Summary
Här ger vi en metod för att analysera beteendet hos växande axoner i 3D-matriser, imitera deras naturliga utveckling.
Abstract
Detta protokoll använder naturliga typ I kollagen för att generera tredimensionell (3-D) hydrogel för övervakning och analys av axonal tillväxt. Protokollet är centrerad på odling av små bitar av embryonal eller tidig postnatal gnagare hjärnor inuti en 3-D hydrogel bildas av råtta svans senan-derived typ I kollagen med specifik porositet. Vävnad bitar är odlade inuti Hydro gel och konfronteras med specifika hjärnfragment eller genetiskt modifierade cell aggregat för att producera och utsöndra molekyler som lämpar sig för att skapa en gradient inuti den porösa matrisen. Stegen i det här protokollet är enkla och reproducerbara men innehåller kritiska steg som ska övervägas noggrant under dess utveckling. Dessutom kan beteendet hos växande axoner övervakas och analyseras direkt med hjälp av ett fas-kontrast Mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens Mikroskop efter fixering av immuncytokemiska metoder.
Introduction
Neuronala axoner, slutar i axonal tillväxt koner, migrera långa sträckor genom extracellulär matrix (ECM) av embryot över specifika vägar för att nå sina lämpliga mål. Tillväxten konen är den distala delen av axon och det är specialiserat att känna den fysiska och molekyl ära miljön i cellen1,2. Ur ett molekylärt perspektiv styrs tillväxts kottar av minst fyra olika molekyl ära mekanismer: kontakt attraktion, chemoattraction, kontakt med motgång, och chemorepulser utlöst av olika axonala väglednings signaler3,4 , 5 den femte , 6. kontaktmedierade processer kan delvis övervakas i tvådimensionella (2D) kulturer på mikromönstrade substrat (t. ex. med ränder7,8 eller fläckar9 som innehåller molekylerna). Axoner kan dock navigera till sitt mål på ett icke-diffusivt sätt genom att känna av flera attraktiva och motbjudande molekyler från guidepost celler i miljön4,5,10. Här beskriver vi en enkel metod för 3-D kultur för att kontrol lera om en utsöndras molekyl inducerar chemorepulsive eller chemoattraktiv effekter på att utveckla axoner.
De tidigaste studierna syftade till att fastställa effekterna av axon vägledning Cues används explant kulturer i tredimensionella (3-D) matriser för att generera gradienter simulera in vivo villkor11,12. Detta tillvägagångs sätt, tillsammans med in vivo-experiment, möjliggjorde identifiering av fyra större familjer med vägledning: netrins, slits, semaphorins och ephrins4,5,6. Dessa molekyl ära signaler och andra faktorer13 är integrerade av de växande axonerna, utlöser dynamiken i adhesionskomplex och transducing mekaniska krafter via cytoskelettet14,15,16. För att generera molekyl ära gradienter i 3-D kulturer för axonal navigation, Ban brytande forskare använde plasmakoagel substrat17, som också användes för organotypisk skiva preparat18. Men i 1958, ett nytt protokoll för att generera 3-D kollagen vävnadsinväxt rapporterades för att studera med maximow ́s enheter19, en kultur plattform, som används i flera studier som lämpar sig för mikroskopiska observationer20. En annan pionjär studie rapporterade kollagen gel som ett verktyg för att bädda in mänskliga fibroblaster för att studera differentiering av fibroblaster till myofibroblaster i sårläkning processer21. Parallellt, Lumsden och Davies tillämpat kollagen från bovint dermis att analysera den förmodade effekten av nerv tillväxtfaktor (NGF) på väg LED ande av sensoriska nerv fibrer22. Med utvecklingen av nya kulturplattformar (t. ex. multi-well tallrikar) av olika företag och laboratorier, var kollagen kulturer anpassade till dessa nya enheter6,23,24,25 ,26. Parallellt gjordes ett utdrag av ECM-material från Engelbreth-Holm-Svärmorcellslinjen som var kommersiellt tillgängligt för att utvidga dessa studier27.
