Summary
In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.
Abstract
Een cruciale factor in het verbeteren van de effectiviteit van cellulaire therapie voor myocardiale regeneratie is het veilig en efficiënt verhogen van het engraftment percentage van de cel. Y-27632 is een zeer krachtige remmer van Rho-geassocieerde, coiled-Coil-bevattende proteïne kinase (RhoA/ROCK) en wordt gebruikt om dissociatie-geïnduceerde cel apoptosis (anoikis) te voorkomen. We tonen aan dat Y-27632 voor behandeling voor menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs+ RI) voorafgaand aan implantatie resulteert in een cel engraftment tarief verbetering in een muismodel van acuut myocardinfarct (MI). Hier beschrijven we een complete procedure van de hiPSC-CMs-differentiatie, zuivering en celvoorbehandeling met Y-27632, evenals de resulterende celcontractie, calcium Transient-metingen en transplantatie in muis MI-modellen. De voorgestelde methode biedt een eenvoudige, veilige, effectieve en goedkope methode die het percentage van de cel-engraftment aanzienlijk verhoogt. Deze methode kan niet alleen worden gebruikt in combinatie met andere methoden om de efficiëntie van de celtransplantatie verder te verbeteren, maar biedt ook een gunstige basis voor de studie van de mechanismen van andere hartziekten.
Introduction
Stamcel therapieën hebben een aanzienlijk potentieel aangetoond als een behandeling van hart schade veroorzaakt door MI1. Het gebruik van gedifferentieerde hiPSCs biedt een onuitputtelijke bron van hiPSC-CMs2 en opent de deur voor de snelle ontwikkeling van baanbrekende behandelingen. Er blijven echter veel beperkingen voor therapeutische vertalingen bestaan, waaronder de uitdaging van het ernstig lage engraftment percentage van geïmplanteerde cellen.
Dissocierende cellen met trypsine initieert anoikis3, die alleen wordt versneld als deze cellen worden geïnjecteerd in ruwe omgevingen zoals het ischemische myocardium, waarbij de hypoxische omgeving de koers versnelt naar celdood. Van de overgebleven cellen wordt een groot deel van de implantatieplaats in de bloedbaan weggespoeld en verspreid over de periferie. Een van de belangrijkste apoptotische trajecten is de RhoA/ROCK pathway4. Op basis van eerder onderzoek, de rhoa/Rock traject regelt de actine cytoskelet organisatie5,6, die verantwoordelijk is voor de cel dysfunctie7,8. De rotsremmer Y-27632 wordt veel gebruikt tijdens somatische en stamcel dissociatie en passaging, om de celhechting te verhogen en cel apoptosis9,10,11te verminderen. In deze studie wordt Y-27632 gebruikt voor de behandeling van hiPSC-CMs voorafgaand aan transplantatie in een poging om het celengraftment tarief te verhogen.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor het verbeteren van het engraftment percentage van de cel, zoals warmte schok en kelder membraan matrix coating12. Afgezien van deze methoden, genetische technologie kan ook bevorderen hartspier proliferatie13 of omgekeerde nonmyocardiale cellen in hartspier14. Vanuit het oogpunt van biotechniek worden cardiomyocyten geënt op een biomateriale steiger om de transplantatie-efficiëntie te verbeteren15. Helaas zijn de meeste van deze methoden ingewikkeld en kostbaar. Integendeel, de hier voorgestelde methode is eenvoudig, kostenefficiënt en effectief, en kan worden gebruikt als een basale behandeling voor transplantatie, evenals in conjugatie met andere technologieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier procedures in deze studie werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Universiteit van Alabama te Birmingham en waren gebaseerd op de nationale instituten voor gezondheids laboratoriumdieren verzorging en gebruiksrichtlijnen (NIH Publication No 85-23).
