Summary
Her giver vi en metode til at analysere adfærden af voksende axoner i 3D-matricer, der efterligner deres naturlige udvikling.
Abstract
Denne protokol bruger naturlige type I kollagen til at generere tredimensionale (3-D) hydrogel til overvågning og analyse af axonal vækst. Protokollen er centreret om dyrkning af små stykker af embryonale eller tidlige postnatale gnaver hjerner inde i en 3-D hydrogel dannet af Rottehale Tendon-afledt type I kollagen med specifik porøsitet. Vævs brikker dyrkes inde i hydrogel og konfronteres med specifikke hjerne fragmenter eller genetisk modificerede celle aggregater for at producere og udskille molekyler, der egner sig til at skabe en gradient inde i den porøse matrix. Trinene i denne protokol er enkle og reproducerbare, men omfatter kritiske skridt, der skal overvejes nøje under dens udvikling. Desuden kan adfærden af voksende axoner overvåges og analyseres direkte ved hjælp af et fase-kontrast mikroskop eller mono/multiphoton fluorescens mikroskop efter fiksering af immunocytokemiske metoder.
Introduction
Neuronal axons, der ender i axonal vækst kegler, migrere lange afstande gennem den ekstracellulære matrix (ECM) af embryonet over specifikke veje til at nå deres passende mål. Vækst keglen er den distale del af Axon, og det er specialiseret til at fornemme det fysiske og molekylære miljø i cellen1,2. Fra et Molekylær synspunkt, vækst kegler er styret af mindst fire forskellige molekylære mekanismer: kontakt attraktion, Chemoattraction, kontakt Repulsion, og chemorepulsion udløst af forskellige axonal Guidance stikord3,4 , 5 ) i , 6. kontakt-medierede processer kan delvist overvåges i todimensionale (2D) kulturer på mikro-mønstrede substrater (f. eks med striber7,8 eller pletter9 , der indeholder molekyler). Dog kan axoner navigere til deres mål på en ikke-difpulsiv måde ved at registrere flere attraktive og frastødende molekyler fra guidepost celler i miljøet4,5,10. Her beskriver vi en nem metode til 3-D kultur for at kontrollere, om et udskilt molekyle inducerer chemorepulsive eller chemoattraktive effekter på udvikling af axoner.
De tidligste undersøgelser havde til formål at bestemme virkningerne af Axon-vejlednings signaler, der anvendes i tredimensionale (3-D) matricer til at generere gradienter, der simulerer in vivo-forhold11,12. Denne fremgangsmåde har sammen med in vivo-eksperimenter gjort det muligt at identificere fire hoved familier med vejlednings signaler: netrins, slidser, semaphoriner og ephrins4,5,6. Disse molekylære signaler og andre faktorer13 er integreret af de voksende axoner, der udløser dynamikken i vedhæftnings komplekser og transducere mekaniske kræfter via cytoskelettet14,15,16. For at generere molekylære gradienter i 3D-kulturer for axonal navigation, brugte banebrydende forskere plasma koagulerings substrater17, som også blev anvendt til organiske udsnitspræparater18. Men, i 1958, en ny protokol til at generere 3-D kollagen silicagelrogeler blev rapporteret til at studere med maximow ́s enheder19, en kultur platform, der anvendes i flere undersøgelser egnet til mikroskopiske observationer20. En anden pioner undersøgelse rapporterede kollagen gel som et værktøj til at indlejre humane fibroblaster for at studere differentieringen af fibroblaster til myofibroblaster i sårhelings processer21. Parallelt hermed anvendte Lumsden og Davies kollagen fra kvæg dermis til at analysere den formodede effekt af nerve vækstfaktoren (NGF) på retningslinjerne for sensoriske nervefibre22. Med udviklingen af nye kultur platforme (f. eks. multi-Well-plader) fra forskellige virksomheder og laboratorier, blev kollagen kulturer tilpasset disse nye anordninger6,23,24,25 ,26. Parallelt hermed blev et ekstrakt af ECM materiale afledt af Engelbreth-Holm-Swarm tumor cellelinje gjort kommercielt tilgængelig for at udvide disse undersøgelser27.
