.
- Plasser og fest musen i en liggende posisjon på et oppvarmet operasjonsbord, Fjern håret fra den ventrale nakke regionen og venstre thorax ved hjelp av en riktige krem, utsett huden og desinfisere den med 70% alkohol.
- Skjær en 0,5 cm snitt i midten av nakken ved hjelp av kirurgiske saks, skille subkutant fett med steril tang, og utsett luftrøret. Introduser oralt intubering kanyle inn i luftrøret, koble kanyle til en liten dyre Ventilator og Juster ventilasjons innstillingene (Still inn tidevanns volumet med 100 – 150 μL og respirasjonsfrekvens med en 100-150x per min).
- Etter at musen stabiliserer, kutt en 0,5 cm snitt i midten av venstre bryst hud. Bruk tang å rett ut skille muskelen laget og gjøre et lite snitt i den femte interkostalrom plass til å avdekke brystet hulrom. Plasser retractor i snittet for å åpne bryst hulen og Finn den venstre synkende koronar arterie (LAD). Under et dissekere kirurgisk mikroskop ombinde du LAD med en 8-0 ikke Sutur.
- Umiddelbart etter MI induksjon, injisere 5 μL av hiPSC-CMs-ri, HiPSC-CMS+ ri, hiPSC-CMS-ver, hiPSC-CMS+ ver, eller et likt volum av PBS inn i musen er myokard på hvert sted (3 x 105 celler/dyr, 1 x 105 celler/område), en i infarkt området og to i områdene rundt infarkt.
Merk: Siden 5 μL er svært lite volum, er det ikke lett å nøyaktig kontrollere volumet ved direkte å suge den med en sprøyte. Lokket på en steril Petri rett kan snus over, og 5 μL av cellene kan først avsettes på lokket med en pipette. På grunn av overflatespenningen, vil den ikke spres, men vil kondensere i en liten flytende masse. Dette kan lett absorberes og injiseres inn i musen er myokard. - Eliminer gjenværende luft i bryst hulen ved å fylle den opp med varm, isoton saltløsning. Stitch ribbeina, musklene, og huden i rekkefølge med en 6-0 absorberbare Sutur. Slå av isoflurane anestesi injeksjon. Hold kirurgi dyrene på varmeputen og tett observere dem mens de gjenvinne full bevissthet. Så, sted dyrene inne en feilfri bur. Ikke Returner dyrene til selskap med andre dyr før de er fullstendig gjenopprettet.
- Etter kirurgi, injisere musene intraperitonealt med buprenorfin (0,1 mg/kg) hver 12 h i 3 påfølgende dager og injisere dem med ibuprofen (5 mg/kg) hver 12 h for en dag. Utføre påfølgende analyse studier på angitte tidspunkt poeng.
Merk: Følg din lokale Animal Care Committee retningslinjer for analgesi.
5. kalsium transient og contractility Recording
- Autoklav 15 mm-diameter coverslips (tabell med materialer 2) og pinsett i et lite glass beger ved 121 ° c, 15 PSI i 15 min. forkjøle coverslips og pinsett ved 4 ° c.
- Bruk pinsett til å plassere dekkglass i en 12-brønn plate og Pipetter 300 μL av ekstracellulære matrise på hver dekkglass.
Merk: Ikke la matrisen overstige kanten av dekkglass for å hindre redusert matrise belegg beløp. Ruge den 12-brønn plate i en 37 ° c cellekultur inkubator for 1 t. - Aspirer mediet i gelatin-belagt 6-brønn plate med renset hiPSC-CMs, vaske det 1x med PBS, og deretter fordøye det med 0,5 mL av celle-dissosiasjon enzymer for 1,5 min. Tilsett 1 mL nøytralisere oppløsning, Pipetter gjentatte ganger for ikke mer enn 5x – 10x med en 1 mL pipette , og sentrifuger blandingen ved 200 x g i 3 min.
- Aspirer den belagte ekstracellulære matrisen fra coverslips. Tell celle tallet og resuspend cellene i den nøytralisere oppløsningen til en konsentrasjon på 40000/300 μL, og legg deretter til 300 μL av celle fjæringen på hver dekkglass. Kultur platen i en 37 ° c inkubator.
- Etter 24 h, forsiktig aspirer nøytralisert oppløsning, tilsett 500 μL av RB + medium til hver brønn av platen, og fortsette til kultur for 2 dager.
- Legg til Y-27632 (10 μM), Rho kinase aktivator (RA, 100 nM), verapamil (1 μM) eller et likt volum av PBS i kultur mediet for hiPSC-CMs, 12 timer før kalsium transient og contractility deteksjon.
