Summary
Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.
Abstract
Ce protocole utilise du collagène naturel de type I pour générer de l'hydrogel tridimensionnel (3-D) pour la surveillance et l'analyse de la croissance axonale. Le protocole est centré sur la culture de petits morceaux de cerveaux embryonnaires ou postnatals de rongeurs à l'intérieur d'un hydrogel 3D formé par le collagène de type I dérivé du tendon de queue de rat avec la porosité spécifique. Les morceaux de tissu sont cultivés à l'intérieur de l'hydrogel et confrontés à des fragments de cerveau spécifiques ou des agrégats de cellules génétiquement modifiés pour produire et sécrére des molécules appropriées pour créer un gradient à l'intérieur de la matrice poreuse. Les étapes de ce protocole sont simples et reproductibles, mais comprennent des étapes critiques à examiner attentivement au cours de son développement. En outre, le comportement des axones croissants peut être surveillé et analysé directement à l'aide d'un microscope de contraste de phase ou d'un microscope à fluorescence mono/multiphoton après fixation par des méthodes immunocytochimiques.
Introduction
Les axones neuronaux, se terminant par des cônes de croissance axonale, migrent sur de longues distances à travers la matrice extracellulaire (ECM) de l'embryon sur des voies spécifiques pour atteindre leurs cibles appropriées. Le cône de croissance est la partie distale de l'axone et il est spécialisé pour détecter l'environnement physique et moléculaire de la cellule1,2. D'un point de vue moléculaire, les cônes de croissance sont guidés par au moins quatre mécanismes moléculaires différents : attraction de contact, chimioattraction, répulsion de contact, et chemorepulsion déclenchée par différents indices de guidage axonal3,4 , 5 Annonces , 6. Les processus négociés par contact peuvent être partiellement surveillés dans des cultures bidimensionnelles (2D) sur des substrats micro-modèles (p. ex., avec des rayures7,8 ou des taches9 contenant les molécules). Cependant, les axones peuvent naviguer vers leur cible d'une manière non-diffusive en sentant plusieurs molécules attrayantes et répulsives des cellules de guidage dans l'environnement4,5,10. Ici, nous décrivons une méthode facile de culture 3-D pour vérifier si une molécule sécrétée induit des effets chémorepulsifs ou chimioattractive sur le développement des axones.
Les premières études visaient à déterminer les effets des indices de guidage d'axone utilisés explant cultures dans des matrices tridimensionnelles (3-D) pour générer des gradients simulant des conditions in vivo11,12. Cette approche, ainsi que des expériences in vivo, a permis d'identifier quatre grandes familles de repères d'orientation: Netrins, Slits, Semaphorins, et Ephrins4,5,6. Ces indices moléculaires et d'autres facteurs13 sont intégrés par les axones en croissance, déclenchant la dynamique des complexes d'adhérence et transduisant les forces mécaniques via le cytosquelette14,15,16. Pour générer des gradients moléculaires dans les cultures 3D pour la navigation axonale, les chercheurs pionniers ont utilisé des substrats de caillots plasmatiques17, qui a également été utilisé pour les préparations de tranches organotypiques18. Cependant, en 1958, un nouveau protocole pour générer des hydrogels de collagène 3D a été rapporté pour l'étude avec les dispositifs de Maximow19, une plate-forme de culture, utilisée dans plusieurs études appropriées pour les observations microscopiques20. Une autre étude pionnière a rapporté le gel de collagène comme outil pour intégrer des fibroblastes humains pour étudier la différenciation des fibroblastes dans les myofibroblastes dans les processus de guérison des plaies21. En parallèle, Lumsden et Davies ont appliqué du collagène du derme bovin pour analyser l'effet putatif du facteur de croissance nerveuse (NGF) sur le guidage des fibres nerveuses sensorielles22. Avec le développement de nouvelles plateformes culturelles (p. ex., plaques multi-puits) par différentes entreprises et laboratoires, les cultures de collagène ont été adaptées à ces nouveaux dispositifs6,23,24,25 ,26. En parallèle, un extrait de matériel d'ECM dérivé de la lignée cellulaire de tumeur d'Engelbreth-Holm-Swarm a été rendu disponible commercialement pour étendre ces études27.
