Summary
在这里,我们提供了一个方法,用于分析在3D矩阵中生长斧子的行为,模仿它们的自然发育。
Abstract
该协议使用天然I型胶原蛋白生成三维(3-D)水凝胶,用于监测和分析斧状生长。该方案的核心是在大鼠尾巴肌腱衍生的I型胶原蛋白中形成的3D水凝胶内培养小块胚胎或产后啮齿动物大脑,具有特定的孔隙度。组织片在水凝胶内培养,并面对特定的脑碎片或转基因细胞聚集物,以产生和分泌适合在多孔基质内形成梯度的分子。该协议的步骤简单且可重现,但包含开发过程中要仔细考虑的关键步骤。此外,在免疫细胞化学方法固定后,可直接使用相对比显微镜或单光/多光子荧光显微镜监测和分析生长的斧子的行为。
Introduction
神经性斧头,以斧头生长锥结束,通过胚胎的细胞外基质(ECM)在特定的路径上迁移长距离,以达到适当的目标。生长锥体是斧子的远端部分,它专门用于感知细胞1,2的物理和分子环境。从分子的角度来看,生长锥体至少受四种不同的分子机制的引导:接触吸引、化学吸引、接触排斥和由不同斧突引导线索触发的切口3,4,5,6.接触介导过程可在微图案基板上的二维(2D)培养物中进行部分监测(例如,带条纹7、8或点9含有分子)。然而,斧子可以通过从环境中的引导柱细胞中感应到几个有吸引力的和令人厌恶的分子,以非扩散的方式导航到它们的目标。在这里,我们描述了一种简单的三维培养方法,以检查分泌分子是否对开发斧子产生化学吸引力或化学吸引力。
最早的研究旨在确定在三维(3-D)矩阵中使用外植培养物的斧子引导线索的影响,以生成模拟体内条件11、12的梯度。这种方法,连同体内实验,允许识别四个主要的家族的指导线索:内特林,斯利茨,塞马波林,和Ephrins4,5,6。这些分子线索和其他因素13被生长的斧突整合,触发粘附复合物的动态,并通过细胞骨架14、15、16传递机械力。为了在三维培养物中产生分子梯度,用于异形导航,先驱研究人员使用等离子凝固基质17,也用于有机切片制剂18。然而,在1958年,一个新的协议,以产生3D胶原水凝胶报告用于研究与Maximow的设备19,一个培养平台,用于几个研究适合微观观察20。另一项先驱研究报告说,胶原蛋白凝胶作为一种工具,将人类成纤维细胞嵌入到伤口愈合过程中的肌纤维细胞中。同时,Lumsden和Davies应用牛皮毛蛋白的胶原蛋白,分析神经生长因子(NGF)对感觉神经纤维22的引导作用。随着不同公司和实验室开发新的培养平台(例如多孔板),胶原蛋白培养物被适应这些新设备6、23、24、25 ,26.同时,从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖姆-肖姆肿瘤细胞系中提取的ECM物质的提取物也用于商业用途,以扩大这些研究27。
最近,已经开发出几种协议,利用三维水凝胶(例如胶原蛋白、纤维蛋白等),在斧子指导中产生具有假定作用的分子梯度。28.或者,候选分子可以在多孔基质(例如NGF29)中以不同浓度固定,或通过在分泌分子的3-D水凝胶细胞聚集体的小区域内培养产生,从而产生径向梯度4,23,24,25,26 。最后一种可能性将在本协议中解释。
这里介绍的程序是一种简单、快速和高度可重复的方法,基于对胚胎小鼠大脑三维水凝胶培养物的斧头生长的分析。与其他方法相比,该协议非常适合未经培训的研究人员,可在短期培训(1-2 周)后完全开发。在此协议中,我们首先从成年大鼠尾部分离胶原蛋白,以进一步生成三维基质,其中转基因细胞聚集物在胚胎神经元组织前培养。这些细胞聚集体形成候选分子的径向化学梯度,从而引起对生长的斧子的反应。最后,使用相对比显微镜或免疫细胞化学方法,可以轻松评估分子对生长的斧子的影响。
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Protocol