Nyligen har flera protokoll utvecklats för att generera molekyl ära gradienter med förmodade roller i Axon vägledning med hjälp av 3-D vävnadsinväxt (t. ex. kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylen immobiliseras vid olika koncentrationer i en porös matris (t. ex. NGF29) eller genereras genom odling i en liten region av 3-D Hydro gel cell aggregat som utsöndrar molekylen för att generera en radiell lutning4,23,24,25,26. Den sista möjligheten kommer att förklaras i detta protokoll.
Det förfarande som presenteras här är en enkel, snabb och mycket reproducerbar metod baserad på analys av axonal tillväxt i 3-D hydrogel kulturer av embryonala mus hjärna. I jämförelse med andra metoder är protokollet väl lämpat för icke-utbildade forskare och kan utvecklas fullt ut efter en kort utbildning (1-2 veckor). I detta protokoll, isolerar vi först kollagen från vuxna råtta svansar för att ytterligare generera 3-D matriser där genetiskt modifierade cell aggregat odlas framför den embryoneuronala vävnaden. Dessa cell aggregat bildar radiella kemiska gradienter av en kandidat molekyl som framkallar ett svar för de växande axonerna. Slutligen, utvärdering av effekterna av molekylen på växande axoner kan lätt utföras med hjälp av en fas kontrast mikroskopi eller, alternativt, immuncytochemical metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur försök utfördes enligt rikt linjer och protokoll från etik kommittén för djur försök (CEEA) vid universitetet i Barcelona, och protokollet för användning av gnagare i denna studie granskades och godkändes av CEEA i Barcelonas universitet (CEEA-godkännande #276/16 och 141/15).
1. rening av rått svans kollagen
- Samla vuxna Sprague-Dawley råtta svansar (8-9 veckor gamla) efter att ha offrat djuret efter etiska rikt linjer och skölj i 95% etanol. Placera 2-4 svansar på is (4 ° c) och förvara dem täckta med is under processen.
- För att få svans senor, fixa svansen på de mest stjärtfenan Kotor i svansen med hjälp av en hemostat och komprimera svansen med en andra hemostat placerad runt 5-7 mm från den första. Bryt svansen genom att vrida den skarpt med båda hemostatika. För att göra detta, vik/vika Kotor flera gånger tills den bryts.
- Dra ryggraden långsamt med hemostat att lossa senor från slidan som det kommer ut. I detta ögonblick, skär senor med små saxar. Förvara dessa senan bitar i en steril 100 mm petriskål på isen.
- Upprepa fast spänningen och glidningen för resten av svansen tills senor är helt extraherade.
- Upprepa steg 1.2-1.4 för alla erhållna svansar.
- Observera senor under ett Mikroskop. Kassera blod kärlen genom att skära med små saxar och hålla med raka fina pincett för att förbättra Senans renhet och skölj senor 3 gånger med ultrarent vatten.
- Samla in 3-4 g av våta senor. Lös upp senorna i 150 mL 3% isättika vid 4 ° c i en 200-250 mL-konisk kolv för 24-36 h under försiktig omrörning.
- Centrifugera vid 20 000 x g i 1 h. Parallellt, Förbered dialys slang membranet genom att skära en bit av cirka 10-15 cm i längd och koka den i ultrarent vatten som innehåller 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för 15 min. Skölj därefter försiktigt dialys membranet noggrant med ultrarent vatten.
- Efter centrifugering, samla supernatanten i dialys rör membranet genom dekantering. Pelleten innehåller sura olösliga material (icke-kollagenösa proteiner) och supernatanten innehåller lösliga kollagen proteiner.