For nylig er flere protokoller blevet udviklet til at generere molekylære gradienter med formodede roller i Axon vejledning ved hjælp af 3-D silicagelrogeler (f. eks kollagen, fibrin, etc.) 28. Alternativt kan kandidat molekylet immobiliseres ved forskellige koncentrationer i en porøs matrix (f. eks ngf29) eller genereres ved dyrkning i en lille region af 3-D hydrogel celle aggregater udskilning af molekylet til at generere en radial gradient4,23,24,25,26. Den sidste mulighed vil blive forklaret i denne protokol.
Den procedure, der præsenteres her er en nem, hurtig og meget reproducerbar metode baseret på analyse af axonal vækst i 3-D hydrogel kulturer af den embryonale musehjerne. I sammenligning med andre metoder, er protokollen velegnet til ikke-uddannede forskere og kan være fuldt udviklet efter en kort uddannelse (1-2 uger). I denne protokol, vi først isolere kollagen fra voksne rottehaler til yderligere at generere 3-D matricer, hvor genetisk modificerede celle aggregater er kultiveret foran den embryonale neuronal væv. Disse celle aggregater danner radiale kemiske gradienter af et kandidat molekyle, som fremkalder et respons for de voksende axoner. Endelig kan vurderingen af molekylets virkninger på voksende axoner let udføres ved hjælp af en fasekontrast mikroskopi eller alternativt immunocytokemiske metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne og protokollerne fra den etiske komité for dyreforsøg (CEEA) ved universitetet i Barcelona, og protokollen om anvendelse af gnavere i denne undersøgelse blev revideret og godkendt af CEEA i Universitetet i Barcelona (CEEA'S godkendelse #276/16 og 141/15).
1. rensning af Rottehale kollagen
- Saml voksne Sprague-Dawley rottehaler (8-9 uger gamle) efter at have ofret dyret efter etiske retningslinjer og skyl i 95% ethanol. Placer 2-4 haler på is (4 °C) og hold dem dækket med is under processen.
- For at opnå hale sener, fastgøre halen på de mest halehvirvler af halen ved hjælp af en hemostat og komprimere halen med en anden hemostat placeret omkring 5-7 mm fra den første. Bryd halen ved at vride den skarpt med begge hemostats. For at gøre dette, fold/udfolde ryghvirvler flere gange, indtil det bryder.
- Træk hvirvlerne langsomt med hemostat at løsne sener fra deres kappe som det kommer ud. På dette tidspunkt, skåret sener med lille saks. Opbevar disse sene stykker i en steril 100 mm Petri skål på is.
- Gentag klemmen og glidende for resten af halen, indtil sener er helt ekstraheret.
- Gentag trin 1.2-1.4 for alle de opnåede haler.
- Overhold sener under et mikroskop. Kassér blodkarrene ved at skære med små saks og holde med lige fine pincet til at forbedre senen renhed og skyl sener 3 gange med ultrarent vand.
- Saml 3-4 g våde sener. Senerne opløses i 150 mL af 3% iseddike ved 4 °C i en 200-250 mL konisk kolbe i glas til 24-36 h under forsigtig omrøring.
- Der centrifugeres ved 20.000 x g i 1 time. Parallelt hermed forberedes dialyse slangens membran ved at skære et stykke omkring 10-15 cm i længden og koge det i ultrarent vand, der indeholder 1 mm ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) i 15 min. Derefter skylles dialyse membranen forsigtigt grundigt med ultrarent vand.
- Efter centrifugering opsamles supernatanten i dialyse slangens membran ved decantation. Pellet indeholder syreholdigt uopløseligt materiale (ikke-kollagenøse proteiner) og supernatanten indeholder opløselige kollagen proteiner.