所有动物实验均根据巴塞罗那大学动物实验伦理委员会(CEEA)的指导方针和规程进行,该研究中的啮齿动物使用协议由巴塞罗那大学欧洲动物实验中心审查和批准。巴塞罗那大学(CEEA批准#276/16和141/15)。
1. 大鼠尾部胶原蛋白的纯化
- 收集成年斯普拉格-道利大鼠尾巴(8-9周大)后牺牲动物遵循伦理准则,并在95%乙醇冲洗。将 2-4 尾鱼放在冰上 (4 °C),并在过程中将其覆盖在冰上。
- 为了获得尾部肌腱,使用围塞将尾部固定在尾部最牛脊椎处,并用距第一个位于 5-7 mm 左右的第二个塞带压缩尾部。用两个赫比要急剧地扭动尾巴来折断尾巴。为此,折叠/展开椎骨几次,直到断裂。
- 用顶底慢慢拉动椎骨,使其肌腱从护套上分离出来。此时,用小剪刀剪断肌腱。将这些肌腱片放在无菌的 100 mm 培养皿中。
- 对尾部其余部分重复夹紧和滑动,直到肌腱完全提取。
- 对所有获得的尾部重复步骤 1.2-1.4。
- 在显微镜下观察肌腱。用小剪刀切割并用直细的钳子固定,以提高肌腱的纯度,用超纯水冲洗肌腱3次,从而丢弃血管。
- 收集3-4克湿肌腱。在200-250 mL玻璃圆锥烧瓶中,在4°C下将肌腱溶解在150 mL的3%冰川醋酸中,在温和的搅拌下溶解24-36小时。
- 在 20,000 x g下离心 1 小时。同时,通过切割一块长度约10-15厘米的透析管膜,将其在含有1mM乙烯二甲二甲酸(EDTA)的超纯水中煮沸15分钟。之后,用超纯水轻轻冲洗透析膜。
- 离心后,通过离心收集透析管膜中的上清液。颗粒含有酸性不溶性物质(非胶原蛋白),上清液含有可溶性胶原蛋白。
- 在 2-5 L 玻璃烧杯中,将上清液与 2 L 的无菌 0.1x 最小必需中等鹰 (MEM) 进行透析,pH 4.0。透析3天。在使用前,每天至少更换 0.1x MEM 溶液两次,每次更换时检查 pH。如果 pH 已变成基本,请用几滴 0.1 M 醋酸进行修改,直到 pH 为 4.0。
- 透析后,将抗生素(1.5 mL的青霉素/链霉素(Pen-链球菌)添加到透析胶原蛋白溶液中。制作5 mL等分的胶原蛋白库存溶液,储存在4°C。
注:从此时起,所有操作程序必须在层流罩的无菌条件下执行。 -
按照后续步骤,继续对制备的胶原蛋白库存溶液进行凝胶化测试。
- 由于库存胶原蛋白通常过于浓缩,通过稀释 0.1x MEM、pH 4.0 中的库存,制备 3 个工作稀释剂(75%、50% 和 25% 胶原蛋白溶液)。建议用于每个工作稀释的最终体积为 5 mL。在每个条件下,使用蛋白质色度测定检查蛋白质浓度。
- 将几个空的 1.5 mL 圆锥形离心管(每个工作稀释管一个)、10x MEM 管、7.5% 碳酸氢钠溶液和冰上不同的胶原蛋白工作稀释液。等待,直到这些冷却。
- 将 40-50 μL 的 10 倍 MEM 添加到冷 (4 °C) 离心管中。接下来,将其与 7-8 μL 碳酸氢钠溶液轻轻混合。
- 将一种不同胶原蛋白稀释剂的310-330 μL加入该管,并将其与移液器轻轻混合,避免任何气泡形成。将胶原蛋白-MEM-碳酸氢钠混合物保存在冰上(4°C)至少5分钟。
- 将混合物10-25 μL移液器放入35毫米培养皿中。
- 将培养皿置于 37°C 的 CO2培养箱中,直到观察到水凝胶的凝胶(± 15-20 分钟)。
- 重复步骤1.12.3-1.12.6,用于不同培养皿中剩余的胶原蛋白稀释。
- 选择可呈现最佳效果的胶原蛋白工作稀释。
注:最好的凝胶水凝胶应具有均匀的半透明质地,灰色,不应是块状或细腻的。根据我们的经验,稀释3:1(胶原:0.1倍MEM)可产生最佳的实验结果。
2. 制备细胞 (COS1) 聚合体经过基因修饰,在三维胶原蛋白水凝胶中分泌候选分子
- 板 2 x 106 COS1 细胞放入 35 mm 培养皿中,孵育完整的培养基,由 100 mL 的 D-MEM 组成,含有 10% (vol/vol) 热灭活胎儿牛血清、0.5%(wt/vol) 谷氨酰胺和 1% (wt/vol) 细胞培养液中的笔/链球菌孵化器,以达到70-80%的汇合过夜。为每个转染程序准备一个培养皿。