Merk: I tillegg til påvisning av cellenes kalsium transient og contractility etter 12 timer med kjemisk behandling, ble påvisning av disse parametrene også testet ved 12, 24, 48 og 72 h etter kjemisk tilbaketrekking. - Ta ut platen, kast mediet, og vask platen 1x med PBS. Endre mediet til en fenol-rød-fri DMEM som inneholder 0,02% (w/v) av overflateaktivt middel polyol (tabell med materialer 1), 5 μM kalsium indikator (tabell med materialer 1), og tilsvarende Y-27632 (10 μM), ra (100 nM), verapamil (1 μm), eller et lik volum av PBS, og ruge platen i 30 minutter ved 37 ° c.
- Kast supernatanten, vask cellene 3x med Dye-fri DMEM medium, og la mediet hvile i 30 min til de-forestre kartlegging fargestoff.
- Plasser cellen-seeded dekkglass i et åpent bad kammer og sette kammeret inn i et microincubation system equilibrated til 37 ° c med en automatisk temperatur Controller (tabell av materialer 2), perfuse det med Tyrode ' s løsning, og kontinuerlig legge Rho kinase inhibitor (RI), RA eller PBS til den andre løsningen.
- Bruk et invertert fluorescens mikroskop (tabell med materialer 2) og et laser skanne hode (tabell med materialer 2) for å registrere spontan kalsium transient ved å bruke en x-t linjeskanning, ved hjelp av en 488 NM Argon laser for dye eksitasjon og en 515 ± 10 NM barriere filter for å samle inn utslipps lys. Ta opp den spontane sammentrekning av hiPSC-CMs ved hjelp av differensial interferens kontrast funksjonaliteten til det konfokalmikroskopi mikroskopet (tabell av materialer 2).
Merk: Midlertidige kalsium-innspillinger ble behandlet og analysert ved hjelp av MATLAB R2016A-programvare (tabell med materialer 4). Endring av celle sammentrekning endre analysene ble utført ved hjelp av ImageJ programvare (tabell av materialer 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hiPSC-CMs som brukes i denne studien ble avledet fra menneskelig opprinnelse med luciferase reporter genet; Derfor ble overlevelsesraten for de transplanterte cellene i vivo oppdaget av bioluminesens avbildning (BLI)17 (figur 1a, B). For histologiske hjertet seksjoner, menneskelig-spesifikke CARDIAC Troponin T (hcTnT) og menneskelig kjernefysisk antigen (HNA) dobbelt-positive celler ble klassifisert som engrafted hiPSC-CMs (figur 1C). Begge resultatene indikerte at Y-27632 forbehandling signifikant forbedret celle engraftment rate. Den luciferase aktiviteten til hiPSC-CM+ ri -gruppen ble økt grovt seksling på dag 3, 7 og 28 etter transplantasjon, sammenlignet med HIPSC-cm-ri- gruppen (figur 1B). Videre økte hcTnT/HNA-uttrykket nær Sevenfold i hiPSC-CM+ ri -gruppen, i forhold til det i HIPSC-cm-ri- gruppen (figur 1C).
Resultatene indikerte også at Y-27632 forbehandling regulerte cytoskjelettkomponenter endringer i transplanterte celler. På dager 7 og 28 av transplantasjon, hiPSC-CMs+ ri utstilt en større og mer definert Rod-formet cytoskjelettkomponenter struktur i forhold til HiPSC-CMs-ri (figur 1d).
Videre har Y-27632 forbehandling potensial til å redusere transplantert hiPSC-CM apoptose in vivo. TUNEL farging viste at antallet TUNEL-positive celler ble signifikant redusert i hiPSC-CM+ ri -gruppen i forhold til det i HIPSC-cm-ri- gruppen på dag 2 etter transplantasjon (figur 1e).
ROCK hemming fremmet vedheft av transplanterte celler og hadde potensial til ytterligere å øke oppbevaring av implantert celler på administrasjon nettsteder. Western Blot og CARDIAC vev immunostaining antydet at Y-27632 forbehandling reverserbart fremmet økt uttrykk for integrin β1 og N-cadherin og redusert uttrykk for fosfat-myosin lys kjeden 2 (p-MLC2) (figur 2a, B ).
Musen cellelinjen HL-1 ble valgt som kontroll CMs for in vitro celle vedlegg eksperimenter. Resultatene indikerte at Y-27632 forbehandling signifikant økt hiPSC-CM tilslutning i forhold til HL-1. For ytterligere å bekrefte disse funnene, hiPSC-CMs+ ri ble inkubert med N-cadherin eller integrin β1 nøytralisere antistoff for 1 t, noe som resulterer i en forsvinnende av forbedret vedheft sett tidligere (figur 2C).