- Dialyze supernatanten mod 2 L steril 0,1 x minimum Essential medium Eagle (MEM), pH 4,0 i et 2-5 L glasbæger. Dialyze i 3 dage. Udskift 0,1 x MEM-opløsningen mindst to gange om dagen ved hver ændring før brug. Hvis pH er blevet grundlæggende, skal du ændre det med et par dråber 0,1 M eddikesyre, indtil pH er 4,0.
- Efter dialyse tilsættes antibiotika (1,5 mL penicillin/streptomycin (pen-STREP)) til den dialyserede kollagenopløsning. Der fremstiller 5 mL aliquoter af kollagenstam opløsningen og opbevares ved 4 °C.
Bemærk: Fra dette punkt skal alle håndteringsprocedurer udføres under sterile forhold i en laminar flow hætte. -
Fortsæt med gelerings testen af den tilberedte kollagenstam opløsning efter de næste trin.
- Da bestanden kollagen er normalt for koncentreret, forberede 3 arbejds fortyndinger (75%, 50%, og 25% kollagen opløsning) ved fortynding af bestanden i 0,1 x MEM, pH 4,0. Den endelige mængde, der anbefales til hver fortynding, er 5 mL. I hver tilstand skal du kontrollere proteinkoncentrationen ved hjælp af en protein kolorimetrisk analyse.
- Der anbringes flere tomme 1,5 mL koniske centrifugeglas (en for hver arbejds fortynding), 10x MEM-rør, 7,5% natriumbicarbonatopløsning og forskellige arbejds fortyndinger af kollagen på is. Vent, indtil disse afkøles.
- Der tilsættes 40-50 μL 10 x MEM til et koldt centrifugeglas (4 °C). Bland det derefter forsigtigt med 7-8 μL natriumbicarbonatopløsning.
- Tilsæt 310-330 μL af en af de forskellige kollagen fortyndinger til dette rør og bland det forsigtigt med pipetten undgå enhver bobledannelse. Opbevar kollagen-MEM-natrium bicarbonat blandingen på is (4 °C) i mindst 5 min.
- Der afpipetteres 10-25 μL af blandingen i en 35 mm Petri skål.
- Petri skålen anbringes i CO2 -inkubatoren ved 37 °c, indtil der observeres en gelering af hydrogel (± 15-20 min).
- Gentag trin 1.12.3-1.12.6 for de resterende kollagenfortyndinger i forskellige Petri skåle.
- Vælg den kollagen bearbejdning fortynding, der gør de bedste resultater.
Bemærk: Den bedste gelerede hydrogel skal have en ensartet gennemskinnelige tekstur, grå farve og bør ikke være kluden eller stram. I vores erfaring, en fortynding af 3:1 (kollagen: 0,1 x MEM) genererer de bedste eksperimentelle resultater.
2. klargøring af celle (COS1) aggregater genetisk modificeret for at udskille et kandidat molekyle i 3-D kollagen Hydrogels
- Plade 2 x 106 COS1 celler i en 35 mm Petri skåle og inkube med komplet dyrkningsmedium bestående af 100 ml D-MEM indeholdende 10% (Vol/Vol) varme inaktiveret føtalt kvægserum, 0,5% (WT/vol) glutamin og 1% (WT/vol) pen/STREP i en cellekultur for at nå 70-80% konfluency natten over. Forbered en Petri skål til hver transfecingsprocedure.
-
Den følgende dag transficere COS1 celler med DNA kodning af kandidat molekylet (netrin-1 eller Sema3E) ved hjælp af liposome-baseret transfektering metode efter producentens anvisninger.
- For at gøre dette skal du blande 250 μL serumfrit medium og DNA (1-2 μg pr. tilstand) til et 1,5 mL centrifugeglas (DNA-rør) og blande. Der inkubereres ved stuetemperatur (RT) i 5 min. Forbered endnu et rør (liposomal tube) ved at tilsætte 240 μl serumfrit medium og 10 μl liposomal transfektering reagens. Inkubeter ved RT i 5 min.