1. bereiding van cultuur media en cultuur platen
-
Middelgrote voorbereiding
- Voor hiPSC medium, meng 400 mL humaan pluripotente stamcel (hPSC) basale medium (tabel van materialen 1) en 100 ml hpsc 5x supplement; Bewaar het mengsel op 4 °C.
- Voor RPMI 1640/B27 minus insuline (RB-) medium, Meng 500 mL RPMI 1640 en 10 mL B27 supplement minus insuline.
- Meng voor RPMI 1640/B27 (RB +) medium 500 mL RPMI 1640, 10 mL B27 supplement en 5 mL penicilinestreptomycine (pen-STREP) antibioticum.
- Meng voor zuiverings medium16500 ml no-GLUCOSE rpmi 1640, 10 ml B27 supplement, 5 ml pen-STREP antibioticum en 1.000 ΜL natriumdl-lactaat oplossing (bij een eindconcentratie van 4 mm).
- Meng voor neutraliserende oplossing 200 mL RPMI 1640, 50 mL foetaal runderserum (FBS), 2,5 mL pen-STREP antibioticum en 50 μL Y-27632 (bij een uiteindelijke concentratie van 10 μM).
- Meng voor een Vries medium 9 mL FBS, 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) en 10 μL Y-27632 (bij een eindconcentratie van 10 μM).
- Voor extracellulaire matrix oplossing (EMS), ontdooien geconcentreerde extracellulaire matrix (tabel van materialen 1) bij 4 °c totdat het een gelijkmatig consistente vloeibare toestand heeft bereikt. Pipetpunten en-buizen vóór het maken van matrix aliquots van 350 μL op ijs, en bewaar de aliquots bij-20 °C. Verdun, alvorens de platen te coaten, één ontdooide ALIQUOT in 24 mL ijskoude DMEM/F12 medium (EMS); Houd het EMS gedurende maximaal 2 weken in 4 °C.
Opmerking: Voer alle coating stappen op ijs om te voorkomen dat kelder membraan matrix stollen. - Neem voor de oplossing van Tyrode 90% van het laatste vereiste volume weefselkweek water in, voeg de juiste hoeveelheid van de volgende reagentia toe en roer totdat het is opgelost. Gebruik vervolgens 1 N NaOH om de pH aan te passen naar 7,4. Voeg extra water toe aan een eindconcentratie van 140 mmol/L natriumchloride, 1 mmol/L magnesium chloride, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L kaliumchloride, 10 mmol/L glucose en 1,8 mmol/L calciumchloride. Steriliseren door filtratie, met behulp van een 0,22 μm membraan.
-
Celkweek plaat coating
- Voor hiPSC-kweek platen, breng 1 mL EMS aan op elk goed van een 6-put plaat en inincuberen de plaat gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C. Aspirate DMEM/F12 oplossing voor het zaaien van cellen.
- Los voor gelatine coating 0,2 g gelatine poeder op in weefselkweek water om een 0,2% (w/v) oplossing te maken. Steriliseren door autoclaven bij 121 °C, 15 psi voor 30 min. jas elk goed van een 6-goed bord met 2 mL van de oplossing en inbroed voor 1 uur bij 37 °C. Voor het doorgeven van de cellen, aspireren de oplossing en laat de plaat drogen voor ten minste 1 h op kamertemperatuur in de weefselcultuur kap.
2. hiPSC onderhoud en cardiomyocyte Ddifferentiatie
- Cultuur de hiPSCs in hiPSC medium (zie stap 1.1.1) met een dagelijkse verandering van het medium totdat de cellen 80% – 90% samenvloeiing bereiken per put.
Opmerking: Voor onderhoudsdoeleinden zijn hiPSCs over het algemeen klaar om elke 4 dagen te passeren. - Om hiPSCs te passeren, aspireren het medium en was de goed 1x met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 0,5 mL stamcel loslating oplossing (tabel van de materialen 1) toe aan elk goed en incuberen bij 37 °c gedurende 5 – 7 minuten.
