המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר
Summary
מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.
Abstract
ביוילאמים הם אגרגטים של חיידקים מוטבע בתוך מטריצה המיוצר בתבנית spatially-בדוגמת. חיידקים בתוך ביוilm לפתח עמידות לאנטיביוטיקה משופרת, אשר מהווה סכנות בריאותיות פוטנציאליות, אבל יכול גם להועיל ליישומים סביבתיים כגון טיהור של מי שתייה. ההתפתחות הנוספת של הtherapeutics אנטי בקטריאלי ויישומים השראה ביוilm ידרוש התפתחות של שיטות הנדסה, מהנדסים ליצירת ביוגרפיות. לאחרונה, התפתחה שיטה מקורית של הכנת ביוilm באמצעות מדפסת תלת-ממדית ששונתה (3D) עם דיו חיידקי. מאמר זה מתאר את השלבים הנחוצים לבניית הביוקטר היעיל והחסכוני הזה המציע מספר יישומים בעיבוד חומרים המושרה על ידי bacterially. הפרוטוקול מתחיל עם מדפסת תלת-ממד מותאם מותאמת מסחרית שבה החליף את הבלטת ממד עם מתקן ביו דיו המחובר למערכת משאבת מזרק המאפשרת זרימה מתמשכת ורציפה של ביו-דיו. לפיתוח ביו-דיו המתאים להדפסת ביוilm, בקטריה מהונדסים של חיידק האנציכיה הושעו בתמיסה של alginate, כך שהם לגבש במגע עם משטח המכיל סידן. הכללת כימיה מודפסת בתוך מצע ההדפסה כוננים ביטוי של חלבונים ביוilm בתוך הביו-דיו המודפס. שיטה זו מאפשרת הדפסה תלת ממדית של תבניות מרחבית שונות המורכבות משכבות בדידים של ביואמים מודפסים. כגון מערכות מבוקרת מסוג זה יכול לשמש כמערכות מודל והוא יכול למצוא יישומים בתחומים מרובים שיש להם השפעה רחבה על החברה, כולל מניעת עמידות לאנטיביוטיקה או שתיית מים לטיהור, בין היתר.
Introduction
כיום קיים צורך הולך וגובר לפיתוח פתרונות ידידותיים לסביבה, לייצור חומרים בדוגמת spatially, בשל הרחבת מספר השווקים לחומרים מסוג1. מאמר זה מציג באופן פשוט, שיטה חסכונית לייצור חומרים כאלה ולכן מציע ספקטרום גדול של יישומים עתידיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת תלת מימדי (3D) הדפסה של מבנים בדוגמת spatially באמצעות הביו-דיו המכיל חיידקים חיים. החיידק נשאר בר קיימא בתוך המבנים המודפסים במשך שבוע, ומאפשר לחיידק לבצע פעילויות מטבוליות טבעיות או מהונדסים. חיידקים מודפסים יכולים ובכך לייצר ולהפקיד את הרכיבים הרצויים בתוך המבנה המודפס, לדוגמה יצירת ביוilm מקושרות פונקציונלי2.
שיטות מסורתיות לייצור חומרים מתקדמים כוללות הוצאות אנרגיה גבוהה (למשל, טמפרטורות גבוהות ו/או לחצים) והוא יכול לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית, לעתים קרובות חומרים רעילים הדורשים הוצאות מקיפות3 ,4. לעומת זאת, מינים חיידקיים רבים מסוגלים לייצר חומרים שניתן ליישום בקלות בתעשיות שונות. חומרים אלה כוללים פולימרים כגון פוליהידרוקסילאנוטים (PHA)5 או פולי (גליקולדה-co-lactide)6, בקטריות תאית7, חומרי בטון חיידקיים8, מרוכבים ביוציתים9, דבקים מבוססי עמילואיד10, או מתגי חשמל ביו מבוססי11, בין היתר. יתר על כן, ייצור חיידקי של חומרים יקרי ערך מתרחש בדרך כלל בטמפרטורות הסביבה הקרובה ולחצים ובסביבות מימית, ללא צורך או לייצר תרכובות רעילות. בזמן הפקת חומרים עם חיידקים כבר הפגינו בספרות וכמה יישומים תעשייתיים כבר התפתחה12,13, שיטה אמינה עבור הקפדה מרחבית של חומרים כאלה נשאר אתגר.