Récemment, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des gradients moléculaires avec des rôles putatifs dans le guidage des axones à l'aide d'hydrogels 3D (p. ex. collagène, fibrine, etc.) 28. Alternativement, la molécule candidate peut être immobilisée à une concentration différente dans une matrice poreuse (p. ex., NGF29) ou générée par la culture dans une petite région des agrégats de cellules hydrogel 3D sécrétant la molécule pour générer un rayonnement gradient4,23,24,25,26. La dernière possibilité sera expliquée dans ce protocole.
La procédure présentée ici est une méthode facile, rapide et hautement reproductible basée sur l'analyse de la croissance axonale dans les cultures d'hydrogel 3D du cerveau embryonnaire de souris. En comparaison avec d'autres méthodes, le protocole est bien adapté aux chercheurs non formés et peut être entièrement développé après une courte formation (1-2 semaines). Dans ce protocole, nous isolons d'abord le collagène des queues de rat adultes pour produire davantage de matrices 3D dans lesquelles les agrégats de cellules génétiquement modifiés sont cultivés devant le tissu neuronal embryonnaire. Ces agrégats cellulaires forment des gradients chimiques radiaux d'une molécule candidate qui provoque une réponse pour les axones en croissance. Enfin, l'évaluation des effets de la molécule sur les axones en croissance peut facilement être effectuée à l'aide d'une microscopie de contraste de phase ou, alternativement, de méthodes immunocytochimiques.
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Protocol
Toutes les expériences animales ont été réalisées dans le cadre des lignes directrices et protocoles du Comité éthique pour l'expérimentation animale (CEEA) de l'Université de Barcelone, et le protocole pour l'utilisation des rongeurs dans cette étude a été examiné et approuvé par le CEEA de la l'Université de Barcelone (approbation de la CEEA #276/16 et 141/15).
1. Purification du collagène de queue de rat
- Recueillir les queues de rat Sprague-Dawley adultes (8-9 semaines) après avoir sacrifié l'animal en suivant des directives éthiques et rincer à 95% d'éthanol. Placer 2 à 4 queues sur la glace (4 oC) et les garder couvertes de glace pendant le processus.
- Pour obtenir des tendons de queue, fixer la queue aux vertèbres les plus caudales de la queue à l'aide d'un hemostat et comprimer la queue avec un deuxième hemostat positionné autour de 5-7 mm de la première. Cassez la queue en la tordant brusquement avec les deux hemostats. Pour ce faire, plier / déplier les vertèbres plusieurs fois jusqu'à ce qu'il se brise.
- Tirez lentement les vertèbres avec l'hémostat pour détacher les tendons de leur gaine au fur et à mesure qu'elle sort. En ce moment, couper les tendons avec de petits ciseaux. Gardez ces morceaux de tendon dans un plat stérile de 100 mm Petri sur la glace.
- Répétez le serrage et le glissement pour le reste de la queue jusqu'à ce que les tendons soient totalement extraits.
- Répétez les étapes 1.2-1.4 pour toutes les queues obtenues.
- Observez les tendons au microscope. Jeter les vaisseaux sanguins en coupant avec de petits ciseaux et en tenant avec des forceps fins droites pour améliorer la pureté du tendon et rincer les tendons 3 fois avec de l'eau ultrapure.
- Recueillir 3-4 g de tendons humides. Dissoudre les tendons dans 150 ml d'acide acétique glaciaire à 3 oC dans un flacon conique en verre de 200 à 250 ml pendant 24 à 36 h, sous un léger remuant.
