Summary
Burada, 3D matrislerde büyüyen akons davranışlarını analiz etmek, doğal gelişimini taklit etmek için bir yöntem sağlıyoruz.
Abstract
Bu protokol, aksal büyümeyi izlemek ve analiz etmek için üç boyutlu (3-D) hidrojel oluşturmak için doğal tip ı kollajen kullanır. Protokol, küçük parça embriyonik veya erken postnatal kemirgen beyinleri içinde bir 3-D hidrojel tarafından oluşturulan sıçan kuyruk tendon-türetilmiş tip ı kollajen özel gözenekliliği ile kurulan üzerinde ortalanır. Doku parçaları hidrojel içinde kültürlü ve spesifik beyin parçaları veya genetiği değiştirilmiş hücre agregaları üretmek ve gözenekli matris içinde bir degrade oluşturmak için uygun molekülleri salgılama karşı karşıya. Bu protokolün adımları basit ve yeniden oluşturulabilir ancak geliştirme sırasında dikkatle değerlendirilecek kritik adımları içerir. Dahası, büyüyen akuçların davranışı, immünositoz metotları ile tespit edildikten sonra faz kontrast mikroskop veya mono/multifoton floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan izlenebilir ve analiz edilebilir.
Introduction
Akal büyüme konileri ile biten nöronal akons, uygun hedeflere ulaşmak için belirli yollar üzerinde embriyonun ekstrellüler matris (ECM) aracılığıyla uzun mesafeler göç. Büyüme koni Axon distal parçasıdır ve hücrenin fiziksel ve moleküler çevre duygusu uzmanlaşmıştır1,2. Moleküler açıdan göre, büyüme konileri en az dört farklı Moleküler mekanizma tarafından yönlendirilir: temas cazibe, chemoattraction, kontak itme, ve chemorepulsion farklı aksonal rehberlik ipuçları tarafından tetiklenen3,4 , 5 , 6. kontakt-aracılı süreçler, mikro desenli substratlar üzerinde iki boyutlu (2D) kültürlerde kısmen izlenebilir (örn. çizgiler7,8 veya molekülleri içeren9 nokta ile). Ancak, akons çevre4,5,10içinde mavi mesaj hücrelerinden birkaç çekici ve itici molekülleri algılayarak kendi hedeflerine diffusive olmayan bir şekilde gidebilirsiniz. Burada, bir salgılanmış molekülün gelişen akons üzerinde chemorepulsive veya chemocazip etkileri indükler olup olmadığını kontrol etmek için 3-D kültürün kolay bir yöntem açıklanmaktadır.
Axon rehberlik ipuçlarının etkilerinin belirlenmesine yönelik en erken çalışmalar, üç boyutlu (3-b) matrislerde eksplant kültürlerini kullanarak gradyanlar içinde vivo koşullar11,12simüle oluşturur. Bu yaklaşım, in vivo deneyler ile birlikte, rehberlik ipuçlarını dört büyük ailelerin tanımlanması için izin: netrins, yırtkıları, semaforinler, ve ephrins4,5,6. Bu moleküler ipuçları ve diğer faktörler13 büyüyen akons tarafından entegre edilir, yapışma kompleksler dinamikleri tetikleyen ve sitentresi aracılığıyla mekanik Kuvvetleri dönüştürücüler14,15,16. Aksonal navigasyon için 3-b kültürlerde moleküler degradeler oluşturmak için, öncü araştırmacılar da organotypic dilim preparatları için kullanılan plazma pıhtı substratlar17, kullanılan18. Ancak, 1958 yılında, 3-b kollajen Hidrojeller oluşturmak için yeni bir protokol maximow 's cihazları19, bir kültür platformu, mikroskobik gözlem20için uygun çeşitli çalışmalarda kullanılan bir eğitim için bildirilmiştir. Başka bir öncü çalışma, fibroblastların yara iyileşmesi süreçlerinde myofibroblastlar halinde farklılaşması için insan fibroblastları gömmek için bir araç olarak kollajen jel bildirdi21. Paralel olarak, Lumsden ve Davies duygusal sinir liflerinin rehberlik üzerinde sinir büyüme faktörü (NGF) Putatif etkisini analiz etmek için sığır dermis kollajen uygulanan22. Farklı şirketler ve laboratuvarlar tarafından yeni kültür platformlarının (örn. çok kuyu plakaları) geliştirilmesi ile kollajen kültürler bu yeni cihazlara adapte edildi6,23,24,25 ,26. Paralel olarak, Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücre hattından elde edilen ECM malzemesi ekstresi, bu çalışmaları27' ye genişletmek için ticari olarak kullanılabilir hale gelmiştir.