- Efter inkubation tilsættes indholdet af DNA-røret til liposomal røret og blandes forsigtigt. Nu inkube ved RT i 15 min. Udskift mediet på de dyrkede celler med 1,5 mL af det serum frie medium, og tilsæt blandingen af DNA-Liposomer til Petri skålen langsomt dropwise. Inkubere i 3 timer i CO2 cellekultur inkubator.
- Efter 3 h transfektering inkubation, udskifte mediet med det komplette dyrkningsmedium og inkubere natten i inkubator.
- Næste dag skylles cellerne med 0,1 M Dulbeccos fosfat bufferet saltvand (D-PBS), der behandles kulturer med trypsin-EDTA (800 μL pr. skål for 5-15 min i CO2 -inkubator), og der opsamles løsrevne celler med 15 ml komplet dyrkningsmedium.
- Cellerne centrifugeres ved 4 °C ved 130 x g i 5 min. Efter centrifugering, fjerne medier og bevare den pellet, der indeholder COS1 celler på is.
- Gentag trin 1.12.3-1.12.6 for at forberede kollagenarbejdsblandingen.
- Der tilsættes 100-150 μL af kollagenblandingen til de transferede cellers pellet, og blandingen blandes forsigtigt ved pipettering op og ned og spredes 45-50 μL af denne blanding på en Petri skål (35 mm diameter) for at danne en ensartet gruppe af kollagen-celler på ca. 1-1,5 cm i længden. Skålen anbringes i inkubatoren ved 37 °C (5% CO2), indtil gelationen (± 15-20 min) observeres.
- Der fremstilles en anden strimmel med kontrol celler (mock-transfection) i en anden dyrknings skål, og der fastgøres en plade i inkubatoren (± 15-20 min), og når gelationen er færdig, tilsættes 3-4 mL opvarmet (37 °C) COS1 komplet dyrkningsmedium til hver skål, der indeholder den glødende kollagenceller og opbevare dem i CO2 -cellekultur-inkubatoren. Derefter skæres kollagen-celler strimler til at generere små firkantede stykker (400 til 500 μm i længden) ved hjælp af en fin skalpel eller en vævs chopper.
- Overføre alle sektioner fra samme transfektering betingelse til en Petri skål, der indeholder 3-3.5 ml neuronal kultur medier (NCM) og kontrollere under et dissektion mikroskop kvaliteten af stykkerne. Igen, holde dem i CO2 cellekultur inkubator.
Bemærk: Neuronal kulturmedium består af Neuro basal medium indeholdende 1-5% (Vol/Vol) varme inaktiveret hest serum, 2 mM glutamin, 0,5% (WT/vol) glucose, 1% (WT/vol) pen-STREP opløsning og 0,044% (WT/vol) NaHCO3. Sørg for, at pH-værdien er mellem 7,2-7.3.
3. generation af embryonale kultur
- Steriliser de kirurgiske værktøjer (saks, skalpel klinge håndtag, lige og buede pincet) ved autoklavering efter rutinemæssige steriliserings retningslinjer. Parallelt hermed forberedes 500 mL af Hank's afbalancerede saltopløsning-glucosebuffer og 4-5 Petri skåle (100 mm diameter) indeholdende 10 mL HBSS-G. Anbring pladerne på is (4 °C).
- Ofre den gravide kvindelige rotte (embryonale dag 16,5) uden for det sterile område, efter de godkendte etiske procedurer. Skær embryo hornene med en saks fra bughulen og læg den i en stor Petri skål med kold HBSS-G.
- Skålen anbringes i laminar flow hætten, og embryonerne ekstrahere med lige pincet. Anbring dem i en ny skål med kold HBSS-G. Dernæst fjerne huden af embryonet ved hjælp af små pincet og forsigtigt dissekere hjernen ved hjælp af buede og lige pincet. Anbring dem i en skål med kold HBSS-G.
- Under en dissekere mikroskop, skær hjernen i halve langs midterlinjen for at adskille både halvkugler med skalpel eller fine saks og fjerne diencephalon, meninges og blodkar fra hjernen stykker med fine pincet.