Opmerking: De incubatietijd is afhankelijk van de dichtheid van de cellen en de snelheid van dissociatie, die onder een microscoop kan worden waargenomen. - Neutraliseer de stamcel loslating oplossing met 1 mL hiPSC medium aangevuld met 5 μM Y-27632. Verzamel het mengsel in een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g, zuig de supernatant op zonder de celpellet te verstoren en breng de cellen vervolgens opnieuw in 1 ml hipsc medium met 5 μM Y-27632.
- Zaai de hiPSCs op een nieuwe met EMS gecoate 6-well plaat met een verhouding tussen 1:6 en 1:18. Verander het medium naar hiPSC medium zonder Y27632 na 24 uur.
- Om de cellen te bevriezen, de gedissocieerde hiPSCs in Vries medium te hervatten met een concentratie van 0,5 – 1 miljoen/500 μL, de suspensie in cryoflesjes te plaatsen en ze op te slaan in een vriezer van 80 °C. Breng de bevroren flesjes over naar vloeibaar stikstof na 24 uur.
- Om onderscheid te maken, vervangt u het hiPSC medium door 2 mL RB-medium aangevuld met 10 μM GSK-3β inhibitor CHIR99021 (CHIR) bij 80% – 90% cel-samenvloeiing. Vervang het medium met 3 mL RB-medium na 24 uur en inincuberen voor een extra 48 h (dag 3).
- Op dag 3, verander het medium naar 3 mL RB-medium met 10 μM WNT inhibitor IWR1 voor 48 h (dag 5), en vervang vervolgens het medium met 3 mL RB-medium en onderhoud voor 48 h (dag 7).
- Op dag 7, vervang het medium met 3 mL RB medium en verander het medium om de 3 dagen vooruit. De spontane klop van hiPSC-CMs moet worden waargenomen tussen dagen 7 – 10.
3. hiPSC-CMs zuivering en kleine molecuul voorbehandeling
Opmerking: Zeer gezuiverde, recombinant-celdissociatie enzymen (tabel van materialen 1) werden gebruikt om Hipsc-CMs te ontkoppelen.
- Op dag 21 na de hiPSC-CM-differentiatie, aspireren van het medium en was de cellen 1x met steriele PBS. Incuberen de cellen met 0,5 mL celdissociatie enzymen per goed gedurende 5 – 7 minuten bij 37 °C. Pipetteer herhaaldelijk de celsuspensie met een pipet van 1 mL om de cellen grondig te ontkoppelen.
- Nadat de cellen zijn losgekoppeld, voeg 1 mL neutraliserende oplossing toe aan elk goed, verzamel het celmengsel in een centrifugebuis van 15 mL en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg en hervat de cellen in neutraliserende oplossing.
- Herplant de cellen op gelatine gecoate 6-well platen met een dichtheid van 2.000.000 cellen per put.
- Na 24 – 48 h, vervang het kweekmedium met zuiverings medium voor 3 – 5 dagen.
Opmerking: De zuivering is voltooid wanneer meer dan 90% van de cellen in elk Microscoop weergaveveld kloppen. Om verdere beschadiging van de cardiomyocyten te voorkomen, de zuiverings duur niet verlengen na 5 dagen. Als de eerste ronde niet de nodige zuiverheid oplevert, vervang dan het zuiverings medium met RB + medium gedurende 1 dag en voltooi vervolgens een tweede zuiverings ronde. - Vóór de transplantatie, cultuur de cellen in de behandelingsgroep voor 12 h in RB + medium aangevuld met 10 μM Y-27632. Voer op dezelfde manier verapamil-behandeling uit op de cellen in het RB + medium met 1 μM verapamil voor 12 uur (hiPSC-CMs+ ver).