Son zamanlarda, 3-b hidrojelleri (örn. kollajen, fibrin vb.) kullanarak Axon rehberliğinde moleküler degradeler oluşturmak için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. 28. alternatif olarak, aday molekül bir gözenekli matris (örneğin, NGF29) farklı konsantrasyonda immobilize olabilir veya bir radyal oluşturmak için molekül salgının 3-b hidrojel hücre alların küçük bir bölgede kültür tarafından oluşturulan Gradyan4,23,24,25,26. Son olasılık bu protokolde açıklanacak.
Burada sunulan prosedür, embriyonik fare beynin 3-b hidrojel kültürlerinde akal büyüme analizine dayalı, kolay, hızlı ve son derece tekrarlanabilir bir yöntemdir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, protokol eğitimli olmayan araştırmacılar için de uygundur ve kısa bir eğitimden (1-2 hafta) sonra tamamen geliştirilebilir. Bu protokolde, biz ilk olarak daha fazla üretmek için yetişkin sıçan kuyrukları kollajen yalıtmak 3-b hangi genetiği değiştirilmiş hücre agregaları embriyonik nöronal doku önünde kültürlü olan matris. Bu hücre toplamları, büyüyen akons için bir yanıt gösteren bir aday molekül radyal kimyasal degradeler formu. Son olarak, moleküllerin büyüyen akons üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, bir faz kontrast mikroskobu veya alternatif olarak immünosittokimyasal yöntemler kullanılarak kolayca yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Barcelona Üniversitesi 'nin hayvan deneyleri Etik Komitesi (CEEA) kuralları ve protokolleri altında yapıldı ve bu çalışmada kemirgenler kullanımı için protokol incelenip, CEEA tarafından onaylanmıştır. Barselona Üniversitesi (CEEA onayı #276/16 ve 141/15).
1. rat tail kollajen arıtma
- Yetişkin Sprague-Dawley sıçan kuyrukları toplayın (8-9 hafta eski) etik yönergelere aşağıdaki hayvan ödün sonra ve% 95 etanol durulama. 2-4 kuyrukları buz üzerinde (4 °C) yerleştirin ve süreç boyunca buzla kaplı tutun.
- Kuyruk tendonları elde etmek için, bir hemostat kullanarak kuyruk en kaudal vertebra kuyruğunu düzeltmek ve ikinci bir hemostat yaklaşık 5-7 mm konumlandırılmış ilk ile kuyruk sıkıştırmak. Her iki hemostats ile keskin bir şekilde büküm kuyruk break. Bunu yapmak için, kırılana kadar vertebra birkaç kez katlayın/açın.
- Omurgaları yavaşça, hemostat ile çekin ve tendonları kılıfından ayırın. Şu anda, küçük makas ile tendon kes. Bu tendon parçaları steril 100 mm Petri çanak buz üzerinde tutun.
- Tendonlar tamamen Ayıklanacak kadar kuyruk geri kalanı için bağlama ve sürgülü tekrarlayın.
- Tüm elde edilen kuyruklar için 1.2-1.4 adımlarını tekrarlayın.
- Mikroskobun altında tendonları gözlemlemek. Küçük makas ile kesim ve tendon saflık geliştirmek ve tendonları 3 kez ultra saf su ile durulayın düz ince forseps ile tutarak kan damarlarını atın.
- Islak tendon 3-4 g toplayın. 150 mL 'de% 3 buzul asetik asit olarak 4 °C ' de, 24-36 h için 200-250 mL 'Lik cam konik Flask içinde tendonları yumuşak karıştırma altında çözülür.
- 20.000 x g 'de Santrifüjü 1 saat için. Paralel olarak, yaklaşık 10-15 cm uzunluğundaki bir parçayı keserek Dializ boru membranı hazırlayın ve 15 dakika boyunca 1 mm etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) içeren ultra saf suda kaynatın. Bundan sonra Dializ membranı yavaşça Ultra Saf suyla iyice durulayın.
- Santrifüjden sonra Dializ boru membranında süpernatant 'ı decantation ile toplayın. Pelet asidik çözünmez malzeme içerir (non-collagenous proteinler) ve süpernatant çözünür kollajen proteinleri içerir.