- Centrifugeuse à 20 000 x g pour 1 h. En parallèle, préparer la membrane de tuyauterie de dialyse en coupant un morceau d'environ 10-15 cm de longueur et le faire bouillir dans de l'eau ultrapure contenant 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) pendant 15 min. Par la suite, rincer délicatement la membrane de dialyse à l'eau ultrapure.
- Après centrifugation, recueillir le supernatant dans la membrane de tuyauterie de dialyse par décantation. La pastille contient du matériel insoluble acide (protéines non collagènes) et le supernatant contient des protéines solubles de collagène.
- Dialyser le supernatant contre 2 L de stérile 0.1x Minimum Essential Medium Eagle (MEM), pH 4.0 dans un bécher en verre de 2-5 L. Dialyser pendant 3 jours. Modifier la solution 0.1x MEM au moins deux fois par jour en vérifiant le pH à chaque changement avant d'utiliser. Si le pH est devenu basique, modifiez-le avec quelques gouttes d'acide acétique de 0,1 M jusqu'à ce que le pH soit de 4,0.
- Après la dialyse, ajouter les antibiotiques (1,5 ml de pénicilline/streptomycine (Pen-Strep)) à la solution de collagène dialysé. Faire 5 mL d'aliquots de la solution de stock de collagène et conserver à 4 oC.
REMARQUE: À partir de ce moment, toutes les procédures de manipulation doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à débit laminaire. -
Procéder à l'essai de gélation de la solution préparée de stock de collagène suivant les étapes suivantes.
- Comme le collagène de stock est généralement trop concentré, préparer 3 dilutions de travail (75%, 50%, et 25% solution de collagène) en diluant le stock en 0.1x MEM, pH 4.0. Le volume final recommandé pour chaque dilution de travail est de 5 ml. Dans chaque condition, vérifiez la concentration de protéines à l'aide d'un jeu colorimétrique protéique.
- Placez plusieurs tubes de centrifugeure conique vides de 1,5 ml (un pour chaque dilution en fonctionnement), des tubes MEM 10x, une solution de bicarbonate de sodium de 7,5 % et différentes dilutions de collagène sur glace. Attendez que ceux-ci soient refroidis.
- Ajouter 40-50 'L de 10x MEM à un tube froid (4 oC) de centrifugeuse. Ensuite, mélangez-le délicatement avec une solution de bicarbonate de sodium de 7 à 8 l l.
- Ajouter 310-330 L de l'une des différentes dilutions de collagène à ce tube et mélanger délicatement avec la pipette en évitant toute formation de bulles. Conserver le mélange de bicarbonate de collagène-MEM-sodium sur la glace (4 oC) pendant au moins 5 min.
- Pipette 10-25 l du mélange dans un plat Petri de 35 mm.
- Placer le plat Petri dans l'incubateur CO2 fixé à 37 oC jusqu'à ce que la gelation de l'hydrogel (de 15 à 20 min) soit observée.
- Répétez les étapes 1.12.3-1.12.6 pour les dilutions restantes de collagène dans différents plats de Petri.
- Sélectionnez la dilution de travail de collagène qui donne les meilleurs résultats.
REMARQUE: Le meilleur hydrogel gélifié doit avoir une texture translucide uniforme, couleur grise et ne doit pas être grumeleux ou filandreuse. D'après notre expérience, une dilution de 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) génère les meilleurs résultats expérimentaux.
2. Préparation des agrégats cellulaires (COS1) génétiquement modifiés pour sécrétiser une molécule candidate dans des hydrogels de collagène 3D
- Plaque 2 x 106 cellules COS1 dans un plat Petri de 35 mm et incuber avec un milieu de culture complet composé de 100 ml de D-MEM contenant 10 % (vol/vol) sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,5 % (wt/vol) glutamine et 1 % (wt/vol) Pen/Strep dans une culture cellulaire incubateur, afin d'atteindre 70-80% de confluence du jour au lendemain. Préparer un plat Petri pour chaque procédure de transfection.