- Gentag trin 3.3-3.4 med resten af embryonerne. Undlad at udskyde dissektion i mere end 2 timer for at bevare vævs kvaliteten.
- Rengør alle dele af vævet chopper med 100% ethanol (især polytetrafluorethylen (PTFE) skære pladen og barberbladet). Opbevar vævs chopper i laminar flux-hætten under UV-belysning i 15 min.
- Overfør hvert vævs stykke (f. eks. cortex med hippocampus) til skære pladen af vævet chopper. For hippocampus, Placer den vinkelret på barberbladet og få vævs sektioner på 450-500 μm i tykkelse.
- Forbered flere 35 mm Petri skåle med 3-4 mL komplet NCM og Overfør Vævsstykker fra vævet chopper-pladen til Petriskålene. Mange retter kan være nødvendige som regioner af interesse er dissekted.
- Afslut vævs dissektion i den komplette NCM ved hjælp af fine wolfram nåle. Kontroller kvaliteten af de opnåede skiver under dissekere mikroskop. Sørg for, at lagene er klart identificerbare i Darkfield optik og dissekere regionen af interesse (f. eks CA region i hippocampus) med wolfram nåle. Kassér beskadigede udsnit. Opbevar hippocampus eksplanteret væv i komplet NCM-medium i co2 -inkubatoren.
4. forberedelse af 3-D Co-kulturer i kollagen Hydrogels
- Anbring flere sterile 4-brønd kultur plader i laminar flow hætten og Forbered en kollagenarbejdsblanding som tidligere angivet i trin 1.12.2-1.12.6.
- Anbring 15-20 μL af hydrogel blandingen i bunden af brønden for at producere en cirkulær kollagen base. Gentag dette trin for resten af brøndene. Forbered ikke mere end fem plader på samme tid for at undgå overdreven væske fordampning fra hydrogel basen.
- Opbevar retterne i inkubator, indtil den komplette gelering (± 15-20 min) observeres og tag pladerne ud af inkubatoren, når geleringen er afsluttet. Kontroller kvaliteten af det glødende kollagen.
- Overfør et lille stykke COS1 celle aggregat med en pipette. Anbring det på hydrogel basen og læg et vævs stykke på samme base med en pipette tæt på det stykke celler, der er samlet i en ekspone-størrelse.
- Forbered en ny fungerende kollagen blanding på is som i trin 1.12.2-1.12.6.
- Pipettér forsigtigt 15-20 μL af denne nye blanding, og dæk den til et celle aggregat. En sandwich-lignende hydrogel kultur vil blive observeret. På dette tidspunkt, re-orientere den eksplantat med en fin wolfram nål (rør ikke ved COS1 celle aggregat!), så det vender cellen aggregatet på ± 500-600 μm.
- Pladen returneres til inkubatoren, indtil gelationen er observeret (± 10-15 min), og 0,5 mL komplet NCM suppleret med 2% B27 supplement og hold kulturerne for 36 til 48 h i inkubator (37 °C, 5% CO2).
5. fiksering af Explant-celle aggregat Co-kulturer og Immunocytochemical procedure
- Efter 36-48 h inkubation fjernes mediet og skylles med 0,1 M phosphatbuffered saltvand (PBS), pH 7,3. Derefter fastgøre kulturerne i 1 time med 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfatbuffer (PB), pH 7,3, ved 4 °C.
- Fjern fikseres og skyl forsigtigt kulturerne 3-4 gange (10-15 min hver) i 0,1 M PB, pH 7,3.
- Løsn hydrogel sandwichen fra bunden af brønden med spatel eller pincet. Kollagenblokken overføres med en fin pensel til en 6-brønd kultur plade, der indeholder 0,1 M PBS med 0,5% ikke-ionisk rengøringsmiddel.
- Der inkube fritflydende hydrogeler i blokerings opløsningen (10% serum, 0,5% nonioniske overfladeaktive stof og 0,2% gelatine i 0,1 M PBS) for 2-3 h ved RT med blid omrøring.