Sammenlignet med hiPSC-CM-ri- gruppen, ble kontraktile kraft i HIPSC-cm+ ri -gruppen redusert med 32%, og i HiPSC-cm+ ra -gruppen (HIPSC-CMs-forbehandlet med rock-aktivator, tabell over materialer 1), ble den økt med 42% ( Figur 3a). I mellomtiden, sammenlignet med hiPSC-CM-ri- gruppen, ble topp kalsium transient fluorescens (peak ΔF/F0) for HiPSC-cm+ ri -gruppen redusert med 41%, og kalsium transient varighet (CaTD50) ble redusert med 11% (figur 3b , C). I kontrast, peak ΔF/F0 for HIPSC-cm+ ra -gruppen ble økt med 48%, og CaTD50 ble økt med 13% (figur 3b, C).
I tillegg, en forbehandling av cardiomyocytes med Y-27632 for 12 timer før transplantasjon betydelig redusert uttrykket av cTnI og cTnT (figur 3D), som begge er Troponin (TN) under enheter som regulerer cardiomyocyte sammentrekning.
I likhet med Y-27632, en verapamil forbehandling (1 μM, 12 h) betydelig økt engraftment rate av hiPSC-CMs i indusert MI mus. Hypotesen ble bekreftet gjennom observasjon av et økt luciferase signal i bioluminesens analysen (figur 4a) og økt antall HCTNT/HNA dobbelt positive celler på dag 7 og 28 etter celle transplantasjon (figur 4b).
Figur 1: Y-27632 forbehandling økt engraftment rate på hiPSC-CMs i mi mus hjerter. (A) standard kurve av bli-målinger. (B) luciferin signal i Nod/scid mus behandlet med PBS, HiPSC-CMS-ri, eller HiPSC-CMS+ ri på dager 3, 7 og 28 etter operasjonen. n = 6-9 mus per gruppe. *P < 0,05 kontra PBS; † og P < 0,05 vs. HiPSC-CMs-ri. (C) Immunostaining av hjerte seksjoner for HCTNT og HNA. Skala bars = 100 μm (10x bilder); 20 μm (40x bilder). n = 5 mus per gruppe. *P < 0,05 kontra HiPSC-CMs-ri. (D) representative bilder av hjerte seksjoner beiset med Phalloidin og hcTnT. Scale bar = 20 μm. n = 5 mus per gruppe. *P < 0,05 kontra HiPSC-CMs-ri. (E) representative bilder av hjerte SEKSJONER for TUNEL farging. Scale bar = 20 μm. n = 4-6 mus per gruppe. *P < 0,05 kontra HiPSC-CMs-ri. Dette tallet er blitt modifisert fra Zhao et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Y-27632 forbedret vedheft av hiPSC-CMs ved å opprettholde uttrykk for vedheft proteiner. (A og B) Western Blot analyse av uttrykket av integrin ß1, N-cadherin, og fosforylering av MLC2 (p-MLC2) i hiPSC-CMS behandlet med ri og i nontreated hiPSC-CMS. N = 5 replikerer per gruppe. (C) hcTnT immunofluorescence farging analyse av-ri og + ri HiPSC-CMs med og uten en forbehandling av anti-N-Cadherin (N-CAD) og anti-integrin ß1 (integritet) antistoffer. Skala bars = 100 μm. *P < 0,05 vs. HiPSC-CMs-ri; † og P < 0,05 g. HiPSC-CMs+ ri. Dette tallet er blitt modifisert fra Zhao et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: forbehandling med Y-27632 reduserte contractility av hiPSC-CMs og ned-regulert uttrykk for CARDIAC Troponin under enheter. (A) kvantifisering av prosentandelen av forkortelse av HiPSC-CMs eksponert for ri og ra behandling. *P < 0,05 kontra HiPSC-CMs-ri; † og P < 0,05 g. HiPSC-CMs+ ri. (B og C) representative bilder og kvantifisering av kalsium transient måling av hiPSC-CMs behandlet med ri og ra og av en nontreated gruppe. *P < 0,05 kontra HiPSC-CMs-ri; † og P < 0,05 g. HiPSC-CMs+ ri. (D) Western Blot analyse av uttrykk for CARDIAC Troponin under enheter (CTnC, cTnT, og cTnI) i HiPSC-CMs behandlet med ri og ra og i en nontreated gruppe. Dette tallet er blitt modifisert fra Zhao et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Verapamil forbehandling forbedret engraftment rate på hiPSC-CMs i mi mus. (A) luciferin-signal i Nod/scid-mus behandlet med PBS, HiPSC-CMS-vereller HiPSC-CMS+ ver på dag 3, 7 og 28 etter operasjonen. n = 8 mus per gruppe. *P < 0,05 kontra PBS; † og P < 0,05 vs. HiPSC-CMs-ver. (B) Immunostaining av hjerte seksjoner for HCTNT og HNA. For 10x-bilder, skala bars = 100 μm (10x bilder); 20 μm (40x bilder). n = 5 mus per gruppe. *P < 0,05 vs. HiPSC-CMs-ver. Dette tallet er blitt modifisert fra Zhao et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste trinnene i denne studien er å skaffe ren hiPSC-CMs, forbedre aktiviteten til hiPSC-CMs gjennom Y-27632 forbehandling, og til slutt, transplantere en presis mengde hiPSC-CMs i en mus MI modell.
