Summary

Dreidimensionales Pattern von Ingenieurbiofilmen mit einem Do-it-yourself-Bioprinter

Published: May 16, 2019
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Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen bakteriellen 3D-Drucker zu verwandeln, der das Drucken von gemusterten Biofilmen erleichtern kann. Es werden alle notwendigen Aspekte der Zubereitung von Bioprinter und Bio-Tinte beschrieben, sowie Verifizierungsmethoden zur Beurteilung der Biofilme.

Abstract

Biofilme sind Aggregate von Bakterien, die in eine selbst produzierte, räumlich gemusterte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Bakterien innerhalb eines Biofilms entwickeln eine verbesserte Antibiotikaresistenz, die potenzielle gesundheitliche Gefahren birgt, aber auch für Umweltanwendungen wie die Reinigung von Trinkwasser von Vorteil sein kann. Die Weiterentwicklung von antibakteriellen Therapeutika und biofilm-inspirierten Anwendungen erfordert die Entwicklung reproduzierbarer, technischer Methoden zur Biofilmbildung. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Methode zur Biofilm-Aufbereitung mit einem modifizierten dreidimensionalen (3D) Drucker mit einer bakteriellen Tinte entwickelt. Dieser Artikel beschreibt die Schritte, die notwendig sind, um diesen effizienten, kostengünstigen 3D-Bioprinter zu bauen, der mehrere Anwendungen in der bakterieninduzierten Materialverarbeitung bietet. Das Protokoll beginnt mit einem angepassten kommerziellen 3D-Drucker, bei dem der Extruder durch einen Bio-Tinte-Spender ersetzt wurde, der an ein Spritzenpumpensystem angeschlossen ist und einen kontrollierbaren, kontinuierlichen Fluss von Bio-Tinte ermöglicht. Um eine für den Biofilmdruck geeignete Bio-Tinte zu entwickeln, wurden in einer Lösung aus Alginat konstruierte Escherichia coli-Bakterien aufgehängt, so dass sie sich in Kontakt mit einer kalziumhaltigen Oberfläche verfestigen. Die Aufnahme einer Induktionschemie in das Drucksubstrat treibt die Ausprägung von Biofilm-Proteinen in die gedruckte Bio-Tinte. Diese Methode ermöglicht den 3D-Druck verschiedener räumlicher Muster, die aus diskreten Schichten von gedruckten Biofilmen bestehen. Solche räumlich gesteuerten Biofilme können als Modellsysteme dienen und Anwendungen in mehreren Bereichen finden, die weitreichende Auswirkungen auf die Gesellschaft haben, unter anderem auf die Antibiotikaresistenz oder die Trinkwasserreinigung.

Introduction

Aufgrund der wachsenden Zahl von Märkten für solche Materialien wird derzeit zunehmend umweltfreundliche und nachhaltige Lösungen für die Herstellung von räumlich gemusterten Materialienentwickelt. Dieser Artikel stellt eine einfache, kostengünstige Methode zur Herstellung solcher Materialien vor und bietet somit ein breites Spektrum an zukünftigen Anwendungen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht das dreidimensionale (3D) Drucken von räumlich gemusterten Strukturen mit einer Bio-Tinte, die lebende Bakterien enthält. Bakterien bleiben innerhalb der gedruckten Strukturen über eine Woche lebensfähig, so dass die Bakterien natürliche oder technische Stoffwechselaktivitäten ausführen können. Druckbakterien können so gewünschte Bauteile innerhalb der gedruckten Struktur herstellen und ablagern, zum Beispiel einen funktionellen, vernetzten Biofilm2.

Traditionelle Methoden zur Herstellung von fortschrittlichen Materialien sind mit hohen Energiekosten (z.B. hohe Temperaturen und/oder Drücke) verbunden und können große Mengen an chemischen Abfällen produzieren, oft giftige Stoffe, die eine kostenintensive Nutzung erfordern 3 ,4. Im Gegensatz dazu sind mehrere Bakterienarten in der Lage, Materialien herzustellen, die in verschiedenen Branchen leicht einsetzbar sind. Zu diesen Materialien gehören Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) 5 oder Poly (Glycolide-Co-lactide) (PGLA)6, bakterielle Zellulose7, bakterielle Betonmaterialien8, biomimetische Verbundstoffe9, Amyloid-basierte Klebstoffe10, oder biobasierte elektrische Schalter11, unter anderem. Darüber hinaus erfolgt die bakterielle Produktion wertvoller Materialien in der Regel bei nahezu Umgebungstemperaturen und Drücken und in wässrigen Umgebungen, ohne dass toxische Verbindungen benötigt oder produziert werden. Während die Herstellung von Materialien mit Bakterien in der Literatur nachgewiesen wurde und einige industrielle Anwendungen bereits12,13entstanden sind, bleibt eine zuverlässige Methode zur räumlichen Musternährung solcher Materialien eine Herausforderung.