-
Le jour suivant, transfect COS1 cellules avec l'ADN codant la molécule candidate (Netrin-1 ou Sema3E) en utilisant la méthode de transfection à base de liposome suivant les instructions du fabricant.
- Pour ce faire, mélanger 250 l de milieu sans sérum et de l'ADN (1-2 g par condition) à un tube de centrifugeuse de 1,5 ml (tube d'ADN) et mélanger. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min. Préparer un deuxième tube (tube liposomique) en ajoutant 240 ll du milieu sans sérum et 10 l du réactif de transfection liposomique. Incuber à RT pendant 5 min.
- Après l'incubation, ajouter le contenu du tube d'ADN au tube liposomique et mélanger délicatement. Maintenant, incuber à RT pendant 15 min. Remplacer le milieu sur les cellules cultivées avec 1,5 ml du milieu sans sérum et ajouter le mélange ADN-liposomes au plat Petri lentement goutte à goutte. Incuber pendant 3 h dans l'incubateur de culture cellulaire CO 2.
- Après 3 h d'incubation de transfection, remplacer le milieu par le milieu de culture complet et incuber toute la nuit dans l'incubateur.
- Le lendemain, rincez les cellules avec la saline tamponnée de phosphate de 0,1 M du dulbecco (D-PBS), traitez les cultures avec de la trypsine-EDTA (800 l par plat pendant 5 à 15 min dans l'incubateur CO 2) et collectez les cellules détachées avec 15 ml de milieu de culture complet.
- Centrifuger les cellules à 4 oC à 130 x g pendant 5 min. Après la centrifugation, retirer les supports et préserver les granulés contenant des cellules COS1 sur la glace.
- Répétez les étapes 1.12.3-1.12.6 pour préparer le mélange de travail de collagène.
- Ajouter 100-150 l du mélange de collagène à la pastille des cellules transfectées et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas et étendre 45-50 l de ce mélange sur un plat Petri (35 mm de diamètre) pour former une bande uniforme de collagène-cellules d'environ 1-1,5 cm de longueur. Placer le plat dans l'incubateur à 37 oC (5 % de CO2)jusqu'à ce que la gélation (de 15 à 20 min) soit observée.
- Préparer une deuxième bande contenant des cellules témoins (transfection fictive) dans un deuxième plat de culture et l'attacher dans l'incubateur (15-20 min) et lorsque la gélation est terminée ajouter 3-4 ml de chaud (37 oC) COS1 milieu de culture complète à chaque plat contenant le gélifié les bandes de collagène-cellules et les maintiennent dans l'incubateur de culture cellulaire de CO 2. Par la suite, couper les bandes de collagène-cellules pour générer de petites pièces carrées (400 à 500 m de longueur) à l'aide d'un scalpel fin ou d'un hachoir à tissu.
- Transférer toutes les sections de la même condition de transfection à un plat Petri contenant 3-3,5 ml de médias de culture neuronale (NCM) et vérifier sous un microscope de dissection la qualité des morceaux. Encore une fois, gardez-les dans l'incubateur de culture cellulaire CO 2.
REMARQUE: Le milieu de culture neuronale se compose du milieu neurobasal contenant 1-5% (vol/vol) sérum de cheval inactivé par la chaleur, 2 mM de glutamine, 0,5% (wt/vol) glucose, 1% (wt/vol) solution Pen-Strep et 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Assurez-vous que le pH se situe entre 7,2 et 7,3.
3. Génération d'Explantation embryonnaire pour la culture
- Stériliser les outils chirurgicaux (ciseaux, poignée de lame de scalpel, forceps droits et courbés) en autoclant en suivant les directives de stérilisation de routine. En parallèle, préparez 500 ml de tampon équilibré de sain-glucose et 4-5 plats Petri (100 mm de diamètre) contenant 10 ml de HBSS-G. Placer ces assiettes sur la glace (4 oC).