- Skyl 3 gange (10-15 min hver) med 0,1 M PBS indeholdende 0,5% nonioniske overfladeaktive stof.
- Der inkuieres med det primære antistof fortyndet i PBS indeholdende 5% serum, 0,5% nonioniske overfladeaktive stof, 0,2% gelatine og 0,02% natriumazid. Der inkurueres med det primære antistof i 36-48 h ved 4 °C på en shaker.
Bemærk: Sædvanligvis anvendes et antistof mod klasse III β-Tubulin (α-TUJ-1) (fortyndet 1:2000) til at definere axonal vækst i 3-D hydrogel kulturer. - Efter inkubation skylles som i trin 5,5.
- Der inkubieres med sekundært antistof i 4 timer ved RT (eller 6-7 h ved 4 °C) på en shaker fortyndet i 5% serum, 0,5% nonioniske overfladeaktive stof og 0,2% gelatine. En hest anti-mus biotinyleret antistof (fortyndet 1:200) anvendes i dette eksperiment.
- Skyl kulturer som i 5,5.
- Kulturerne inkubieres i 2 dage ved 4 °C med avidin-biotin Complex (ABC) opløsning 1:100 fortyndet i PBS indeholdende 5% serum, 0,5% nonioniske overfladeaktive stoffer og 0,2% gelatine. Alternativt kan du bruge peberrod peroxidase (HRP)-mærket streptavidin (fortyndet 1:300-400) i samme buffer.
- Skyl kulturer som beskrevet i 5,5.
- Skyl kulturerne flere gange med 0,1 M Tris-HCl-buffer, pH 7,6 i 1 time.
- Kulturerne inkuieres med 0,03% af 3, 3 ′-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) opløsning i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Tilsæt 5-8 μL af 1% H2O2 og vent 10-15 min. Overvåg udviklingen af DAB under et mikroskop ved hjælp af en 4-10x-målsætning.
- Stop reaktionen ved at fjerne DAB-opløsningen med 0,1 M Tris-HCl-buffer, pH 7,6.
- Skyl kulturerne i PBS i 30 minutter (flere ændringer).
- Monter hydrogellerne på glassene ved hjælp af vandige monterings medier.
- Analysér længden og fordelingen af axonerne inde i hydrogel ved hjælp af sholl Analysis plug-in eller med NeuriteJ plug-in til ImageJ software30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi en alment tilgængelig metode til at studere axonal vækst i 3-D hydrogel kollagen kulturer af embryonale muse nervesystem. Til dette formål isolerede vi kollagen fra voksne rottehaler til at generere 3-D matricer, hvor vi dyrkede genetisk modificerede celle aggregater udtrykker Netrin-1 eller Sema3E konfronteret med embryonale neuronal væv (f. eks CA region i hippocampus). Disse celle aggregater dannede en radialt distribueret gradient af kandidat molekylet inde i kollagen matrix. Til sidst, for at evaluere neuronal respons på forskellige molekyler, mærkede vi kulturerne ved hjælp af immunocytokemiske metoder (f. eks. α-TUJ-1) og ved at anvende en enkel og let kvantificerings metode, fik vi nok data til at bestemme effekten af den formodede kandidat på axonal adfærd.