- 2 l steril 0.1 x asgari Essential orta kartal (MEM), pH 4,0 bir 2-5 L cam Beaker karşı süpernatant Dialyze. 3 gün boyunca Dialyze. Değiştirmek 0.1 x MEM çözüm en az iki kez bir gün kullanmadan önce her değişiklik pH kontrol. PH temel döndü ise, pH 4,0 kadar 0,1 M asetik asit birkaç damla ile değiştirin.
- Dializ sonrası, Medil kollajen çözeltisine antibiyotik ekleyin (1,5 ml penisilin/streptomisin (pen-strep)). 4 °c ' de kollajen stok çözeltisi ve deposunda 5 ml plakaya olun.
Not: Bu noktadan itibaren, tüm işleme prosedürleri laminar akış kaputunda Steril koşullar altında yapılmalıdır. -
Sonraki adımları izleyerek hazırlanan kollajen stok çözeltisi jelleşme testine devam edin.
- Stok kollajen genellikle çok konsantre olduğundan, 3 çalışma seyreltme hazırlamak (75%, 50%, ve 25% kollajen çözüm) 0.1 x MEM stok seyreltme tarafından, pH 4,0. Her çalışma seyreltme için önerilen son hacim 5 mL 'dir. Her koşulda, bir protein kolorimetrik tahlil kullanarak protein konsantrasyonu kontrol edin.
- Birkaç boş 1,5 mL konik Santrifüjlü tüpler (her çalışma seyreltme için bir tane), 10X MEM tüpler, 7,5% sodyum bikarbonat çözeltisi ve buz üzerinde kollajen farklı çalışma seyreltmeleri yerleştirin. Bunlar soğutuluncaya kadar bekleyin.
- Soğuk (4 °C) santrifüj tüpüne 40-50 μL, 10X MEM ekleyin. Ardından, 7-8 μL sodyum bikarbonat çözeltisi ile hafifçe karıştırın.
- Bu tüp için farklı kollajen dilüsyonlardan biri 310-330 μL ekleyin ve herhangi bir kabarcık oluşumu kaçınarak pipet ile hafifçe karıştırın. Kolajen-MEM-sodyum bikarbonat karışımı buz üzerinde tutun (4 °C) en az 5 dakika.
- Pipet 10-25 μL karışımı bir 35 mm Petri tabak içine.
- Hidrojelin (± 15-20 dk) jelleşme gözleninceye kadar 37 °C ' de bulunan CO2 inkükodiye Petri tabağı yerleştirin.
- Farklı Petri yemekleriyle kalan kollajen dilüsyonları için 1.12.3-1.12.6 adımlarını tekrarlayın.
- En iyi sonuçları oluşturur kollajen çalışma seyreltme seçin.
Not: En iyi jelledli hidrojel, homojen bir saydam doku, gri renk olmalıdır ve bel veya katı olmamalıdır. Deneyimimizde, 3:1 bir seyreltme (kollajen: 0.1 x MEM) en iyi deneysel sonuçları üretir.
2. hücre hazırlanması (COS1) genetik-3-b kollajen hydrogels bir aday molekül Salgılayın değiştirilmiş
- Plate 2 x 106 COS1 hücreleri bir 35 mm Petri yemekleri ve tam kültür ortamı ile inkük 100 ml oluşan D-mem içeren 10% (Vol/Vol) ısı-inaktive fetal Sığır serum,% 0,5 (WT/Vol) glutamin ve 1% (WT/Vol) pen/strep bir hücre kültüründe % 70-80 ' lik bir gecede ulaşabilmek için kuluçbacıcı. Her transfeksiyon prosedürü için bir petri tabağı hazırlayın.
-
Ertesi gün DNA ile COS1 hücreleri transfect aday molekül kodlama (netrin-1 veya Sema3E) üreticinin talimatlarını takiben Liposome tabanlı transfeksiyon yöntemi kullanarak.
- Bunu yapmak için, 250 μL 'yi serum içermeyen orta ve DNA (koşul başına 1-2 μg) ile bir 1,5 mL Santrifüjü tüpüne (DNA tüpü) karıştırın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca kulkaç yapın. ikinci bir tüp hazırlayın (Lipozomal tüp), serum içermeyen orta 240 μL ve Lipozomal transfeksiyon reakajının 10 μL 'yi ekleyerek. RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
- İnkübasyon sonrası, DNA-Tube içeriğini Lipozomal tüpe ekleyin ve hafifçe karıştırın. Şimdi RT 'de 15 dakika boyunca inküye yapın. orta, serum içermeyen orta 1,5 mL ile kültürlü hücrelerde değiştirin ve Petri çanağına DNA-liposomes karışımı yavaşça dropwise ekleyin. CO2 hücre kültürü kuluçk 3 h için inkübe.