- Dialyze supernatanten mot 2 L av steril 0.1 x minimum Essential medium Eagle (MEM), pH 4,0 i en 2-5 L glas bägare. Dialyze i 3 dagar. Ändra 0.1 x MEM lösning minst två gånger om dagen kontrol lera pH vid varje förändring innan du använder. Om pH har blivit grundläggande, modifiera den med några droppar 0,1 M ättiksyra tills pH är 4,0.
- Efter dialys, tillsätt antibiotika (1,5 mL penicillin/streptomycin (Pen-STREP)) till den dialyserade kollagen lösningen. Gör 5 mL-portioner av kollagen stam lösningen och förvara vid 4 ° c.
Anmärkning: Från denna punkt måste alla hanterings procedurer utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. -
Fortsätt med gelation test av den beredda kollagen stam lösning efter nästa steg.
- Eftersom beståndet kollagen är oftast alltför koncentrerad, förbereda 3 arbets utspädningar (75%, 50%, och 25% kollagen lösning) genom att späda beståndet i 0.1 x MEM, pH 4,0. Den slutliga volym som rekommenderas för varje arbets utspädning är 5 mL. I varje tillstånd, kontrol lera protein koncentrationen med en protein kolorimetrisk analys.
- Placera flera tomma 1,5 mL koniska centrifugrör (en för varje arbets utspädning), 10x MEM-rör, 7,5% natriumbikarbonatlösning och olika arbets utspädningar av kollagen på isen. Vänta tills dessa har svalnat.
- Tillsätt 40-50 μL 10x MEM till ett kallt (4 ° c) centrifugerör. Blanda sedan försiktigt med 7-8 μL natriumbikarbonatlösning.
- Tillsätt 310-330 μL av en av de olika kollagen utspädningar till detta rör och blanda försiktigt med pipetten undvika någon bubbla formation. Förvara kollagen-MEM-natriumbikarbonatblandningen på is (4 ° c) i minst 5 minuter.
- Pipettera 10-25 μL av blandningen till en 35 mm petriskål.
- Placera petriskål i CO2 inkubator inställd på 37 ° c tills gelation av hydrogel (± 15-20 min) observeras.
- Upprepa steg 1.12.3-1.12.6 för resterande kollagen utspädningar i olika Petriskålningar.
- Välj den kollagen arbets utspädning som återger de bästa resultaten.
Anmärkning: Den bästa geléartad hydrogel bör ha en enhetlig genomskinlig konsistens, grå färg och bör inte vara knölig eller trådiga. Enligt vår erfarenhet, en utspädning av 3:1 (kollagen: 0.1 x MEM) genererar bästa experimentella resultat.
2. beredning av cell (COS1) aggregat genetiskt modifierade för att utsöndra en kandidat molekyl i 3-D kollagen Hydrogels
- Platta 2 x 106 COS1 celler till en 35 mm petriskål och inkubera med komplett odlings substrat bestående av 100 ml D-mem innehåll ande 10% (Vol/Vol) Värmeinaktiverade fetalt serum från nötkreatur, 0,5% (WT/Vol) glutamin och 1% (WT/Vol) penna/STREP i en cell kultur inkubator, för att nå 70-80% sammanlänkning över natten. Förbered en petriskål för varje transfektion förfarande.
-
Följande dag transfect COS1 celler med DNA kodning kandidat molekylen (Netrin-1 eller Sema3E) med liposome-baserade transfection metod enligt tillverkarens instruktioner.
- För att göra detta, blanda 250 μL av serum fritt medium och DNA (1-2 μg per tillstånd) till ett 1,5 mL centrifugerör (DNA-rör) och blanda. Inkubera vid rums temperatur (RT) i 5 min. Förbered ett andra rör (Liposomalt rör) genom att tillsätta 240 μL av det serum fria mediet och 10 μL av Liposomalt transfektionreagens. Inkubera vid RT i 5 min.
