Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te
Summary
In questo articolo viene descritto un metodo per trasformare una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante 3D batterica che può facilitare la stampa di biofilm a motivi geometrici. Sono descritti tutti gli aspetti necessari della preparazione del biostampa e del bio-Ink, nonché i metodi di verifica per valutare la formazione dei biofilm.
Abstract
I biofilm sono aggregati di batteri incorporati in una matrice extracellulare a fantasia spazialmente autoprodotta. I batteri all’interno di un biofilm sviluppano una maggiore resistenza agli antibiotici, che pone potenziali pericoli per la salute, ma può anche essere vantaggioso per applicazioni ambientali come la purificazione dell’acqua potabile. L’ulteriore sviluppo di terapie antibatteriche e di applicazioni ispirate al biofilm richiederà lo sviluppo di metodi riproducibili e engineerabili per la creazione di biofilm. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo metodo di preparazione del biofilm utilizzando una stampante tridimensionale (3D) modificata con un inchiostro batterico. In questo articolo vengono descritti i passaggi necessari per creare questo biostampa 3D efficiente e a basso costo che offre più applicazioni nell’elaborazione di materiali indotti da batterio. Il protocollo inizia con una stampante 3D commerciale adattata in cui l’estrusore è stato sostituito con un erogatore di Bio-inchiostro collegato ad un sistema di pompa a siringa che consente un flusso continuo e controllabile di bio-Ink. Per sviluppare un bio-inchiostro adatto per la stampa di biofilm, i batteri di Escherichia coli ingegnerizzati sono stati sospesi in una soluzione di alginato, in modo che si solidificino a contatto con una superficie contenente calcio. L’inclusione di una sostanza chimica induttore all’interno del substrato di stampa spinge l’espressione delle proteine del biofilm all’interno del bio-Ink stampato. Questo metodo consente la stampa 3D di vari modelli spaziali costituiti da strati discreti di biofilm stampati. Tali biofilm controllati spazialmente possono fungere da sistemi modello e possono trovare applicazioni in più campi che hanno un impatto di ampio respiro sulla società, tra cui la prevenzione della resistenza agli antibiotici o la purificazione dell’acqua potabile, tra gli altri.
Introduction
Vi è attualmente una crescente necessità di sviluppare soluzioni sostenibili e rispettose dell’ambiente per la produzione di materiali spazialmente modellati, a causa del crescente numero di mercati per tali materiali1. Questo articolo presenta un metodo semplice ed economico per la produzione di tali materiali e offre quindi un ampio spettro di applicazioni future. Il metodo qui presentato consente la stampa tridimensionale (3D) di strutture spazialmente modellate utilizzando un bio-Ink contenente batteri viventi. I batteri restano vitali all’interno delle strutture stampate per oltre una settimana, permettendo ai batteri di eseguire attività metaboliche naturali o ingegnerizzate. I batteri stampati possono quindi produrre e depositare i componenti desiderati all’interno della struttura stampata, ad esempio creando un biofilm Cross-Linked funzionale2.
I metodi tradizionali per la produzione di materiali avanzati comportano elevate spese energetiche (ad es. alte temperature e/o pressioni) e possono produrre grandi quantità di rifiuti chimici, sostanze spesso tossiche che richiedono un utilizzo esteso dei costi3 ,4. Al contrario, più specie batteriche sono in grado di produrre materiali che possono essere prontamente applicabili in vari settori. Questi materiali includono polimeri come i poliidrossialkanoati (PHA)5 o poli (glicolide-co-lattide) (PGLA)6, cellulosa batterica7, materiali batterici in calcestruzzo8, compositi biomimetici9, adesivi a base di amiloide10, o interruttori elettrici a base biologica11, tra gli altri. Inoltre, la produzione batterica di materiali preziosi avviene tipicamente a temperature e pressioni quasi ambientali e in ambienti acquosi, senza richiedere o produrre composti tossici. Durante la produzione di materiali con batteri è stato dimostrato in letteratura e alcune applicazioni industriali sono già emerse12,13, un metodo affidabile per il patterning spaziale di tali materiali rimane una sfida.
Questo articolo illustra un metodo semplice per convertire una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante batterica 3D. Il protocollo illustra come preparare un bio-inchiostro contenente e sostenere i batteri viventi, nonché come preparare i substrati su cui è possibile eseguire la stampa 3D. Questo metodo è appropriato da utilizzare con una varietà di ceppi batterici naturali e ingegnerizzati in grado di produrre materiali. Questi batteri possono essere distribuiti spazialmente all’interno di una struttura stampata in 3D e continuano ancora la loro attività metabolica, che si tradurrà in una distribuzione spaziale dei materiali desiderati prodotti dai batteri.
Questo metodo di stampa consente la produzione additiva di biofilm, aggregati di batteri circondati da una matrice extracellulare autoprodotta. I biofilm sono reti 3D eterogenee in cui proteine, polimeri, cellule batteriche, ossigeno e nutrienti sono tutti strutturati spazialmente14. Mentre nella forma di un biofilm, i batteri mostrano una maggiore resistenza agli antibiotici e robustezza strutturale, rendendoli difficili da sradicare dalle superfici, compresi cateteri medici e impianti. La chiave per le proprietà biofilm, e anche la più grande sfida alla ricerca biofilm, sembra essere l’eterogeneità di biofilm15,16,17. La produzione di biofilm di modelli controllati spazialmente è di particolare interesse in quanto consentirebbe di riprodurre o di ottimizzare i modelli spaziali dei componenti del biocarburante, aiutando la comprensione del deposito stabile di biofilmi su praticamente qualsiasi superficie in natura.
Questo articolo presenta un metodo per la produzione di biofilm che utilizzano idrogel stampati in 3D contenenti batteri E. coli ingegnerizzati che producono proteine del biofilm in presenza di un induttore, nonché metodi di verifica della formazione di biocarburante2 . I principali componenti della matrice extracellulare di questi biofilm sono le fibre amiloidi di curli18 che contengono proteine csga auto-assemblate. Quando i batteri E. coli ingegnerizzati sono indotti a esprimere le proteine csga, formano un biofilm modello stabile che protegge le cellule dall’essere lavato via dalla superficie di stampa. Tale biofilm stampato in 3D può essere controllato spazialmente e può fungere da utile strumento di ricerca per l’investigazione della meccanica di struttura-funzione biofilm multiscala o materiomics19. Questi biofilm su misura aiuteranno la comprensione dei principi della formazione del biocarburante e delle loro proprietà meccaniche, consentendo ulteriori ricerche sui meccanismi di resistenza agli antibiotici tra le altre applicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato per la stampa 3D di biofilm ingegnerizzati ha due passaggi critici. In primo luogo è la preparazione della superficie di stampa agar, che è il fattore più critico per la produzione di una specifica risoluzione di stampa. È importante assicurarsi che la superficie di stampa sia piatta e che la punta della pipetta sulla testina di stampe sia posizionata all’altezza corretta dalla superficie. Se la superficie non è piatta, la distanza di lavoro cambierà durante il processo di stampa. Se la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione AOARD (No. FA2386-18-1-4059), l’organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/OCW) come parte del programma Frontiers of nanoScience, e il programma Advanced Materials NWO-NSFC (n. 729.001.016). Gli autori riconoscono l’assistenza di laboratorio di Ramon van der Valk e Roland Kieffer.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
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