-
第二天,使用DNA编码候选分子(Netrin-1或Sema3E)的COS1细胞转染,按照制造商的指示使用基于脂质体转染的方法。
- 为此,将 250 μL 的无血清介质和 DNA(每个情况 1-2 μg)混合到 1.5 mL 离心管(DNA 管)中并混合。在室温(RT)下孵育5分钟。通过加入240μL的无血清培养剂和10μL的脂质体转染试剂,制备第二管(脂质体管)。在 RT 孵育 5 分钟。
- 孵育后,将DNA管的含量加入脂质体管,轻轻混合。现在在RT孵育15分钟。用1.5 mL的无血清培养基替换培养细胞上的培养基,并将DNA-脂体混合物慢慢滴到培养皿中。在CO2细胞培养箱中孵育3小时。
- 转染孵育3小时后,用完整的培养基体替换培养基,并在孵化器中孵育过夜。
- 第二天,用0.1M Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)冲洗细胞,用胰蛋白酶-EDTA(在CO2培养箱中每盘800μL,每道800μL)处理培养物,并收集具有15 mL完整培养基的分离细胞。
- 在4°C下将细胞在130 x g下离心5分钟。离心后,去除介质,在冰上保存含有COS1细胞的颗粒。
- 重复步骤 1.12.3-1.12.6 制备胶原蛋白工作混合物。
- 将100-150μL的胶原蛋白混合物加入转染细胞的颗粒中,通过上下移液轻轻混合,并将45-50μL的混合物涂到培养皿(直径35毫米)上,形成长度约1-1.5厘米的胶原蛋白细胞均匀带。将培养皿置于37°C(5%CO2)的培养箱中,直到观察到凝胶(± 15-20分钟)。
- 在第二个培养皿中准备包含控制细胞(模拟转染)的第二条,并在培养箱中盘(± 15-20 分钟),当凝胶化完成时,向包含凝胶的每个培养皿添加 3-4 mL 的加热 (37°C) COS1 完整培养基胶原蛋白细胞条状,并保存在CO2细胞培养箱中。此后,使用细手术刀或组织切碎器切割胶原蛋白细胞条以生成小方块片(长度为400至500 μm)。
- 将所有部分从相同的转染条件转移到含有3-3.5 mL的神经元培养基(NCM)的培养皿,并在解剖显微镜下检查片段的质量。同样,将它们保存在CO2细胞培养箱中。
注:神经培养基包括神经基培养基,含有1-5%(vol/vol)热灭活马血清,2 mM谷氨酰胺,0.5%(wt/vol)葡萄糖,1%(wt/vol)Pen-Strep溶液和0.044%(wt/vol)NaHCO3。确保 pH 介于 7.2-7.3 之间。
3. 为文化而培育的胚胎外生
- 按照常规灭菌指南进行高压灭菌,对手术工具(剪刀、手术刀刀柄、直钳和弯曲钳子)进行消毒。并同时制备汉克平衡盐溶液-葡萄糖缓冲液500 mL和含有10 mL的10mL的4-5个培养皿(直径100毫米)。将这些板放在冰上(4 °C)。
- 按照经批准的伦理程序,在无菌区外牺牲怀孕的雌性大鼠(胚胎日16.5)。用剪刀从腹腔切开胚胎角,并将其放入含有冷HBSS-G的大培养皿中。
- 将盘子放在层流罩中,用直钳拔下胚胎。把它们放入含有冷HBSS-G的新菜中。接下来,用小钳子去除胚胎的皮肤,并用弯曲和直钳仔细解剖大脑。把它们放入含有冷HBSS-G的盘子里。
- 在解剖显微镜下,沿着中线将大脑切成两半,用手术刀或细剪刀将两个半球分开,用细钳从脑片中取出脑细血管、脑筋和血管。
- 对胚胎的其余部分重复步骤 3.3-3.4。不要延迟解剖超过2小时,以保持组织质量。
- 使用 100% 乙醇(特别是聚四氟乙烯 (PTFE) 切割板和剃刀刀片)清洁组织切碎器的所有部分。在紫外线照射下,将组织切碎器放在层通量罩中 15 分钟。
- 将每个组织片(例如,带海马的皮层)转移到组织切碎器的切割板。对于海马,将其垂直于剃须刀刃,并获得厚度为 450-500 μm 的组织部分。