- Efter inkubation, tillsätt DNA-rörets innehåll till det liposomala röret och blanda försiktigt. Nu Inkubera vid RT i 15 min. Byt ut mediet på de odlade cellerna med 1,5 mL av det serum fria mediet och tillsätt DNA-liposomer blandningen till petriskål långsamt dropwise. Inkubera i 3 timmar i CO2 cell Culture inkubator.
- Efter 3 h transfektion inkubation, ersätta mediet med hela odlings mediet och inkubera över natten i inkubator.
- Nästa dag, skölj cellerna med 0,1 M Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS), behandla kulturer med trypsin-EDTA (800 μL per varje mat rätt för 5-15 min i CO2 inkubator) och samla fristående celler med 15 ml komplett odlings substrat.
- Centrifugera cellerna vid 4 ° c vid 130 x g i 5 min. Efter centrifugering, ta bort media och bevara pelleten som innehåller COS1 celler på is.
- Upprepa steg 1.12.3-1.12.6 för att förbereda kollagen arbets blandningen.
- Tillsätt 100-150 μl av kollagen blandningen till pelleten av de transfekterade cellerna och blanda försiktigt genom att Pipettera upp och ner och fördela 45-50 μl av denna blandning på en petriskål (35 mm diameter) för att bilda ett enhetligt band av kollagen-celler på ca 1-1,5 cm i längd. Placera skålen i inkubator vid 37 ° c (5% CO2) tills gelationen (± 15-20 min) observeras.
- Förbered en andra remsa som innehåller kontroll celler (mock transfection) i en andra odlings fat och platta den i inkubator (± 15-20 min) och när gelation är klar tillsätt 3-4 ml värmts (37 ° c) COS1 komplett odlings substrat till varje mat rätt som innehåller den geléartad kollagen-celler remsor och hålla dem i CO2 cell Culture inkubator. Därefter skära kollagen-celler remsor för att generera små fyrkantiga bitar (400 till 500 μm i längd) med hjälp av en fin skalpell eller en vävnad Chopper.
- Överför alla sektioner från samma transfection tillstånd till en petriskål som innehåller 3-3.5 mL neuronala kultur media (NCM) och kontrol lera under en dissektion Mikroskop kvaliteten på bitarna. Återigen, hålla dem i CO2 cell Culture inkubator.
Anmärkning: Neuronal odlings substrat består av Neurobasal medium innehåll ande 1-5% (Vol/Vol) Värmeinaktiverade häst serum, 2 mM glutamin, 0,5% (WT/Vol) glukos, 1% (WT/Vol) Pen-STREP lösning och 0,044% (WT/Vol) NaHCO3. Se till att pH-värdet är mellan 7,2-7,3.
3. generering av embryonala Explant för kultur
- Sterilisera de kirurgiska verktyg (sax, skalpell blad handtag, raka och böjda pincett) genom autoklavering efter rutinmässiga sterilisering rikt linjer. Parallellt förbereda 500 mL Hank ' s balanserade saltlösning-glukos buffert och 4-5 petriskål (100 mm diameter) som innehåller 10 mL av HBSS-G. Placera dessa plåtar på is (4 ° c).
- Offra den gravida kvinnliga råtta (embryonal dag 16,5) utanför det sterila området, efter de godkända etiska förfaranden. Skär embryot horn med sax från bukhålan och placera den i en stor petriskål som innehåller kall HBSS-G.
- Placera skålen i laminärt flöde huva och extrahera embryon med raka pincett. Placera dem i en ny mat rätt som innehåller kall HBSS-G. Ta sedan bort huden på embryot med hjälp av små pincett och dissekera försiktigt hjärnan med hjälp av böjda och raka pincett. Placera dem i en skål som innehåller kall HBSS-G.
- Under en dissekera Mikroskop, skär hjärnan på mitten längs mitt linjen att separera båda hjärn halvorna med skalpell eller fin sax och ta bort diencefalon, hjärn hinnor och blod kärl från hjärnan bitar med fina pincett.