- Was na de behandeling de hiPSC-CMs 1x met PBS en inbroed de cellen met 0,5 mL celdissociatie enzymen per put gedurende maximaal 2 min. Pipetteer herhaaldelijk de celsuspensie met behulp van een pipet van 1 mL om de cellen grondig te ontkoppelen. Neutraliseer de cellen met neutraliserende oplossing, Vang het celmengsel op in een centrifugebuis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g . rebreng de cellen in PBS in een concentratie van 100.000 cellen/5 μL in voorbereiding voor injectie.
4. myocardinfarct en celtransplantatie
Opmerking: Alle chirurgische instrumenten zijn voorgesteriliseerd met autoclaaf en worden in aseptische conditie gehouden tijdens meervoudige operaties via een hete kraal sterilisator (tabel van materialen 2).
- Anesthetize NOD/scid muizen (tabel van de materialen 2) met geïnhaleerde Isofluraan (1.5% – 2%). Bewaak de anesthesie niveaus door de reacties van de muizen op een teen knijpen. Plaats vet optische zalf op de ogen om te voorkomen dat ze drogen tijdens de operatie.
- Toevoer 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan voor pijnbestrijding voorafgaand aan de operatie.
- Plaats en bevestig de muis in een liggende positie op een verwarmde werktafel, verwijder het haar uit het ventrale nekgebied en de linker thorax met behulp van een onthardings crème, stel de huid bloot en Desinfecteer het met 70% alcohol.
- Snijd een incisie van 0,5 cm in het midden van de nek met behulp van een chirurgische schaar, scheid het onderhuidse vet met steriele Tang en stel de luchtpijp bloot. Introduceer de intubatiecanule oraal in de luchtpijp, sluit de canule aan op een kleine dieren ventilator en pas de ventilatie-instellingen aan (stel het getijden volume in op 100 – 150 μL en de ademhalingssnelheid bij 100x – 150x per minuut).
- Nadat de muis stabiliseert, snijd een 0,5 cm incisie in het midden van de linker borst huid. Gebruik de tang om de spierlaag onscherp te scheiden en maak een kleine incisie in de vijfde intercostale ruimte om de borstholte bloot te leggen. Plaats het oprolmechanisme in de incisie om de thoracische holte te openen en zoek de linker aflopende coronaire slagader (LAD). Onder een ontsnij ende chirurgische Microscoop, ligate de LAD met een 8-0 niet-absorbabel hecht.
- Injecteer onmiddellijk na MI-inductie 5 μL hiPSC-CMs-RI, Hipsc-CMS+ RI, hipsc-CMS-ver, hipsc-CMS+ verof een gelijk volume PBS in het myocardium van de muis op elke plaats (3 x 105 cellen/dier, 1 x 105 cellen/site), één in de infarct gebied en twee in de gebieden rond de infarct.
Opmerking: Aangezien 5 μL een zeer klein volume is, is het niet eenvoudig om het volume nauwkeurig te regelen door het rechtstreeks met een spuit te zuigen. De deksel van een steriele Petri schaal kan worden omgedraaid en 5 μL van de cellen kunnen eerst op het deksel met een pipet worden afgezet. Als gevolg van de oppervlaktespanning, het zal niet verspreiden, maar zal condenseren in een kleine vloeibare massa. Dit kan gemakkelijk worden geabsorbeerd en geïnjecteerd in het myocardium van de muis. - Elimineer de rest lucht in de thoracele holte door het op te vullen met een warme isotone zoutoplossing. Naai de ribben, spieren en huid op volgorde met een 6-0 absorbabel hechtdraad. Zet de Isofluraan anesthesie-injectie uit. Houd de chirurgische dieren op de verwarmingskussen en observeer ze nauwgezet terwijl ze het volledige bewustzijn weer terugkrijgen. Plaats de dieren dan in een schone kooi. Voer de dieren niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld.
- Na de operatie injecteert u de muizen intraperitoneaal met buprenorfine (0,1 mg/kg) elke 12 h gedurende 3 opeenvolgende dagen en injecteert u ze met ibuprofen (5 mg/kg) elke 12 h gedurende één dag. Voer daaropvolgende analysestudies uit op bepaalde tijdstippen.