- 准备几个35毫米培养皿与3-4 mL的完整NCM和转移组织片从组织切碎板到培养皿。随着对感兴趣的区域进行解剖,可能需要许多菜肴。
- 使用细钨针完成整个NCM中的组织解剖。在解剖显微镜下检查获得切片的质量。确保在暗场光学中可以清楚地识别这些层,并用钨针解剖感兴趣的区域(例如海马的CA区域)。丢弃损坏的切片。在CO2培养箱中保持海马外植在完整的NCM培养基中。
4. 胶原水凝胶中三维共培养物的制备
- 将几个无菌 4 孔培养板放入层流罩中,并准备胶原蛋白工作混合物,如步骤 1.12.2-1.12.6 所示。
- 将15-20 μL的水凝胶混合物放入井底,以产生圆形胶原蛋白碱基。对其余油井重复此步骤。不要同时准备超过五个板,以避免水凝胶底座的液体蒸发过多。
- 将盘子保存在培养箱中,直到观察到完全的凝胶(± 15-20 分钟),并且只有在凝胶化完成时才将盘子从培养箱中拿出来。检查胶原蛋白的凝胶质量。
- 用移液器转移一小块COS1细胞聚合。将其放在水凝胶底座上,并将一块纸巾放在同一底座上,将移液器靠近一个外植体大小的细胞聚集。
- 在冰上准备新的工作胶原蛋白混合物,如步骤 1.12.2-1.12.6 中。
- 轻轻移液器 15-20 μL 这种新混合物,并覆盖外植和细胞聚合。将观察到三明治状的水凝胶培养物。此时,用细钨针重新定向外植株(不要接触 COS1 细胞聚合体!),使其面对 ±500-600 μm 的细胞聚合。
- 将板返回到培养箱,直到观察到凝胶化(± 10-15 分钟),以及 0.5 mL 的完整 NCM 补充 2% B27 补充剂,并在培养箱中保持培养 36 至 48 小时(37 °C,5% CO2)。
5. 植物细胞聚合共培养和免疫细胞化学程序的固定
- 孵育36-48小时后,取出培养基,用0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.3冲洗。之后,在4°C下将培养物与0.1M磷酸盐缓冲液(PB)、pH 7.3中的4%的甲醛固定1小时。
- 在 0.1 M PB、pH 7.3 中去除固定物并轻轻冲洗培养物 3-4 次(每次 10-15 分钟)。
- 用铲子或钳子将水凝胶三明治从井底分离。用精细画笔将胶原蛋白块转移到含有 0.1 M PBS 的 6 孔培养板,以及 0.5% 的非离子洗涤剂。
- 在阻隔溶液中孵育自由浮动水凝胶(10%血清,0.5%非离子表面活性剂,0.2%明胶在0.1M PBS中),在RT下孵育2-3小时,具有温和的搅拌。
- 用含有0.5%非离子表面活性剂的0.1M PBS冲洗3次(每次10-15分钟)。
- 在PBS中稀释原抗体孵育,含有5%血清、0.5%非离子表面活性剂、0.2%明胶和0.02%阿齐德钠。在摇摇器上4°C下用原抗体孵育36-48小时。
注:通常,针对 III 类 β-tubulin (+-TUJ-1) (稀释 1:2,000) 的抗体用于定义三维水凝胶培养物中的异体生长。 - 孵育后,如步骤5.5中那样冲洗。
- 在RT(或4°C时6-7小时)用二级抗体孵育4小时,在5%血清稀释的摇床、0.5%非离子表面活性剂和0.2%明胶中孵育。本实验使用马抗小鼠生物仿当抗体(稀释1:200)。
- 冲洗培养物,如 5.5 中。
- 在4°C下用阿维丁-生物素复合物(ABC)溶液1:100在PBS中稀释,含有5%血清、0.5%非离子表面活性剂和0.2%明胶,孵育培养物2天。或者,在同一缓冲液中使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 标记的链球蛋白(稀释 1:300-400)。
- 如 5.5 中所述冲洗培养物。
- 使用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液冲洗培养物几次,pH 7.6,持续 1 小时。