- Upprepa steg 3.3-3.4 med resten av embryona. Fördröja inte dissektion för mer än 2 h för att bevara vävnads kvaliteten.
- Rengör alla delar av vävnaden Chopper med 100% etanol (särskilt polytetrafluoreten (PTFE) skär plattan och rakbladet). Förvara vävnads helikoptern i den laminära Flux-huven under UV-belysning i 15 minuter.
- Överför varje vävnads bit (t. ex. cortex med Hippocampus) till skär plattan av vävnads helikoptern. För Hippocampus, placera den vinkel rät mot rakbladet och få vävnad sektioner av 450-500 μm i tjocklek.
- Förbered flera 35 mm petriskål med 3-4 mL komplett NCM och överför vävnads delar från vävnads Chopper plattan till petriskålar. Många rätter kan behövas eftersom områden av intresse är dissekeras.
- Avsluta vävnaden dissektion i den kompletta NCM med hjälp av fina volfram nålar. Kontrol lera kvaliteten på de erhållna skivorna under dissekera Mikroskop. Se till att lagren är klart identifierbara i Darkfield optik och dissekera regionen av intresse (t. ex., CA regionen Hippocampus) med volfram nålar. Kassera skadade segment. Håll Hippocampus blad sticklingar i komplett NCM medium i Co2 inkubator.
4. beredning av 3-D co-kulturer i kollagen Hydrogels
- Placera flera sterila 4-well kultur plattor i laminärt flöde huva och förbereda en kollagen arbets blandningen som tidigare anges i steg 1.12.2-1.12.6.
- Placera 15-20 μL av Hydro gel blandningen i botten av en brunn för att producera en cirkulär kollagen bas. Upprepa detta steg för resten av brunnarna. Förbered inte mer än fem plattor samtidigt för att undvika överdriven vätske avdunstning från Hydro gel basen.
- Förvara rätterna i inkubator tills hela gelationen (± 15-20 min) observeras och ta ut plattorna ur inkubatorn först när gelationen är avslutad. Kontrol lera kvaliteten på den geléartad kollagen.
- Överför en liten bit COS1 cell aggregat med en pipett. Placera den på Hydro gel basen och placera en vävnad bit på samma bas med en pipett nära cell delen aggregera vid en explant-storlek.
- Förbered en ny fungerande kollagen blandning på isen som i steg 1.12.2-1.12.6.
- Pipettera försiktigt 15-20 μL av denna nya blandning och täck över explant och cell aggregat. En Sandwich-liknande Hydro gel kultur kommer att följas. I detta ögonblick, re-orientera explant med en fin volfram nål (inte vidrör COS1 cell aggregat!), så det står inför cellen aggregat på ± 500-600 μm.
- Returnera plattan till inkubator tills gelation observeras (± 10-15 min), och 0,5 mL komplett NCM kompletteras med 2% B27 komplettera och hålla kulturer för 36 till 48 h i inkubator (37 ° c, 5% CO2).
5. fixering av Explant-cell aggregate co-kulturer och Immuncytochemical förfarande
- Efter 36-48 h inkubation, ta bort mediet och skölj med 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,3. Därefter fixera kulturerna för 1 h med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB), pH 7,3, vid 4 ° c.
- Ta bort fixativ och skölj försiktigt kulturerna 3-4 gånger (10-15 min vardera) i 0,1 M PB, pH 7,3.
- Lossa hydrogelsmörgås från botten av brunnen med spatel eller pincett. Överför kollagen blocket med en fin pensel till en 6-brunn odlings platta som innehåller 0,1 M PBS med 0,5% nonjondisk medel.
- Inkubera fritt flytande vävnadsinväxt i den blockerande lösningen (10% serum, 0,5% nonjontensider, och 0,2% gelatin i 0,1 M PBS) för 2-3 h vid rt med mild agitation.
- Skölj 3 gånger (10-15 min vardera) med 0,1 M PBS innehåll ande 0,5% nonjontensider.