- Transfeksiyon inkübasyon 3 h sonra, tam kültür ortamı ile orta değiştirin ve kuluçk bir gecede inkübe.
- Ertesi gün, 0,1 M Dulbecco fosfat tamponlu tuz (D-PBS) ile hücreleri durulayın, Trypsin-EDTA ile kültürlere tedavi (800 μL her çanak için 5-15 dk CO2 inkübekçi) ve tam kültür orta 15 ml ile müstakil hücreler toplamak.
- Hücreleri 4 °C ' de 130 x g 'de 5 dakika santrifüjler. Santrifüjden sonra, medyayı çıkarın ve buzda COS1 hücreleri içeren peletleri koruyun.
- 1.12.3-1.12.6 kollajen çalışma karışımı hazırlamak için adımları tekrarlayın.
- Ekleme 100-150 μL nakledilmiş hücrelerin Pelet kollajen karışımı ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile mix ve bir petri tabak (35 mm çapı) üzerinde bu karışımı 45-50 μL yaymak, yaklaşık 1-1,5 cm uzunluğundaki kollajen hücrelerden oluşan tek bir bant oluşturmak için. Çanak kuluçta 37 °C (% 5 CO2) olarak jelleşme (± 15-20 dak) gözlenene kadar yerleştirin.
- İkinci bir kültür çanak içinde kontrol hücreleri (sahte transfeksiyon) içeren ikinci bir şerit hazırlayın ve kuluçkan (± 15-20 dk) içinde plaka ve jelleşme tamamlandığında eklemek 3-4 mL ısıtılmış (37 °C) COS1 tam kültür orta jel içeren her çanak kollajen hücreleri şeritler ve CO2 hücre kültürü kuluçko onları tutmak. Bundan sonra, ince bir neşter veya bir doku helikopteri kullanarak küçük kare parçaları (400 için 500 μm) oluşturmak için kollajen hücreleri şeritler kesti.
- Aynı transfeksiyon koşulundan tüm bölümleri 3-3,5 mL nöronal kültür medyası (NCM) içeren bir petri çanağına aktarın ve bir Diseksiyon mikroskobu parçaların kalitesini kontrol edin. Yine, CO2 hücre kültürü kuluçko onları tutmak.
Not: Nöronal kültür ortamı% 1-5 (Vol/Vol) ısı-inaktive at serumu, 2 mM glutamin,% 0,5 (WT/Vol) glikoz,% 1 (WT/Vol) pen-strep solüsyonu ve% 0,044 (WT/Vol) NaHCO3Içeren Nörobazal orta oluşur. PH 7.2-7.3 arasında olduğundan emin olun.
3. kültür için embriyonik Explant üretimi
- Rutin sterilizasyon yönergelerini takiben otoklavlama ile cerrahi aletleri (makas, neşter bıçağı kolu, düz ve kavisli forseps) sterilize edin. Paralel olarak hazırlamak 500 mL Hank 'in dengeli tuz çözeltisi-glikoz tampon ve 4-5 Petri yemekleri (100 mm çapı) içeren 10 mL HBSS-G. Bu plakaları buzun üzerine yerleştirin (4 °C).
- Onaylanmış etik prosedürlerin ardından hamile kadın sıçan (embriyonik gün 16,5) Steril alan dışında feda. Karın boşluğundan makas ile embriyo boynuzları kesmek ve soğuk HBSS-G içeren büyük bir petri çanak içine yerleştirin.
- Çanak laminar akış kaputu yerleştirin ve düz forseps ile embriyo ayıklamak. Soğuk HBSS-G içeren yeni bir çanak içine yerleştirin. Daha sonra, küçük forseps kullanarak embriyonun derisini çıkarın ve eğri ve düz forseps kullanarak beyin dikkatle ortadan kaldırır. Soğuk HBSS-G içeren bir çanak içine yerleştirin.
- Bir diseksiyon mikroskop altında, orta hat boyunca yarım beyin kes hem de neşter veya ince makas ile hemheres ayırmak ve diencephalon kaldırmak, ince forseps ile beyin parçaları menenjlerin ve kan damarlarını.