- Sacrifiez le rat femelle enceinte (jour embryonnaire 16.5) en dehors de la zone stérile, suivant les procédures éthiques approuvées. Couper les cornes d'embryon avec des ciseaux de la cavité abdominale et les placer dans un grand plat Petri contenant du HBSS-G froid.
- Placer le plat dans le capuchon à écoulement laminaire et extraire les embryons avec des forceps droites. Placez-les dans un nouveau plat contenant du HBSS-G froid. Ensuite, retirez la peau de l'embryon à l'aide de petits forceps et disséquez soigneusement le cerveau à l'aide des forceps incurvés et droits. Placez-les dans un plat contenant du HBSS-G froid.
- Sous un microscope à disséquer, couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane pour séparer les deux hémisphères avec le scalpel ou les ciseaux fins et enlever le diencephalon, les méninges et les vaisseaux sanguins des morceaux du cerveau avec des forceps fins.
- Répétez les étapes 3.3-3.4 avec le reste des embryons. Ne pas retarder la dissection de plus de 2 h pour préserver la qualité des tissus.
- Nettoyez toutes les parties de l'hélico tissulaire avec 100 % d'éthanol (en particulier la plaque de coupe en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et la lame de rasoir). Gardez l'hélico de tissu dans le capot de flux laminaire sous l'éclairage UV pendant 15 min.
- Transférer chaque morceau de tissu (p. ex., cortex avec hippocampe) à la plaque de coupe de l'hélico tissulaire. Pour l'hippocampe, placez-le perpendiculairement à la lame de rasoir et obtenez des sections de tissu de 450-500 m d'épaisseur.
- Préparer plusieurs plats Petri de 35 mm avec 3-4 ml de MR complet et transférer les morceaux de tissu de l'assiette d'hélico de tissu aux plats De Petri. De nombreux plats peuvent être nécessaires au fur et à mesure que les régions d'intérêt sont disséquées.
- Terminer la dissection tissulaire dans le MR complet à l'aide d'aiguilles de tungstène fines. Vérifiez la qualité des tranches obtenues sous le microscope disséquant. Assurez-vous que les couches sont clairement identifiables dans l'optique du champ foncé et disséquez la région d'intérêt (p. ex., région CA de l'hippocampe) avec des aiguilles de tungstène. Jeter les tranches endommagées. Maintenir les explantations hippocampales dans le milieu MR complet dans l'incubateur co 2.
4. Préparation des co-cultures 3D à Collagen Hydrogels
- Placez plusieurs plaques stériles de culture à 4 puits dans le capuchon à flux laminaire et préparez un mélange de travail au collagène comme indiqué précédemment dans les étapes 1.12.2-1.12.6.
- Placer 15-20 l du mélange d'hydrogel dans le fond d'un puits pour produire une base circulaire de collagène. Répétez cette étape pour le reste des puits. Ne préparez pas plus de cinq plaques en même temps pour éviter l'évaporation liquide excessive de la base d'hydrogel.
- Gardez les plats dans l'incubateur jusqu'à ce que la gélation complète (15-20 min) soit observée et ne sortez les assiettes de l'incubateur que lorsque la gélation est terminée. Vérifiez la qualité du collagène gélifié.
- Transférer un petit morceau d'agrégat de cellules COS1 à l'' eau. Placez-le sur la base d'hydrogel et placez un morceau de tissu sur la même base avec une pipette près du morceau de cellules agrégées à une explante-taille.
- Préparer un nouveau mélange de collagène de travail sur la glace comme dans les étapes 1.12.2-1.12.6.
- Doucement pipette 15-20 L de ce nouveau mélange et couvrir l'explantation et l'agrégat cellulaire. Une culture d'hydrogel en sandwich sera observée. En ce moment, réorienter l'explantation avec une aiguille de tungstène fine (ne touchez pas l'agrégat cellulaire COS1!), de sorte qu'il fait face à l'agrégat cellulaire à 500-600 m.