- Inkubera med primär anti kropp utspädd i PBS innehåll ande 5% serum, 0,5% nonjontensider, 0,2% gelatin, och 0,02% natriumazid. Inkubera med den primära anti kroppen för 36-48 h vid 4 ° c i en shaker.
Anmärkning: Vanligt vis används en anti kropp mot klass III β-tubulin (α-TUJ-1) (utspädd 1:2000) för att definiera axonal tillväxt i 3-D Hydro gel kulturer. - Skölj enligt steg 5,5 efter inkubation.
- Inkubera med sekundär anti kropp för 4 timmar vid RT (eller 6-7 h vid 4 ° c) i en skakapparat utspädd i 5% serum, 0,5% nonjontensider och 0,2% gelatin. En häst anti-mus biotinylated anti kropp (utspädd 1:200) används i detta experiment.
- Skölj kulturer som i 5,5.
- Inkubera kulturerna i 2 dagar vid 4 ° c med avidin-biotin Complex (ABC) lösning 1:100 utspädd i PBS innehåll ande 5% serum, 0,5% nonjontensider, och 0,2% gelatin. Alternativt, Använd pepparrotperoxidas (HRP)-Tagged streptividin (utspädd 1:300-400) i samma buffert.
- Skölj kulturer enligt beskrivningen i 5,5.
- Skölj kulturerna flera gånger med 0,1 M Tris-HCl buffert, pH 7,6 för 1 h.
- Inkubera kulturerna med 0,03% av 3, 3 ′-Diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB) lösning i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Tillsätt 5-8 μL 1% H2O2 och vänta 10-15 min. övervaka utvecklingen av DAB under ett Mikroskop med en 4-10x mål.
- Stoppa reaktionen genom att ta bort DAB-lösning med 0,1 M Tris-HCl buffert, pH 7,6.
- Skölj kulturerna i PBS i 30 minuter (flera ändringar).
- Montera hydrogelerna på glas rutsch banor med vattenbaserade monterings material.
- Analysera längden och fördelningen av axonerna inuti Hydro gel med hjälp av Sholl analys plug-in eller med NeuriteJ plug-in för ImageJ program vara30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi en allmänt tillgänglig metodik för att studera axonal tillväxt i 3-D hydrogel kollagen kulturer av embryonala mus nerv systemet. För detta ändamål isolerade vi kollagen från vuxna råtta svansar att generera 3-D matriser där vi odlade genetiskt modifierade cell aggregat uttrycker Netrin-1 eller Sema3E konfronteras med embryonal neuronala vävnad (t. ex., CA region i hippocampus). Dessa cell aggregat bildade en radiellt distribuerad gradient av kandidat molekylen inuti kollagen matrisen. Slutligen, för att utvärdera neuronala svar på olika molekyler, vi märkt kulturer med immuncytochemical metoder (t. ex., α-tuj-1) och genom att tillämpa en enkel och enkel kvantifiering metod, vi fick tillräckligt med data för att fastställa effekten av den förmodade kandidat på axonal beteende.
I vårt experiment, när Hippocampus axoner konfronterades med Netrin-1, växte dessa axoner företrädes vis mot källan till Netrin-1 vilket indikerar att Netrin-1 fungerar som en kemoattraktiv molekyl för dessa axoner (figur 1B). I motsats, när Hippocampus axoner där konfronteras med Sema3E-utsöndrar celler, de flesta av dem växte motsatsen till cellen aggregat som visar att Sema3E är en chemorepulsiv molekyl för dem (figur 1C). I kontroll tillståndet (mock transfection) växte alla axoner radiellt utan någon riktnings preferens (figur 1a). Figur 1 D-E är schematiska representationer av den axonala responsen och kvantifieringsmetoden. Efter bild förvärv, drog vi en linje i mitten av explant som avgränsat proximala (nära cell aggregat) och distala (motsatsen till cell aggregat) kvadranter för att beräkna den proximala/distala ratio (P/D-tal). Under kontroll förhållanden var axonerna jämnt fördelade i båda kvadranterna (radiell utväxt) som indikerade ett förhållande P/D = 1 (figur 1D). När blad sticklingar visade ett ökat antal axoner i den proximala kvadranten i jämförelse med den distala (indikerar chemoattraction) var kvoten P/D > 1 (figur 1E) och när antalet axoner var högre i den distala kvadranten än i (vilket indikerar att det var en chemoresgrad) var kvoten P/D < 1 (figur 1F).