- Embriyoların geri kalanı ile 3.3-3.4 arasındaki adımları yineleyin. Doku kalitesini korumak için 2 h 'den fazla diseksiyonu geciktirmeyin.
- 100% etanol ile doku helikopterin tüm parçalarını temizleyin (özellikle Politetrafloroetilen (PTFE) kesme plakası ve jilet). UV aydınlatma altında laminar Flux kaput içinde doku Chopper tutun 15 dakika.
- Her doku parçasını (örn. Hippocampus korteks) doku helikopterinin kesme plakasına aktarın. Hippocampus için, jilet için dik yerleştirin ve kalınlık 450-500 μm doku bölümleri elde.
- Tam NCM 3-4 mL ile birkaç 35 mm Petri yemekleri hazırlayın ve doku helikopteri plakadan Petri yemeklerinden doku parçalarını aktarın. İlgi bölgeleri dissected olarak birçok yemek gerekebilir.
- İnce tungsten iğneler kullanarak tam NCM doku diseksiyonu tamamlayın. Diseksiyon mikroskobu altında elde edilen dilimleri kalitesini kontrol edin. Katmanların Darkfield optiklarında açıkça tanımlandığından emin olun ve faiz bölgesini (örn. Hippocampus CA bölgesi) tungsten iğneleri ile incelemek. Hasarlı dilimleri atın. Co2 kuluçko içinde tam NCM orta hipokampal Method tutun.
4. kollajen hydrogels 3-D Co-kültürler hazırlanması
- Laminar akış kaputu birkaç steril 4-Well kültür plakaları yerleştirin ve daha önce adımlar 1.12.2-1.12.6 belirtildiği gibi bir kollajen çalışma karışımı hazırlayın.
- Dairesel kollajen tabanı üretmek için bir kuyu altına hidrojel karışımı 15-20 μL yerleştirin. Kuyuların geri kalanı için bu adımı tekrarlayın. Hidrojel tabanından aşırı sıvı buharlaşma önlemek için aynı anda beş plaka hazırlamak yok.
- Tam jelleşme (± 15-20 dk) gözlemleninceye kadar ve sadece jelleşme tamamlandığında plakalarını kuluçta tutun. Jelledli kollajen kalitesini kontrol edin.
- Bir pipet ile COS1 hücre toplama küçük bir parça aktarın. Hidrojel tabanı üzerine yerleştirin ve bir explant boyutunda toplu hücre parçası yakın bir pipet ile aynı baz üzerinde bir doku parçası yerleştirin.
- 1.12.2-1.12.6 adımlarında olduğu gibi buz üzerinde yeni bir çalışma kollajen karışımı hazırlayın.
- Bu yeni karışım 15-20 μl hafifçe pipet ve eksplant ve hücre toplamasını kapsar. Sandviç gibi hidrojel kültürü gözlenir. Şu anda, ince bir tungsten iğne ile eksplant yeniden oryantate (COS1 hücre toplu dokunmayın!), bu yüzden ± 500-600 μm olarak hücre toplama yüzleri.
- Jelleşme gözlemleninceye kadar plakayı kuluçta geri dönün (± 10-15 dk), ve 0,5 mL tam NCM 2% B27 takviyesi ile tamamlayıcı ve kültürlere 36 için 48 h kuluçta tutun (37 °C, 5% CO2).
5. Explant-hücre toplama Co-kültürler ve Immünositokimyasal prosedür fikreme
- 36-48 sonra inkübasyon, orta çıkarın ve 0,1 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7,3 ile durulayın. Bundan sonra, 0,1 M fosfat tampon (Pb), pH 7,3, 4 °c ' de% 4 civarında formaldehite ile 1 h için kültürler düzeltin.
- Fiksatif çıkarın ve yavaşça kültürler 3-4 kez durulayın (10-15 dk her) içinde 0,1 M PB, pH 7,3.
- Hidrojel sandviç de spatula veya forseps ile kuyu dibinde ayırın. % 0,5 olmayan iyonik deterjan ile 0,1 M PBS içeren 6-well kültür plakasına ince bir boya fırçası ile kollajen bloğu aktarın.
- Engelleme çözeltisi (% 10 serum, 0,5% ısı olmayan yüzey ve 0,2% jelatin içinde 0,1 M PBS) ve yumuşak ajitasyon ile RT 'de 2-3 h için serbest yüzen hidrogonları kuluçk.
- 0,1 M PBS ile% 0,5 iyonik olmayan yüzey bilgi içeren 3 kez (10-15 dk) durulayın.