Opmerking: Volg uw lokale Dierenzorg Commissie richtlijnen voor analgesie.
5. calcium Transient en Contractility opname
- Autoclaaf 15 mm-diameter afdek stroken (tabel van materialen 2) en pincet in een klein glazen bekerglas bij 121 °c, 15 psi gedurende 15 min. precool de dekbonnen en pincet bij 4 °c.
- Plaats de afdekplaat met behulp van de pincet in een 12-pits plaatje en Pipetteer 300 μL extracellulaire matrix op elke dekslip.
Opmerking: Laat de matrix niet de rand van de Afdeklijst overschrijden om te voorkomen dat de matrix coating wordt verminderd. Inculeer de 12-put plaat in een kweek Incubator van 37 °C voor 1 uur. - Aspirate het medium in de Gelatin-Coated 6-well plaat met gezuiverde hiPSC-CMs, was het 1x met PBS en verteren het vervolgens met 0,5 mL celdissociatie enzymen voor 1,5 min. Voeg 1 mL neutraliserende oplossing toe, Pipetteer herhaaldelijk voor niet meer dan 5x – 10x met een pipet van 1 mL en Centrifugeer het mengsel bij 200 x g gedurende 3 minuten.
- Zuig de gecoate extracellulaire matrix op uit de dekstroken. Tel het celnummer en hervat de cellen in de neutraliserende oplossing tot een concentratie van 40000/300 μL en voeg vervolgens 300 μL van de celsuspensie toe aan elke dekslip. Kweek de plaat in een incubator van 37 °C.
- Na 24 uur de geneutraliseerde oplossing zachtjes aanzuigen, 500 μL RB + medium aan elk goed van de plaat toevoegen en gedurende 2 dagen doorgaan met cultuur.
- Voeg Y-27632 (10 μM), Rho kinase Activator (RA, 100 nM), verapamil (1 μM) of een gelijk volume PBS toe aan het kweekmedium van hiPSC-CMs, 12 h voor de calcium transiënte en contractiliteits detectie.
Opmerking: Naast de opsporing van de cellen ' calcium voorbijgaande en contractiliteit na 12 h van chemische behandeling, de detectie van deze parameters werd ook getest op 12, 24, 48, en 72 h na chemische terugtrekking. - Verwijder de plaat, gooi het medium weg en was de plaat 1x met PBS. Verander het medium in een fenol-rood-vrije DMEM met 0,02% (g/v) oppervlakteactieve polyol (tabel van de materialen 1), 5 μM calcium indicator (tabel van de materialen 1), en de corresponderende Y-27632 (10 μm), RA (100 nm), verapamil (1 μm), of een gelijk volume van PBS, en incuberen de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Gooi het supernatant weg, was de cellen 3x met kleurstof vrij DMEM medium en laat het medium 30 minuten rusten om de mapping Dye te veresteren.
- Plaats de in de cel geplaatste afdekplaat in een open badkamer kamer en steek de kamer in een micro incubatie systeem dat is geëscaleerd tot 37 °C met een automatische temperatuurregelaar (tabel van materialen 2), parfumeer het met de oplossing van tyrode en voeg voortdurend Met een Rho kinase remmer (RI), RA of PBS naar de perfusie oplossing.
- Gebruik een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (tabel van materialen 2) en een laserscankop (tabel met materialen 2) om spontane calcium transiënt op te nemen door middel van een x-t lijnscan, met behulp van een 488 nm argon laser voor kleurstof excitatie en een 515 ± 10 nm barrière filter om emissie licht te verzamelen. Noteer de spontane contractie van hiPSC-CMs met behulp van de differentiële interferentie contrast functionaliteit van de confocale Microscoop (tabel van materialen 2).