De viktigste spørsmålene som er omtalt her var at først, vi optimalisert glukose-fri rensing metoder19 og etablerte en roman effektiv rensing system. Systemet prosedyren inkluderte å bruke celle-dissosiasjon enzymer, nyplanting celler i gelatin-belagt plater, dyrking cellene i nøytralisering medium for 24 h etter replating, og minimere fordøyelsen tiden av cellene før transplantasjon, alle som ble utført for å oppnå den høyeste aktiviteten i cellene mens skaffe ren cardiomyocytes.
For det andre utarbeidet vi på forbehandling av hiPSC-CMs med Y-27632 ved 12 h før celle injeksjon. Anoikis er vanligvis indusert ved endring av cellenes vedheft proteiner, slik som integrins4,20 og N-cadherin21, som fører til aktivering av apoptotisk veien. Vi viste at Y-27632 forbehandling kunne fremme vedheft av hiPSC-CMs til transplantasjon området gjennom å opprettholde uttrykk for integrin β1 og N-cadherin, undertrykke uttrykk for p-MLC2, som er relatert til endringer i cytoskjelettkomponenter arkitektur22,23. Syv dager etter hiPSC-CM transplantasjon, hiPSC-CMs+ ri resulterte i en større celle engraftment området, finere definert stang former, og en mer komplett cytoskjelettkomponenter organisasjon sammenlignet med HiPSC-CMS-ri (figur 1B-D).
For det tredje etablerte vi en ny intracellulære injeksjonssystem i mus MI-modeller, med 5 μL per injeksjons punkt for å nøyaktig injisere det nødvendige antall celler, og samtidig unngå en reduksjon i musen overlevelse på grunn av overdreven injeksjon volum.
Fjerde, utarbeidet vi på hvordan å bestemme endringer i celle sammentrekning og kalsium transient i hiPSC-CMs etter forbehandling med RI eller RA. Vi fant at Y-27632 kan reverserbart redusere celle contractility og kalsium forbigående. Hypotesen her er at på grunn av lavere energibehov av de transplanterte cellene, engraftment rate økt. Lignende effekter kan oppnås ved hjelp av kalsium kanal inhibitor verapamil. Den foreslåtte mekanismen resulterer i contractility hemming er at Y-27632 reduserer uttrykk for Troponin under enheter cTnT og cTnI i hiPSC-CMs.
Den viktigste begrensningen er at Y-27632 bare spilte en forbigående rolle under transplantasjon. Hvordan hemme Rho kinase for en lengre periode, og dermed ytterligere forbedre transplantasjon effektiviteten av hiPSC-CMs, er et problem som skal løses i fremtiden. Som for flere anvendelser av denne metoden, kan ROCK inhibitor ikke bare forbedre aktiviteten av cardiomyocytes under transplantasjon, men også forsterke aktiviteten til andre celler; Derfor kan det også brukes under forbehandling i transplantasjon prosessene i andre celler. Videre tilnærmingen presenteres her legger en god eksperimentell fundament for mer forskning på hjertesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Joseph C. WU (Stanford University) for vennlig å gi svingninger-GFP konstruere og Dr. Yanwen Liu for utmerket teknisk assistanse. Denne studien er støttet av National Institutes of Health RO1 tilskudd HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (til J.Z.), og HL121206A1 (til L.Z.), og en R56 stipend HL142627 (til W.Z.), en amerikansk hjerteforeningen forsker Development Grant 16SDG30410018, og University of Alabama i Birmingham fakultet Development Grant (til W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