- % 5 serum içeren PBS 'de seyreltilmiş primer antikor ile inkük,% 0,5 iyonik olmayan yüzey kaynağı, 0,2% jelatin ve% 0,02 sodyum azid. 36-48 için primer antikor ile 4 °C ' de bir çalkalayıcı üzerinde inkük.
Not: Genellikle Sınıf III β-tubulin (α-TUJ-1) (seyreltilmiş 1:2000) karşı bir antikor, 3-b hidrojel kültürlerde aksonal büyüme tanımlamak için kullanılır. - İnkübasyon sonrasında, 5,5 adımda durulayın.
- RT 'de 4 h (ya da 4 °C ' de 6-7 h) için ikincil antikor ile inküye,% 5 serum, 0,5% Non-İyonik yüzey ve% 0,2 jelatin içinde seyreltilebilir. Bu deneyde bir at Anti-fare biyotinlenmiş antikor (seyreltilmiş 1:200) kullanılır.
- 5,5 gibi kültürler durulayın.
- Kültürleri 2 gün boyunca 4 °C ' de avidin-biotin kompleksi (ABC) çözeltisi 1:100% 5 serum, 0,5% Non-İyonik yüzey ve% 0,2 jelatin içeren PBS 'de seyreltilmiş. Alternatif olarak, aynı tamponda horserpu peroksidaz (HRP)-etiketlenmiş streptavidin (seyreltilmiş 1:300-400) kullanın.
- 5,5 'de açıklandığı gibi kültürlere durulayın.
- 0,1 M Tris-HCl tampon ile birkaç kez kültürlere durulayın, pH 7,6 için 1 h.
- 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 ' de 3, 3 '-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) çözeltisi% 0,03 ile kültürlere inküye yapın.
- Ekle 5-8 μL 1% H2O2 ve Wait 10-15 dk. 4-10X objektif kullanarak bir mikroskop altında DAB gelişimini izlemek.
- 0,1 M Tris-HCl tampon, pH 7,6 ile DAB çözümünü kaldırarak reaksiyonu durdurun.
- PBS 'deki kültürlere 30 dakika boyunca durulayın (birkaç değişiklik).
- Sulu bazlı montaj medyasını kullanarak hidrojeleri cam slaytlara takın.
- Sholl Analizi eklentisi veya ımagej yazılımı30Için NeuriteJ plug-in ile hidrojel içindeki akonların uzunluğunu ve dağıtımını analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, embriyonik fare sinir sisteminin 3-b hidrojel kollajen kültürlerinde akal büyüme çalışması için yaygın olarak erişilebilen bir metodoloji sunuyoruz. Bu amaçla, biz yetişkin sıçan kuyrukları gelen kollajen, biz genetiği değiştirilmiş hücre agregasyon netrin-1 veya embriyonik nöronal doku (örneğin, Hippocampus CA bölgesi) ile karşı karşıya Sema3E ifade eden 3-b matrisler oluşturmak için izole. Bu hücre agregaları, kollajen matrisinin içinde aday molekülün radyal olarak dağıtılmış bir gradyan oluşturdu. Son olarak, farklı moleküllere nöronal tepkisi değerlendirmek için, biz immünsitokimyasal yöntemleri kullanarak kültürler etiketli (örneğin, α-TUJ-1) ve basit ve kolay bir ölçüme yöntemi uygulayarak, biz Putatif etkisini belirlemek için yeterli veri elde Aksiyal davranışla ilgili aday.
Bizim deneyimizde, hipokampal akons netrin-1 ile karşı karşıya olduğu zaman, bu akons tercihen netrin-1 kaynağına doğru büyüdü ve netrin-1 Bu akons için kemoçekici bir molekül olarak davranır (Şekil 1B). Bunun aksine, Sema3E-salgılamış hücrelerle karşı karşıya olan hipokampal akons, çoğu Sema3E, onlar için kemorepulsif bir molekül olduğunu belirten hücre toplamını tersine büyüdü (Şekil 1C). Kontrol koşulunda (sahte transfeksiyon) tüm akons herhangi bir yön tercihi olmaksızın radyal olarak büyüdü (Şekil 1A). Şekil 1 D-E , akaks tepkisi ve ölçme yönteminin şematik temsilleridir. Görüntü satın aldıktan sonra, proksimal/distal oranı (P/D oranı) hesaplamak için proksimal (hücre toplamasına yakın) ve distal (hücrenin toplamının tersi) dörtgen sınırlandırılmış eksplant ortasında bir çizgi çekti. Kontrol koşullarında akons, P/D = 1 (Şekil 1d) oranı belirtilen iki dörtgen (radyal büyüme) olarak eşit olarak dağıtılmıştır. Method distal (kemocazibe gösteren) ile karşılaştırıldığında proksimal çeyreğinde akons sayısı artmış gösterdi zaman oranı P/D > 1 (Şekil 1E) ve zaman akons sayısı distal çeyreğinde daha yüksek oldu proksimal bir (chemorepulsion gösteren) oranı P/D < 1 (Şekil 1F).