- 在0.1M Tris-HCl,pH 7.6中孵育3,3μ-Diaminobenzidine四氯化物(DAB)溶液的0.03%。
- 加入5-8 μL的1%H2O2,等待10-15分钟。 使用4-10倍物镜在显微镜下监测DAB的发展。
- 使用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液(pH 7.6)去除 DAB 溶液,从而停止反应。
- 在 PBS 中冲洗培养物 30 分钟(几次更改)。
- 使用水基安装介质将水凝胶安装到玻璃玻片上。
- 使用Sholl分析插件或使用NeuriteJ插件分析水凝胶内斧子的长度和分布情况。30。
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Representative Results
在这里,我们提出了一个广泛可访问的方法,研究胚胎小鼠神经系统的3D水凝胶胶原蛋白培养物的斧头生长。为此,我们从成年大鼠尾部分离出胶原蛋白,以生成三维基质,其中我们培养的转基因细胞聚集体,表达Netrin-1或Sema3E,与胚胎神经元组织(例如,海马的CA区域)对抗。这些细胞聚集体在胶原蛋白基质内形成候选分子的径向分布梯度。最后,为了评估神经元对不同分子的反应,我们使用免疫细胞化学方法(例如β-TUJ-1)标记培养物,并通过应用简单易量化的方法,获得了足够的数据来确定假定效果候选人的斧形行为。
在我们的实验中,当海马斧突面对Netrin-1时,这些斧子优先地向Netrin-1的源生长,这表明Netrin-1作为这些斧子的化学魅力分子(图1B)。相反,当海马斧突面对Sema3E分泌细胞时,它们中的大多数生长与细胞聚集相反,表明Sema3E是它们的化学分子(图1C)。在控制条件(模拟转染)中,所有斧子径向增长,没有任何方向偏好(图1A)。图 1D-E是斧理响应和定量方法的示意图。图像采集后,我们在外部中间画了一条线,划定了近端(接近细胞聚合)和远端(与细胞聚合相反)象限,以计算近端/远端比(P/D比率)。在控制条件下,斧头在两个象限(径向外生长)中分布均匀,指示P/D比率= 1(图1D)。当外植体显示近端象限中与远端(指示化学吸引力)相比的斧头数量增加时,其比率为 P/D > 1(图 1E),远端象限中的斧头数高于近端一(表示切莫尔普力)的比率为 P/D < 1 (图 1F)。
为了利用这项技术取得优异的结果,我们必须确保胶原蛋白聚合是均匀的,细胞转染是有效的,并且组织外植和细胞聚合之间的距离是适当的(见讨论)。
总之,我们可以确认,三维胶原蛋白水凝胶的生成是一种有用的技术,用于评估对候选指导分子的斧子生长和行为反应,这些在当中的等向迁移中可发挥重要作用。神经系统开发。
图 1:在对抗实验和定量方法中,三维水凝胶中生长的外植实例。(A-C)外植物从E14.5的海马区获得,在体外培养48小时,并通过免疫染色标记βIII-tubulin(β-TUJ-1)。可以直观地观察到斧子生长的差异。请比较 (A) 和 (B-C. . .(D-E)斧道响应和定量方法的原理表示。虚线划定近端 (P) 和远端 (D) 象限,以计算 P/D 比率 P/D = 1 表示径向增长模式(D);P/D > 1 表示化学吸引力响应(E ),P/D < 1 表示化学脉冲效应 (F)。缩写:CA = CA1-3海马区;D = 远端象限;P = 近端象限。刻度条 = 200 μm (A-C)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
发育的斧子的生长主要是侵入性的,包括ECM降解和重塑。利用这里介绍的程序,研究人员可以获得由自然型I胶原蛋白形成的均质三维基质,其中斧子(或细胞)可以响应转基因细胞在体内分泌的化学梯度。对吸引或抑制性线索(蛋白质、脂质等)梯度的不同斧状反应可以很容易地与特定控制(模拟转染细胞)进行比较。作为优点,我们必须提到,肌腱很容易分离,事实上,它们可能是动物实验的残余物。此外,肌腱是高度胶原蛋白我集中相比,其他组织,如皮肤或肺31。