Opmerking: Calcium Transient opnames werden verwerkt en geanalyseerd met behulp van MATLAB R2016A software (tabel van materialen 4). Celcontractie verandering assays werden uitgevoerd met behulp van ImageJ-software (tabel van materialen 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hipsc-CMs dat in deze studie wordt gebruikt, is afgeleid van menselijke oorsprong met plaats reporter gene; Daarom werd het overlevingspercentage van de getransplanteerde cellen in vivo gedetecteerd door bioluminescentie beeldvorming (BLI)17 (Figuur 1a, B). Voor histologische hart delen werden humaan-specifieke cardiale troponine T (hctnt) en humane nucleaire antigeen (HNA) dubbel positieve cellen geclassificeerd als geënt hipsc-CMs (figuur 1c). Beide resultaten gaven aan dat de voor behandeling met Y-27632 de cel-engraftment percentage aanzienlijk verbeterde. De plaats-activiteit van de groep hipsc-cm+ RI werd na de transplantatie ruwweg zesvoudig op de dagen 3, 7 en 28 verhoogd, vergeleken met die van de hipsc-cm-RI- groep (Figuur 1b). Bovendien steeg de hcTnT/HNA-uitdrukking dicht bij Sevenfold in de hiPSC-CM+ RI -groep, ten opzichte van die in de HIPSC-cm-RI- groep (figuur 1c).
De resultaten gaven ook aan dat de voor behandeling met Y-27632 gereguleerde cytoskelet veranderingen in getransplanteerde cellen. Op de dagen 7 en 28 van de transplantatie vertoonde hiPSC-CMs+ RI een grotere en meer gedefinieerde staafvormige cytoskelet structuur in vergelijking met Hipsc-CMS-RI (figuur 1d).
Bovendien heeft Y-27632 voor behandeling het potentieel om getransplanteerde hiPSC-CM apoptosis in vivo te verminderen. TUNEL kleuring toonde aan dat het aantal TUNEL-positieve cellen significant daalde in de hiPSC-CM+ RI groep ten opzichte van die in de HIPSC-cm-RI groep op dag 2 na transplantatie (Figuur 1e).
De remming van de rots bevorderde de hechting van getransplanteerde cellen en had het potentieel om de retentie van geïmplanteerde cellen op toedieningsplaatsen verder te verhogen. De immunokleuring van de Western Blot en het hartweefsel suggereerde dat Y-27632 voor behandeling reversibel de verhoogde expressie van integrine β1 en N-cadherin bevorderde en de expressie van fosho-myosine Light Chain 2 (p-MLC2) verminderde (Figuur 2a, B ).
De muis cellijn HL-1 werd geselecteerd als controle-CMs voor in vitro celgehechtheid experimenten. De resultaten gaven aan dat de voor behandeling met Y-27632 de hiPSC-CM-hechting ten opzichte van HL-1 significant verhoogde. Om deze bevindingen verder te bevestigen, werden hiPSC-CMs+ RI geïnincubeerd met N-cadherin of integrine β1 neutraliserend antilichaam voor 1 uur, wat resulteerde in een verdwijn van de verbeterde hechting die eerder werd gezien (figuur 2c).
In vergelijking met de hiPSC-CM-RI groep werd de contractiele kracht in de hipsc-cm+ RI groep verlaagd met 32%, en in de Hipsc-cm+ Ra groep (hipsc-CMs voorbehandeld met Rock activator, tabel van materialen 1), werd het verhoogd met 42% ( Figuur 3a). In vergelijking met de groep hiPSC-CM-RI werd de piek van calcium voorbijgaande fluorescentie (piek δf/F0) voor de groep hipsc-cm+ RI verlaagd met 41%, en de duur van het calcium tijdelijk (CaTD50) werd verlaagd met 11% (Figuur 3b , C). Piek ΔF/F0 voor de hipsc-cm+ Ra groep daarentegen steeg met 48%, en CaTD50 werd verhoogd met 13% (Figuur 3b, C).