Bu teknikle mükemmel sonuçlar elde etmek için, kollajen polimerizasyon homojen olduğundan emin olmalıyız, hücre transfeksiyon etkilidir, ve doku eksplant ve hücre toplu arasındaki mesafe uygun (tartışma bakın).
Sonuç olarak, 3-b kollajen bazlı hidrojellerin jenerasyonunun, akbel göçü sırasında temel roller oynayabilen aday rehberlik moleküllerine Aksiyal büyüme ve davranış yanıtlarını değerlendirmek amacıyla yararlı bir teknik olduğunu teyit edebilirsiniz. sinir sistemi geliştirme.
Şekil 1 : 3-b hidrojellerde çatışmaya yönelik deneyler ve ölçüme yöntemlerinde büyüyen Method örnekleri. (A-C) Explants E 14.5 ' de hipokampal bölgesinden elde edildi, 48 h in vitro için kültür, ve immunoostaining ile Βııı-tubulin (α-TUJ-1) ile etiketlenmiş. Akal büyümede farklılıklar görsel olarak gözlemlenebilir. Lütfen (A) Ile (B-C) karşılaştırın. (D-E) Akaks tepkisi ve ölçüme yönteminin şematik temsili. Noktalı çizgi, P/D oranını hesaplamak için hem proksimal (P) hem de distal (D) çeyreği sınırlandıracaktır. P/D oranı = 1, radyal büyüme (D) desenini temsil eder; P/D > 1, kemoçekici bir yanıtı (E) ve p/d < 1 ' i bir kemorepulsif etkiyi (F) gösterir. Kısaltmalar: CA = CA1-3 hipokampal bölgeler; D = distal çeyrek; P = proksimal çeyrek. Ölçek çubukları = 200 μm (A-C). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelişen akonların büyümesi ağırlıklı olarak invaziv olup ECM bozulması ve yeniden modelleme içerir. Burada sunulan prosedürü kullanarak, araştırmacılar, doğal tip ı kollajen tarafından oluşturulan homojen bir 3-b matris elde edebilirsiniz hangi akons (veya hücreler) genetik olarak değiştirilmiş hücreler tarafından salgılanan bir kimyasal degrade yanıt verebilir onlar in vivo gibi. Çekici veya inhibitör ipuçları (protein, lipidler, vb) degradeler için farklı aksal tepkiler kolayca belirli kontrol (sahte nakli hücreler) ile karşılaştırıldığında olabilir. Avantajları olarak, biz tendonlar izole etmek kolay ve gerçekten onlar hayvan deney kalıntıları olabilir söz gerekir. Buna ek olarak, tendonlar deri veya akciğer31gibi diğer dokulara kıyasla konsantre son derece kollajen vardır.
Burada sunulan metodoloji gerçekleştirmek için basit olsa da, süreç boyunca özel dikkat gereken bazı adımlar vardır. Kollajen ekstraksiyon ile ilgili olarak, kollajen saflık ve jelleşme kalitesini artırmak için kuyruk tendonları istenmeyen kan damarlarını ve cilt enkaz kaldırmak için zorunludur. Ayrıca, steril bir laminar akış kaputu altında bazı adımlar uygulayarak ve kullanmadan önce cerrahi aletler sterilize steril koşulları korumak için zorunludur. Ayrıca, çözümlerin uygun pH ve sıcaklık koşullarını korumak önemlidir. Örneğin, MEM 10X ve bikarbonat çözeltileri optimum değilse, kollajen matris homojen polimerize olmayacaktır, ve sonuç olarak, akal büyüme ve sonuç olumsuz etkilenecektir. Ayrıca, kollajen stok çözümü çok konsantre ya da çok seyreltilmiş ise, matrisler düzgün jel olmayacaktır. Bizim deneyimimizde, en iyi kollajen stok konsantrasyonu yaklaşık 5-5.5 mg/mL protein (bir kolorimetrik protein tahlil kiti ile nicelik) ve biz bir 3:1 seyreltme kullanın (kollajen: 0.1 x MEM) mükemmel hidrojel matrisler elde etmek. Hücre transfeksiyon ve hücre toplama oluşumu ile ilgili olarak, Steril koşullar korumak ve olası kontaminasyonu önlemek için önemlidir, örneğin, endotoksin içermeyen plazmid DNA arıtma kitleri ile Plasmid vektörler arındırmak zorunludur. Ayrıca, transfeksiyon koşullarının hücre tipine, geçiş numarasına ve Plasmid özelliklerine bağlı olarak değişebileceğini vurgulaymalıdır. Burada, en uygun ve rutin koşulları elimizde bildirdik. Bu nedenle, araştırmacılar üretici tarafından belirtilen önerilen konsantrasyonları test etmeli veya kendi optimum koşulları belirlemek için bunları ayarlayın.