I vores eksperiment, hvor hippocampale axoner blev konfronteret med Netrin-1, voksede disse axoner fortrinsvis mod kilden til Netrin-1, hvilket indikerer, at Netrin-1 fungerer som et kemoattraktivt molekyle for disse axoner (figur 1B). I modsætning hertil, når hippocampus axoner, hvor konfronteret med Sema3E-sekreterende celler, de fleste af dem voksede modsat af celle aggregatet indikerer, at Sema3E er et kemorepulsive molekyle for dem (figur 1C). I kontroltilstand (mock transfection), alle axoner voksede radialt uden nogen retningsbestemt præference (figur 1A). Figur 1 D-E er skematiske repræsentationer af axonal respons og kvantificerings metode. Efter billede erhvervelse, vi trak en linje i midten af den eksplantat, som afgrænset den proximale (tæt på celle aggregat) og den distale (modsat til celle aggregat) kvadranter for at beregne den proximale/distale ratio (P/D ratio). Under kontrolforhold blev axonerne ligeligt fordelt i begge kvadranter (radial udvækst), hvilket indikerede et forhold P/D = 1 (figur 1D). Når eksplanteret væv viste et øget antal axoner i den proximale kvadrant i forhold til den distale (indikerer Chemoattraction) var forholdet P/D > 1 (figur 1E), og når antallet af axoner var højere i den distale kvadrant end i (som indikerer kemoterapi) var forholdet P/D < 1 (figur 1F).
For at opnå fremragende resultater med denne teknik, skal vi sørge for, at kollagen polymerisering er homogen, celle transfektering er effektiv, og afstanden mellem væv eksplantat og celle aggregatet er passende (Se diskussion).
Afslutningsvis kan vi bekræfte, at dannelsen af 3-D kollagen-baserede silicagelrogeler er en nyttig teknik med henblik på at evaluere axonal vækst og adfærd svar til kandidat vejledning molekyler, som kan spille væsentlige roller i axonal migration under udvikling af nervesystemet.
Figur 1 : Eksempler på eksplanteret væv, der vokser i 3-D silicagelrogeler i konfrontations eksperimenter og kvantificeringsmetoder. (a-C) Der blev fremstillet explants fra hippocampus-regionen på e 14.5, kultiveret for 48 h in vitro, og mærket med βiii-Tubulin (α-tuj-1) ved immun farvning. Forskelle i axonal vækst kan observeres visuelt. Sammenlign venligst (a) med (b-C). (D-E) Skematiske repræsentationer af axonal respons og kvantificerings metode. Den stiplede linje afgrænser både den proximale (P) og den distale (D) kvadrant for at beregne forholdet P/D. ratio P/D = 1 repræsenterer et radialt vækstmønster (d); P/D > 1 indikerer et kemoattraktivt respons (E), og p/d < 1 indikerer en kemorepulsiv effekt (F). Forkortelser: CA = CART3 hippocampus regioner; D = distale kvadrant; P = proksimal kvadrant. Skala stænger = 200 μm (A-C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Væksten i udvikling af axoner er primært invasive og omfatter ECM nedbrydning og Remodeling. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, kan forskerne få en homogen 3-D matrix dannet af den naturlige type I kollagen, hvor axoner (eller celler) kan reagere på en kemisk gradient udskilles af genetisk modificerede celler, som de gør in vivo. Forskellige axonal respons på gradienter af attraktive eller hæmmende stikord (protein, lipider, etc.) kan let sammenlignes med specifik kontrol (mock transficeret celler). Som fordele skal vi nævne, at sener er nemme at isolere, og de kan faktisk være rester af dyreforsøg. Desuden er sener meget kollagen jeg koncentreret i forhold til andre væv såsom hud eller lunge31.
Selvom den metode, der præsenteres her, er enkel at udføre, er der nogle trin, der kræver særlig opmærksomhed under processen. Med hensyn til kollagen udvinding, er det bydende nødvendigt at fjerne uønskede blodkar og hud snavs fra hale sener for at forbedre kollagen renhed og kvaliteten af gelering. Det er også obligatorisk at opretholde sterile forhold ved at udføre nogle trin under en steril laminar flow hætte og sterilisere de kirurgiske værktøjer før brug. Desuden er det vigtigt at opretholde de korrekte pH-og temperaturforhold for løsningerne. For eksempel, hvis MEM 10x og bicarbonat løsninger ikke er optimale, vil kollagen matrix ikke polymerisere homogent, og derfor vil den axonal vækst og resultatet blive negativt påvirket. Desuden, hvis kollagen stamopløsning er for koncentreret eller for fortyndet, vil matricer ikke gel ordentligt. I vores erfaring, den bedste kollagen bestand koncentration er ca 5-5.5 mg/mL protein (kvantificeret ved en kolorimetrisk protein assay Kit) og vi bruger en 3:1 fortynding (kollagen: 0,1 x MEM) for at opnå perfekte hydrogel matricer. Med hensyn til celle transfektering og celle aggregat dannelse, er det vigtigt at opretholde sterile forhold og undgå eventuel kontaminering, for eksempel, rensning af plasmid vektorer med endotoksin-fri plasmid DNA rensning kits er obligatorisk. Også, vi skal understrege, at transfektering betingelser varierer afhængigt af celletype, passage nummer, og plasmid egenskaber. Her har vi rapporteret de optimale og rutinemæssige forhold i vores hænder. Derfor bør forskerne teste de anbefalede koncentrationer, som producenten har angivet, eller justere dem for at bestemme deres egne optimale forhold.