För att uppnå utmärkta resultat med denna teknik, måste vi se till att kollagen polymerisation är homogen, cell transfektion är effektiv, och avståndet mellan vävnaden explant och cell aggregat är lämpligt (se diskussion).
Sammanfattnings vis kan vi bekräfta att generationen av 3-D kollagen-baserade vävnadsinväxt är en användbar teknik för att utvärdera axonal tillväxt och beteende svar på kandidat vägledning molekyler som kan spela viktiga roller i axonal migration under utveckling av nerv systemet.
Figur 1 : Exempel på blad sticklingar som växer i 3-D vävnadsinväxt i konfrontations experiment och kvantifieringsmetoder. (a-C) Explants erhölls från Hippocampus regionen på E 14.5, odlade för 48 h in vitro-, och märkt med βIII-tubulin (α-TUJ-1) genom immuninfärgning. Skillnader i axonal tillväxt kan observeras visuellt. Vänligen jämför (a) med (B-C). (D-E) Schematiska representationer av den axonala responsen och kvantifieringsmetoden. Prickad linje avgränsbegränsar både proximala (P) och distala (D) kvadrant för att beräkna förhållandet P/D. ratio P/D = 1 representerar ett radiellt mönster av tillväxt (d); P/D > 1 indikerar ett kemoattraktivt svar (E), och p/d < 1 indikerar en chemorepulsiv effekt (F). Förkortningar: ca = CA1-3 Hippocampus regioner; D = distala kvadrant; P = proximala kvadrant. Skal streck = 200 μm (A-C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillväxten av att utveckla axoner är främst invasiv och inkluderar ECM nedbrytning och remodeling. Med hjälp av det förfarande som presenteras här, forskare kan få en homogen 3-D matris som bildas av den naturliga typ I kollagen där axoner (eller celler) kan reagera på en kemisk gradient utsöndras av genetiskt modifierade celler som de gör in vivo. Olika axonal svar på lutningar av attraktiva eller hämmande signaler (protein, lipider, etc.) kan lätt jämföras med specifik kontroll (mock transfekterade celler). Som fördelar måste vi nämna att senor är lätta att isolera och de kan faktiskt vara rester av djur försök. Dessutom, senor är mycket kollagen jag koncentrerade jämfört med andra vävnader såsom hud eller lung31.
Även om den metod som presenteras här är enkel att utföra, det finns några steg som behöver särskild uppmärksamhet under processen. När det gäller kollagen utvinning, är det absolut nödvändigt att ta bort oönskade blod kärl och hud skräp från svans senor för att förbättra kollagen renhet och kvaliteten på gelation. Dessutom är det obligatoriskt att bibehålla sterila förhållanden genom att utföra några steg under en steril laminär flöde huva och sterilisera de kirurgiska verktygen före användning. Dessutom är det viktigt att bibehålla lämpliga pH-och temperatur förhållanden för lösningarna. Till exempel, om MEM 10x och bikarbonatlösningar inte är optimala, kommer kollagen matrisen inte polymerisera homogent, och följaktligen, den axonala tillväxt och resultat kommer att påverkas negativt. Dessutom, om kollagen stam lösningen är för koncentrerad eller för utspädd, kommer matriserna inte gel ordentligt. Enligt vår erfarenhet, den bästa kollagen beståndet koncentrationen är cirka 5-5,5 mg/mL protein (kvantifieras av en kolorimetrisk protein assay Kit) och vi använder en 3:1 utspädning (kollagen: 0.1 x MEM) för att få perfekt hydrogel matriser. När det gäller cell transfektion och cell aggregerad formation, är det viktigt att bibehålla sterila förhållanden och undvika eventuell kontaminering, till exempel, renande Plasmid vektorer med endotoxinfria plasmid DNA-rening kit är obligatoriskt. Dessutom måste vi betona att transfection villkor varierar beroende på cell typ, passage nummer, och Plasmid egenskaper. Här har vi rapporterat de optimala och rutinmässiga förutsättningarna i våra händer. Därför bör forskarna testa de rekommenderade koncentrationer som anges av tillverkaren eller justera dem för att bestämma sina egna optimala förhållanden.