- Remettre la plaque à l'incubateur jusqu'à ce que la gélation soit observée (de 10 à 15 min) et 0,5 ml de MR complet complété par un supplément de 2 % de B27 et conserver les cultures pendant 36 à 48 h dans l'incubateur (37 oC, 5 % DE CO2).
5. Fixation des co-cultures d'agrégats d'explantation-cellule et procédure immunocytochimique
- Après 36-48 h d'incubation, retirer le milieu et rincer avec 0,1 M de phosphate tamponné salin (PBS), pH 7.3. Par la suite, fixer les cultures pour 1 h avec 4% de paraformaldéhyde dans 0,1 M tampon de phosphate (PB), pH 7,3, à 4 oC.
- Retirez le fixatif et rincez doucement les cultures 3-4 fois (10-15 min chacune) dans 0.1 M PB, pH 7.3.
- Détachez le sandwich à l'hydrogel du fond du puits à l'adresse spatule ou aux forceps. Transférer le bloc de collagène à l'aide d'un pinceau fin sur une plaque de culture de 6 puits contenant 0,1 M de PBS avec 0,5 % de détergent non ionique.
- Incuber les hydrogels flottants dans la solution de blocage (10% de sérum, 0,5% de surfactant non ionique, et 0,2% de gélatine dans 0,1 M PBS) pendant 2-3 h à RT avec une agitation douce.
- Rincer 3 fois (10-15 min chacun) avec 0,1 M PBS contenant 0,5% de surfactant non ionique.
- Incuber avec un anticorps primaire dilué dans le PBS contenant 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique, 0,2 % de gélatine et 0,02 % d'azide de sodium. Incuber avec l'anticorps primaire de 36 à 48 h à 4 oC sur un shaker.
REMARQUE: Habituellement, un anticorps contre la classe III - tubulin (-TUJ-1) (dilué 1:2,000) est utilisé pour définir la croissance axonale dans les cultures d'hydrogel 3D. - Après l'incubation, rincer comme à l'étape 5.5.
- Incuber avec un anticorps secondaire pendant 4 h à RT (ou 6-7 h à 4 oC) sur un shaker dilué dans 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique et 0,2 % de gélatine. Un anticorps biotinylated anti-souris (dilué 1:200) est utilisé dans cette expérience.
- Rincer les cultures comme dans 5.5.
- Incuber les cultures pendant 2 jours à 4 oC avec une solution de complexe avidin-biotine (ABC) 1:100 diluée en PBS contenant 5 % de sérum, 0,5 % de surfactant non ionique et 0,2 % de gélatine. Vous pouvez également utiliser de la streptavidtine étiquetée au raifort peroxidase (1:300-400) dans le même tampon.
- Rincer les cultures telles que décrites dans 5.5.
- Rincer les cultures plusieurs fois avec 0,1 M Tris-HCl tampon, pH 7,6 pour 1 h.
- Incuber les cultures avec 0,03% de 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochlorure (DAB) solution dans 0.1 M Tris-HCl, pH 7.6.
- Ajouter 5-8 'L de 1% H2O2 et attendre 10-15 min. Surveiller le développement de DAB sous un microscope en utilisant un objectif 4-10x.
- Arrêtez la réaction en supprimant la solution DAB avec 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.6.
- Rincer les cultures en PBS pendant 30 min (plusieurs changements).
- Montez les hydrogels sur des lames de verre à l'aide de supports de montage à base d'aqueuse.
- Analyser la longueur et la distribution des axones à l'intérieur de l'hydrogel à l'aide de l'analyse Sholl plug-in ou avec NeuriteJ plug-in pour le logiciel ImageJ30.