Med hensyn til de problemer, der kan opstå med denne teknik, skal vi overveje, at nogle gange de 3-D matricer ikke præsenterer den forventede homogene gel-lignende struktur. I dette tilfælde er det vigtigt at kontrollere opløsningers temperatur og pH-tilstand og kassere dem, hvis det er forkert. Det anbefales også at udføre en kvalitetskontrol test, såsom denaturering polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) under reducerende betingelser for at validere renheden af kollagen bestand præparat. Med denne fremgangsmåde viser ren og ubeskadiget type I kollagen et typisk migrations mønster bestående af 2 monomere α-kæder (α1 og α2), 3 dimeriske β-kæder (β11, β12, variant β11) og 1 trimeriske γ Chain32,33. Hvis det opnåede kollagen ikke passer til dette mønster, bør det ikke anvendes. Endelig, efter immun farvning, kan axoner forekomme radialt fordelt, når de konfronteres med celler, der udskiller et kemorepulsiv eller chemoattraktivt molekyle. I denne situation skal effektiviteten af transfektering kontrolleres ved at udføre en prik-blotting teknik på det rigtige Co-kultur system (hvis DNA plasmiderne er alkalisk fosfatase-mærkede) eller ved at behandle kultur medierne efter transfektering af vestlige Blotting. En begrænsning at overveje, er, at afstanden mellem cellen aggregat og væv eksplantat er afgørende. Hvis de er meget langt fra hinanden, vil vi ikke være i stand til at se nogen klar effekt af det udskillede molekyle på væv explant, men hvis de er meget tæt på hinanden, vil effekten være for stærk til at blive betragtet som et godt resultat. Fra vores erfaring, den passende afstand er omkring en explant-størrelse (400-500 μm), fordi den molekylære gradient genereret af celle aggregatet vil udvide radialt fra langs 400-500 μm efter 24 timer i kultur.
Alternativt kan man bruge kommercielle tumor-afledte ECM ekstrakt i stedet for Rottehale kollagen. I så fald skal alle procedurer udføres ved mellem 4 og 10 °C, da geleringen af det kommercielle ECM-ekstrakt er temperaturafhængig. Der skal således udvises særlig omhu for at sikre, at alle kultur retter, pipettespidser, kultur medier og opløsninger holdes ved 4 °C.
Endelig, selv om den metode, der præsenteres her er primært forbundet med analyse af neuronal funktioner såsom axonal vækst eller neuronal migration, det bliver også en nyttig teknik til farmakologisk screening, vedhæftning assays, in vitro-atrieflimren eksperimenter og vævs Engineering strategier34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Tom Yohannan for den redaktionelle rådgivning og M. Segura-Feliu for den tekniske assistance. Dette arbejde blev finansieret af CERCA-programmet og af Kommissionen for universiteter og forskning i afdelingen for innovation, universiteter og virksomhedsledelse i Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dette arbejde blev finansieret af det spanske ministerium for forskning, innovation og Universitet (MEICO) gennem BFU2015-67777-R og og RTI2018-099773-B-100, det spanske prion-netværk (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT) og Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