Bu teknikle ortaya çıkabilecek sorunlarla ilgili olarak, bazen 3-b Matrislerin beklenen homojen jel benzeri yapıyı sunmadığı düşünülmelidir. Bu durumda, çözeltinin sıcaklığını ve pH durumunu kontrol etmek ve yanlış olması durumunda onları atmak önemlidir. Ayrıca, kollajen stoklarının saflığını doğrulamak için azaltma koşulları altında denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-Page) gibi bir kalite kontrol testi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Bu yaklaşımla, saf ve hasarlı tip ı kollajen 2 monomerik α zincirleri (α1 ve α2), 3 dimerik β zincirleri (β11, β12, Variant β11) ve 1 Trimerik γ zincir32,33oluşan tipik bir göç deseni gösterir. Elde edilen kollajen Bu desenle uyumlu değilse, kullanılmamalıdır. Son olarak, immünostüle ettikten sonra, kemorepulsif veya kemoçekici bir molekül salgılamış hücrelerle karşı karşıya kaldığında akons radyal olarak dağıtılabilir. Bu durumda, transfeksiyon etkinliğini uygun Co-Culture sistemi (DNA plazmids alkali fosfataz etiketli) veya Batı tarafından transfeksiyon sonra kültür medyasını işleyerek bir nokta Blot tekniği gerçekleştirerek kontrol edilmelidir Blot. Dikkate alınması gereken bir sınırlama, hücre toplama ve doku eksplant arasındaki mesafeyi çok önemlidir. Onlar çok uzakta iseniz, biz doku explant üzerinde salgılanmış molekül herhangi bir net etkisi görmek mümkün olmayacaktır, ama çok birbirlerine yakın iseniz, etkisi iyi bir sonuç olarak kabul edilecek çok güçlü olacaktır. Bizim deneyim, uygun mesafe etrafında bir explant-boyutu (400-500 μm) çünkü hücre toplu tarafından oluşturulan moleküler gradyan arasında radyal genişletir 400-500 μm sonra 24 h kültür.
Alternatif olarak, bir fare kuyruğu kollajen yerine ticari tümör türevi ECM özü kullanabilirsiniz. Bu durumda, tüm prosedürler 4 ile 10 °C arasında yapılmalıdır, çünkü ticari ECM ekstresinin gelasyonu sıcaklığa bağımlıdır. Bu nedenle, tüm kültür yemekleri, pipet uçları, kültür medyası ve çözümleri 4 °C ' de tutulması için özel bakım alınmalıdır.
Son olarak, burada sunulan Yöntem ağırlıklı olarak akal büyüme veya nöronal göç gibi nöronal fonksiyonların analizi ile ilişkili olmasına rağmen, aynı zamanda farmakolojik tarama için yararlı bir teknik olur, yapışma testi, in vitro fibrilasyon deneyler ve doku mühendisliği stratejileri34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik yardım için editoryal tavsiye ve M. Segura-Feliu için Tom Yohannan teşekkür ederiz. Bu çalışma CERCA programı tarafından ve üniversiteler ve Inovasyon, üniversiteler ve Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) Işletme departmanı Araştırma Komisyonu tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, Ispanyol araştırma, yenilik ve üniversite (MEICO) BFU2015-67777-R ve RTI2018-099773-B-100, Ispanyol prion ağı (Prionet Ispanya AGL2017-90665-REDT) ve Enstitüsü Carlos III, CIBERNED (tarafından finanse edildi PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