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Representative Results
Ici, nous présentons une méthodologie largement accessible pour étudier la croissance axonale dans les cultures 3-D de collagène d'hydrogel du système nerveux embryonnaire de souris. À cette fin, nous avons isolé le collagène des queues de rat adultes pour produire des matrices 3D dans lesquelles nous avons cultivé des agrégats de cellules génétiquement modifiés exprimant Netrin-1 ou Sema3E confrontés au tissu neuronal embryonnaire (par exemple, région CA de l'hippocampe). Ces agrégats cellulaires ont formé un gradient radialement distribué de la molécule candidate à l'intérieur de la matrice de collagène. Enfin, pour évaluer la réponse neuronale à différentes molécules, nous avons étiqueté les cultures à l'aide de méthodes immunocytochimiques (p. ex., -TUJ-1) et en appliquant une méthode de quantification simple et facile, nous avons obtenu suffisamment de données pour déterminer l'effet du putatif candidat sur le comportement axonal.
Dans notre expérience, lorsque les axones hippocampiques ont été confrontés à Netrin-1, ces axones se sont développés de préférence vers la source de Netrin-1 qui indique que Netrin-1 agit comme une molécule chimioattractive pour ces axones (Figure 1B). En revanche, lorsque les axones hippocampal où confrontés à Sema3E-sécrétion des cellules, la plupart d'entre eux se sont développés en face de l'agrégat cellulaire indiquant que Sema3E est une molécule chémorepulsive pour eux (Figure 1C). Dans l'état de commande (transfection fictive), tous les axones poussaient radialement sans aucune préférence directionnelle (Figure 1A). Figure 1 D-E sont des représentations schématiques de la réponse axonale et de la méthode de quantification. Après l'acquisition d'images, nous avons tracé une ligne au milieu de l'explante qui a délimité les quadrants proximal (proche de l'agrégat cellulaire) et les quadrants distal (opposés à l'agrégat cellulaire) afin de calculer le rapport proximal/distal (rapport P/D). Dans des conditions de contrôle, les axones étaient répartis également dans les deux quadrants (excroissance radiale) qui indiquaient un ratio P/D - 1 (Figure 1D). Lorsque les explants ont montré un nombre accru d'axones dans le quadrant proximal par rapport au distal (indiquant la chimioattraction), le ratio était P/D 'gt; 1 (Figure 1E) et lorsque le nombre d'axones était plus élevé dans le quadrant distal que dans le proximal (indiquant chemorepulsion) le rapport était P/D 'lt; 1 (Figure 1F).
Afin d'obtenir d'excellents résultats avec cette technique, nous devons nous assurer que la polymérisation du collagène est homogène, la transfection cellulaire est efficace, et la distance entre l'explantation de tissu et l'agrégat cellulaire est appropriée (voir Discussion).
En conclusion, nous pouvons confirmer que la génération d'hydrogels à base de collagène 3D est une technique utile afin d'évaluer la croissance axonale et les réponses comportementales aux molécules d'orientation des candidats qui peuvent jouer des rôles essentiels dans la migration axonale pendant développement du système nerveux.
Figure 1 : Exemples d'explantes poussant dans des hydrogels 3D dansdes expériences de confrontation et des méthodes de quantification. (A-C) Des explants ont été obtenus de la région hippocampal à E14.5, cultivés pendant 48 h in vitro, et étiquetés avec 'III-tubulin ('TUJ-1) par immunostaining. Des différences dans la croissance axonale peuvent être observées visuellement. S'il vous plaît comparer (A) avec (B-C). (D-E) Représentations schématiques de la réponse axonale et de la méthode de quantification. La ligne pointillée délimite à la fois le quadrant proximal (P) et le quadrant distal (D) afin de calculer le ratio P/D. Ratio P/D 1 représente un modèle radial de croissance (D); P /D 'gt; 1 indique une réponse chemoattractive (E), et P / D lt; 1 indique un effet chémorepulsive (F). Abréviations: CA - CA1-3 régions hippocampales; D - quadrant distal; Quadrant proximal P. Barres d'échelle de 200 m (A-C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La croissance des axones en développement est principalement invasive et comprend la dégradation et le remodelage de l'ECM. En utilisant la procédure présentée ici, les chercheurs peuvent obtenir une matrice 3D homogène formée par le collagène naturel de type I dans lequel les axones (ou cellules) peuvent répondre à un gradient chimique sécrété par des cellules génétiquement modifiées comme ils le font in vivo. Différentes réponses axonales aux gradients de repères attrayants ou inhibiteurs (protéines, lipides, etc.) peuvent être facilement comparées à un contrôle spécifique (cellules transfectées fictives). Comme avantages, nous devons mentionner que les tendons sont faciles à isoler et en effet ils peuvent être des restes d'expérimentation animale. En outre, les tendons sont très collagène je concentré par rapport à d'autres tissus tels que la peau ou le poumon31.