Bovendien, een voor behandeling van de cardiomyocyten met Y-27632 voor 12 h voorafgaand aan de transplantatie aanzienlijk verminderd de uitdrukking van ctni en ctnt (figuur 3D), die beide troponine (TN) subeenheden die hartspier contractie reguleren.
Vergelijkbaar met Y-27632 verhoogde een verapamil voorbehandeling (1 μM, 12 h) de engraftment snelheid van hiPSC-CMs in geïnduceerde MI-muizen aanzienlijk. De hypothese werd bevestigd door de waarneming van een verhoogd plaats signaal in de Bioluminescentie test (figuur 4a) en verhoogde aantallen hctnt/HNA dubbel-positieve cellen op dag 7 en 28 na celtransplantatie (figuur 4b).
Figuur 1: Y-27632 voor behandeling verhoogde het engraftment tarief van hiPSC-CMs in mi muizen harten. A) standaard curve van bli-metingen. (B) luciferin-signaal in knik/scid-muizen behandeld met PBS, Hipsc-CMS-RIof hipsc-CMS+ RI op dag 3, 7 en 28 na de operatie. n = 6-9 muizen per groep. *P < 0,05 vs. PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI. C) immunokleuring van hart delen voor hctnt en HNA. Schaal staven = 100 μm (10x afbeeldingen); 20 μm (40x beelden). n = 5 muizen per groep. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI. D) representatieve beelden van hart delen die gekleurd zijn met phalloidine en hctnt. Schaalbalk = 20 μm. n = 5 muizen per groep. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI. E) representatieve afbeeldingen van hart delen voor de kleuring van Tunel. Schaalbalk = 20 μm. n = 4-6 muizen per groep. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Y-27632 versterkte de hechting van hiPSC-CMs door de expressie van adhesie eiwitten te behouden. A en B) analyse van de Western Blot van de expressie van integrine ß1, N-cadherin en FOSFORYLERING van MLC2 (p-MLC2) in hipsc-CMS behandeld met RI en in Nontreated hipsc-CMS. N = 5 replicaties per groep. C) hctnt immunofluorescentie kleurings analyse van-RI en + RI hipsc-CMs met en zonder een voor behandeling van anti-n-cadherin (N-CAD) en anti-integrine ß1 (integ) antilichamen. Schaal staven = 100 μm. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMs+ RI. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: voor behandeling met Y-27632 verminderde de contractiliteit van hiPSC-CMs en down-gereguleerd de uitdrukking van cardiale troponine subeenheden. A) kwantificering van het percentage van de verkorting van het hipsc-CMs dat is blootgesteld aan ri-en RA-behandeling. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMs+ RI. B en C) representatieve beelden en kwantificering van calcium transiënte metingen van hipsc-CMs behandeld met RI en RA en van een niet-ontrekte groep. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-RI; † P < 0,05 vs. hipsc-CMs+ RI. D) analyse van de Western Blot van de uitdrukking van cardiale troponine-subeenheden (ctnc, ctnt en ctni) in hipsc-CMs behandeld met RI en RA en in een niet-ontrekte groep. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: verapamil voor behandeling verbeterde het engraftment tarief van hiPSC-CMs in mi-muizen. A) luciferin-signaal in knik/scid-muizen behandeld met PBS, Hipsc-CMS-verof hipsc-CMS+ ver op dag 3, 7 en 28 na de operatie. n = 8 muizen per groep. *P < 0,05 vs. PBS; † P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-ver. B) immunokleuring van hart delen voor hctnt en HNA. Voor 10x afbeeldingen, schaal staven = 100 μm (10x afbeeldingen); 20 μm (40x beelden). n = 5 muizen per groep. *P < 0,05 vs. Hipsc-CMs-ver. Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen van deze studie zijn het verkrijgen van pure hiPSC-CMs, het verbeteren van de activiteit van hiPSC-CMs door middel van Y-27632 voor behandeling, en tot slot het verplanten van een precieze hoeveelheid hiPSC-CMs in een muis MI-model.