מאמר זה מדגים שיטה הישר קדימה להמרת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת בקטריאלי תלת-ממדית. הפרוטוקול מראה כיצד להכין את הביו-דיו המכיל ולקיים את החיידק החי, כמו גם כיצד להכין מצעים שעליהם ניתן לבצע את ההדפסה התלת-ממדית. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון זנים חיידקיים טבעיים ומהונדסים מסוגל לייצר חומרים. חיידקים אלה יכולים להיות מופץ מרחב בתוך מבנה מודפס 3d ועדיין להמשיך את פעילות חילוף החומרים שלהם, אשר תגרום התפלגות מרחבית של החומרים הרצוי המיוצר על ידי החיידק.
שיטת הדפסה זו מאפשרת ליצור מוספים של ביואמים, אגרגטים של חיידקים המוקפים במטריצה בעלת הפקה עצמית. ביואמים הם רשתות תלת-ממד הטרוגנית שבהן חלבונים, פולימרים, תאי בקטריאלי, חמצן וחומרים מזינים כולם מובנים ביותר14. בעוד בצורת ביוilm, החיידק מפגין עמידות לאנטיביוטיקה מוגברת וחוסן מבניים, מה שמקשה למגר ממשטחים כולל קטטרים ושתלים רפואיים. המפתח למאפייני ביוilm, וגם האתגר הגדול ביותר לחקר ביוilm, נראה כטרוגניות של ביוילאמים15,16,17. ייצור ביואילאמים של מודל מבוקר בשליטה מיוחדת הוא עניין מיוחד כפי שאפשר להתרבות או לכוונן את הדפוסים המרחביים של רכיבי הבייוilm, ולסייע להבנת התצהיר היציב של הביואמים כמעט בכל משטח ב טבע.
מאמר זה מציג שיטה לייצור ביויואמים באמצעות הידרו-מודפסים תלת-ממדיים המכילים חיידקים מהונדסים של E. coli המייצרים חלבונים של ביוilm בנוכחות סליל, כמו גם שיטות אימות של היווצרות ביוilm2 . מרכיבי מטריקס העיקריים של מטריצות של ביואמים אלה הם סיבי עמילואיד בסיבים18 המכילים חלבונים csga עצמית התאספו. כאשר מתוכננים חיידקים E. coli המושרה כדי לבטא חלבונים csga, הם יוצרים מודל יציב ביוilm המגן על התאים מפני שטף של משטח ההדפסה. כגון מודפס 3D המבנה יכול להיות נשלט על ידי שליטה והוא יכול לשמש כלי מחקר שימושי לחקירת מכניקה מבנה בקנה מידה רב של מבנים התפקוד או החומריות19. ביואמים אלה יסייעו להבנת עקרונות היווצרות הביוונים ותכונותיו המכאניות, המאפשרות מחקר נוסף למנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה בין יישומים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן עבור הדפסה תלת-ממדית של ביואיאמים מהונדסים מכיל שני שלבים קריטיים. ראשית הוא הכנת משטח ההדפסה אגר, שהוא הגורם הקריטי ביותר להפקת רזולוציית הדפסה ספציפית. חשוב לוודא שמשטח ההדפסה שטוח ושתיאור הפיפטה בראש ההדפסה ממוקם בגובה הנכון מהמשטח. אם המשטח אינו שטוח, מרחק העבודה י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק AOARD (לא. FA2386-18-1-4059), הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/OCW) במסגרת הגבולות של תוכנית ננו מדעים, ואת החומרים המתקדמים NWO-NSFC תוכנית (No. 729.001.016). המחברים מכירים בסיוע מעבדה של רמון ואן דר ואלק ורולנד קיפר.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