Dieser Artikel zeigt eine geradlinige Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen 3D-Bakteriater-Drucker umzuwandeln. Das Protokoll zeigt, wie eine Bio-Tinte, die die lebenden Bakterien enthält und erhält, hergestellt werden kann, sowie wie Substrate hergestellt werden können, auf die der 3D-Druck durchgeführt werden kann. Diese Methode ist geeignet, um mit einer Vielzahl von natürlichen und technischen Bakterienstämmen in der Lage, Materialien zu produzieren. Diese Bakterien können räumlich in einer 3D-gedruckten Struktur verteilt werden und setzen ihre Stoffwechselaktivität fort, was zu einer räumlichen Verteilung der gewünschten Materialien der Bakterien führt.

Diese Druckmethode ermöglicht die additive Herstellung von Biofilmen, Aggregaten von Bakterien, die von einer selbst produzierten extrazellulären Matrix umgeben sind. Biofilme sind heterogene 3D-Netzwerke, in denen Proteine, Polymere, Bakterienzellen, Sauerstoff und Nährstoffe alle räumlich strukturiertsind. Während Bakterien in Form eines Biofilms eine erhöhte Antibiotikaresistenz und strukturelle Robustheit aufweisen, was es schwierig macht, sie von Oberflächen wie medizinischen Kathetern und Implantaten auszulöschen. Der Schlüssel zu Biofilm-Eigenschaften und auch die größte Herausforderung für die Biofilm-Forschung scheint die Heterogenität von Biofilmen15,16,17zu sein. Die Herstellung von räumlich gesteuerten Modellbiofilmen ist von besonderem Interesse, da sie es ermöglichen würde, die räumlichen Muster von Biofilm-Komponenten zu reproduzieren oder zu stimmen, was das Verständnis für die stabile Ablagerung von Biofilmen auf nahezu jeder Oberfläche in der natur.

Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Herstellung von Biofilmen vor, bei denen 3D-gedruckte Hydrogele mit technischen E . coli-Bakterien , die Biofilm-Proteine in Anwesenheit eines Indukters produzieren, sowie Methoden zur Überprüfung der Biofilmbildung verwendet werden. . Die wichtigsten extrazellulären Matrixkomponenten dieser Biofilme sind curli Amyloid-Fasern 18, die selbst zusammengesetzte CsgA-Proteine enthalten. Wenn die E . coli-Bakterien zum Ausdruck von CsgA-Proteinen verleitet werden, bilden sie einen stabilen Modellbiofilm, der die Zellen vor dem Abwaschen der Druckfläche schützt. Ein solcher 3D-gedruckter Biofilm kann räumlich gesteuert werden und als nützliches Forschungsinstrument zur Untersuchung von mehrstufigen Biofilm-Strukturfunktionsmechanik oder Materiomik19dienen. Diese maßgeschneiderten Biofilme werden das Verständnis der Prinzipien der Biofilmbildung und ihrer mechanischen Eigenschaften fördern und unter anderem die Mechanismen der Antibiotikaresistenz weiter erforschen.

Protocol

1. Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen 3D-Bioprinter Entfernen Sie den Extruder und die Heizung eines kommerziellen 3D-Druckers (Materialtabelle) aus dem Druckerrahmen und ziehen Sie die Verkabelung, die diese Elemente aus der Hauptleiterplatte (Abbildung 1A) steuert. Da der Sensor, der die Betriebstemperatur des Druckers steuert, funktionell sein muss, um mit der Druckersoftware zu kommunizieren, entfernen Sie aus der Drucksoftware den Algorithmus,…

Representative Results

Der erste Schritt für den erfolgreichen 3D-Druck von Biofilmen ist die Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen Bioprinter. Diese Umstellung erfolgt durch das Entfernen des Extruders und der Heizung des Druckers, der für den Druck mit einer polymeren Tinte ausgelegt ist, und durch Komponenten, die für den Druck von Biofarb-Tinte mit lebenden Bakterien geeignet sind (Abbildung 1A). Der Extruder wird durch eine Pipette-Spitze (oder Spitzen, wenn m…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll für den 3D-Druck von technischen Biofilmen hat zwei kritische Schritte. Der erste ist die Vorbereitung der Agar-Druckfläche, die der kritischste Faktor für die Erzeugung einer bestimmten Druckauflösung ist. Wichtig ist, dass die Druckfläche flach ist und die Pipette-Spitze auf dem Druckkopf in der richtigen Höhe von der Oberfläche aus positioniert wird. Ist die Oberfläche nicht flach, ändert sich der Arbeitsabstand während des Druckprozesses. Wenn der Arbeitsabstand weniger als 0…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen AOARD-Zuschuss (Nr. FA2386-1-1-4059), die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/OCW) im Rahmen des Programms “Frontiers of Nanoscience” und das Advanced Materials NWO-NSFC Programm (Nr. 729.001.016). Die Autoren bestätigen die Laborhilfe von Ramon van der Valk und Roland Kieffer.

Materials

3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

References

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Spiesz, E. M., Yu, K., Lehner, B. A., Schmieden, D. T., Aubin-Tam, M., Meyer, A. S. Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (147), e59477, doi:10.3791/59477 (2019).

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