När det gäller de problem som kan uppstå med denna teknik, måste vi tänka på att ibland 3-D matriserna inte presentera den förväntade homogena gel-liknande struktur. I detta fall är det viktigt att kontrol lera temperaturen och pH-tillstånd av lösningarna och kassera dem om det är felaktigt. Också, det rekommenderas att utföra en kvalitets kontroll test såsom denaturering polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE) under minska villkoren för att validera renhet av kollagen lager beredning. Med den här metoden visar ren och oskadad typ I-kollagen ett typiskt migrations mönster som består av 2 monomeriska α-kedjor (α1 och α2), 3 dimeriskt β-kedjor (β11, β12, variant β11) och 1 trimeric γ-kedja32,33. Om den erhållna kollagen inte passar detta mönster, det bör inte användas. Slutligen, efter immunofärgning, kan axoner visas radiellt distribueras när de konfronteras med celler som utsöndrar en chemorepulsiv eller chemoattraktiv molekyl. I denna situation, effektiviteten av transfektion måste kontrol leras genom att utföra en punkt blotting teknik på rätt co-Culture system (om DNA-plasmiderna är alkaliska fosfatas-märkta) eller genom att bearbeta odlings mediet efter transfektion av västerländska blotting. En begränsning att tänka på är att avståndet mellan cellen aggregat och vävnad explant är avgörande. Om de är mycket långt ifrån varandra, kommer vi inte att kunna se någon tydlig effekt av den utsöndras molekylen på vävnaden explant, men om de är mycket nära varandra, kommer effekten vara för stark för att betraktas som ett bra resultat. Från vår erfarenhet, är lämpligt avstånd runt en explant-storlek (400-500 μm) eftersom den molekyl ära lutning som genereras av cellen aggregat kommer att förlänga radiellt från längs 400-500 μm efter 24 h i kulturen.
Alternativt kan man använda kommersiella tumör-derived ECM-extrakt i stället för råtta svans kollagen. I så fall måste alla procedurer utföras vid mellan 4 och 10 ° c, eftersom gelationen av kommersiellt ECM-extrakt är temperatur beroende. Därför bör särskild försiktighet iakttas för att säkerställa att alla kultur rätter, pipettspetsar, odlings medier och lösningar bibehålls vid 4 ° c.
Slutligen, även om den metod som presenteras här är främst förknippad med analys av neuronala funktioner såsom axonal tillväxt eller neuronala migration, det blir också en användbar teknik för den farmakologiska screening, adhesionstester, in vitro-flimmer experiment och vävnads tekniska strategier34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Tom Yohannan för den redaktionella rådgivningen och M. Segura-Feliu för den tekniska hjälpen. Detta arbete finansierades av CERCA-programmet och av kommissionen för universitet och forskning vid institutionen för innovation, universitet och företag vid Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Detta arbete finansierades av det spanska ministeriet för forskning, innovation och universitet (MEICO) genom BFU2015-67777-R och och RTI2018-099773-B-100, den spanska Prion Network (PRIONET Spanien AGL2017-90665-REDT), och Institutet Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