尽管此处介绍的方法易于执行,但在此过程中需要特别注意一些步骤。关于胶原蛋白提取,必须去除尾部肌腱中不需要的血管和皮肤碎片,以提高胶原蛋白的纯度和凝胶化的质量。此外,在无菌层流罩下执行一些步骤并在使用前对手术工具进行消毒,必须维持无菌条件。此外,保持溶液的适当pH和温度条件也很重要。例如,如果MEM 10x和碳酸氢盐溶液不是最优的,胶原蛋白基质就不会均匀聚合,因此,斧子生长和结果将受到负面影响。此外,如果胶原蛋白库存溶液过于浓缩或太稀释,基质将无法正确凝胶化。根据我们的经验,最好的胶原蛋白库存浓度约为5-5.5mg/mL蛋白质(通过色度蛋白质测定试剂盒量化),我们使用3:1稀释(Collagen:0.1x MEM)来获得完美的水凝胶基质。关于细胞转染和细胞聚集形成,保持无菌状态和避免可能的污染非常重要,例如,使用无内毒素质粒DNA纯化试剂盒纯化质粒载体是强制性的。此外,我们必须强调,转染条件因细胞类型、通道数和质粒特征而异。在这里,我们报告了我们手中的最佳和常规条件。因此,研究人员应测试制造商指示的推荐浓度或调整它们以确定自己的最佳条件。
对于该技术可能出现的问题,我们必须考虑,有时三维矩阵并不存在预期的均质凝胶状结构。在这种情况下,检查溶液的温度和pH值状况,并在错误的情况下丢弃它们,这一点很重要。此外,建议在还原条件下进行质量控制测试,如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE),以验证胶原蛋白制剂的纯度。通过这种方法,纯和未损坏的I型胶原蛋白显示了一个典型的迁移模式,包括2个单体+链(+1和+2),3个二分链(+11,#12,变异#11),和1个三元链32,33。如果获得的胶原蛋白不适合此模式,则不应使用。最后,在免疫染色后,当面对分泌化学或化学魅力分子的细胞时,斧头可以呈径状分布。在这种情况下,必须通过在适当的共培养系统上执行点印迹技术(如果 DNA 质粒为碱性磷酸酶标记)或通过在西方转染后处理培养基来检查转染效率杂交。需要考虑的一个限制是细胞聚合和组织外植之间的距离至关重要。如果它们相距很远,我们将看不到分泌分子对外植组织的任何明显影响,但如果它们彼此非常接近,其效果将太强,不能被视为一个好结果。根据我们的经验,适当的距离大约是一个外植体大小(400-500 μm),因为细胞聚集产生的分子梯度在培养24小时后将沿400-500μm径向延伸。
或者,可以使用商业肿瘤衍生的ECM提取物代替大鼠尾部胶原蛋白。在这种情况下,所有程序必须在4至10°C之间执行,因为商业ECM提取物的凝胶化取决于温度。因此,应特别注意确保所有培养皿、移液器吸头、培养介质和溶液保持在 4°C。
最后,虽然本文介绍的方法主要与神经元功能(如斧状生长或神经元迁移)的分析相关,但它也成为药理筛选、粘附测定、体外颤动的有用技术实验和组织工程策略34,35,36。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢汤姆·约汉南的编辑建议和M.塞古拉-费柳的技术援助。这项工作由CERCA方案和加泰罗尼亚大学、大学和企业部大学与研究委员会资助(SGR2017-648)。这项工作由西班牙研究、创新和大学部(MEICO)通过BFU2015-67777-R和RTI2018-099773-B-100、西班牙普里昂网络(西班牙Prionet AGL2017-90665-REDT)和卡洛斯三世研究所资助。PRY-2018-2)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
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