De belangrijkste kwesties die hier aan de orde waren, waren dat we eerst de glucose vrije zuiverings methoden19 hebben geoptimaliseerd en een nieuw efficiënt zuiveringssysteem hebben opgezet. De systeem procedure omvatte het toepassen van celdissociatie enzymen, het herplanten van cellen in gelatine gecoate platen, het kweken van de cellen in het neutralisatie medium voor 24 uur na het replating, en het minimaliseren van de verterings tijd van de cellen vóór de transplantatie, alle die werden uitgevoerd om de hoogste activiteit van de cellen te bereiken tijdens het verkrijgen van zuivere cardiomyocyten.
Ten tweede hebben we de voor behandeling van hiPSC-CMs met Y-27632 op 12 uur vóór de celinjectie uitgewerkt. De anoikis wordt meestal geïnduceerd door de aanpassing van de adhesie eiwitten van cellen, zoals integrinen4,20 en N-cadherin21, die leiden tot de activering van het apoptotische traject. We hebben aangetoond dat Y-27632 voor behandeling de hechting van hiPSC-CMs aan de transplantatie site zou kunnen bevorderen door het behoud van de expressie van integrine β1 en N-cadherin, het onderdrukken van de expressie van p-MLC2, wat verband houdt met veranderingen in het cytoskelet architectuur22,23. Zeven dagen na de hiPSC-CM-transplantatie resulteerde hiPSC-CMs+ RI in een groter celengraftment gebied, fijnere gedefinieerde staaf vormen en een vollediger cytoskelet organisatie in vergelijking met Hipsc-CMS-RI (Figuur 1b-D).
Ten derde hebben we een nieuw intracellulair injectiesysteem in muizen MI-modellen opgericht, met 5 μL per injectie punt om het vereiste aantal cellen nauwkeurig te injecteren, terwijl een afname van de overlevings snelheid van de muis als gevolg van overmatig injectievolume wordt vermeden.
Ten vierde hebben we uitgewerkt hoe we de veranderingen in celcontractie en calcium Transient in hiPSC-CMs kunnen bepalen na voor behandeling met RI of RA. We constateerden dat Y-27632 de cel contractiliteit en calcium Transient omkeerbaar kan verminderen. De hypothese is dat als gevolg van de lagere energiebehoefte van de getransplanteerde cellen, het engraftment percentage is toegenomen. Vergelijkbare effecten kunnen worden bereikt met behulp van de calcium kanaal remmer verapamil. Het voorgestelde mechanisme dat resulteert in de contractiliteit-remming is dat Y-27632 de expressie van troponine-subeenheden ctnt en ctni in hipsc-CMs vermindert.
De belangrijkste beperking is dat Y-27632 slechts een voorbijgaande rol speelde tijdens de transplantatie. Hoe u Rho kinase voor een langere periode remt, waardoor de transplantatie-efficiëntie van hiPSC-CMs verder wordt verbeterd, is een probleem dat in de toekomst moet worden opgelost. Zoals voor meer toepassingen van deze methode, Rock remmer kan niet alleen het verbeteren van de activiteit van hartspier tijdens de transplantatie, maar ook de activiteit van andere cellen te verbeteren; Daarom kan het ook worden gebruikt tijdens de voor behandeling in de transplantatie processen van andere cellen. Bovendien legt de hier gepresenteerde aanpak een goede experimentele basis voor meer onderzoek naar hart-en vaatziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) voor de vriendelijke levering van de Fluc-GFP Construct en Dr. Yanwen Liu voor uitstekende technische assistentie. Deze studie wordt gesteund door de National Institutes of Health RO1 Grants HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (to J.Z.), en HL121206A1 (to L.Z.), en een R56 Grant HL142627 (to W.Z.), een Amerikaanse hart associatie wetenschapper ontwikkelings subsidie 16SDG30410018, en de Universiteit van Alabama in Birmingham Faculty ontwikkelings subsidie (naar W.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| ImageJ | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