Bien que la méthodologie présentée ici soit simple à réaliser, certaines étapes nécessitent une attention particulière au cours du processus. En ce qui concerne l'extraction du collagène, il est impératif d'enlever les vaisseaux sanguins indésirables et les débris de la peau des tendons de la queue afin d'améliorer la pureté du collagène et la qualité de la gélation. En outre, il est obligatoire de maintenir des conditions stériles en effectuant quelques étapes sous une hotte stérile de flux laminaire et en stérilisant les outils chirurgicaux avant utilisation. En outre, il est important de maintenir le pH approprié et les conditions de température des solutions. Par exemple, si les solutions MEM 10x et bicarbonate ne sont pas optimales, la matrice de collagène ne polymérisera pas de façon homogène, et par conséquent, la croissance et le résultat axonaux seront affectés négativement. De plus, si la solution de stock de collagène est trop concentrée ou trop diluée, les matrices ne se régeleront pas correctement. D'après notre expérience, la meilleure concentration de stock de collagène est d'environ 5-5,5 mg/mL de protéines (quantifiées par un kit d'analyse de protéines coloriables) et nous utilisons une dilution 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) pour obtenir des matrices hydrogel parfaites. En ce qui concerne la transfection cellulaire et la formation d'agrégats cellulaires, il est important de maintenir des conditions stériles et d'éviter une contamination possible, par exemple, la purification des vecteurs plasmides avec des kits de purification de l'ADN plasmide sans endotoxine est obligatoire. En outre, nous devons souligner que les conditions de transfection varient selon le type de cellule, le nombre de passage, et les caractéristiques de plasmide. Ici, nous avons signalé les conditions optimales et de routine dans nos mains. Par conséquent, les chercheurs devraient tester les concentrations recommandées indiquées par le fabricant ou les ajuster pour déterminer leurs propres conditions optimales.
En ce qui concerne les problèmes qui peuvent survenir avec cette technique, nous devons considérer que parfois les matrices 3D ne présentent pas la structure homogène attendue de gel-like. Dans ce cas, il est important de vérifier la température et l'état du pH des solutions et de les jeter au cas où elles sont incorrectes. En outre, il est recommandé d'effectuer un test de contrôle de la qualité comme la dénaturation de l'électrophoresis de gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) dans des conditions de réduction pour valider la pureté de la préparation du stock de collagène. Avec cette approche, le collagène pur et intact de type I montre un modèle de migration typique composé de 2 chaînes monomeric (1 et 2), 3 chaînes dimériques (11, 12, variante 11), et 1 chaîne trimeric32,33. Si le collagène obtenu ne correspond pas à ce modèle, il ne doit pas être utilisé. Enfin, après immunostaining, les axones peuvent apparaître radialement distribués lorsqu'ils sont confrontés à des cellules sécrétant une molécule chémorepulsive ou chimioattractive. Dans cette situation, l'efficacité de la transfection doit être vérifiée en effectuant une technique de ballonnement de points sur le bon système de co-culture (si les plasmides d'ADN sont alcalins phosphatase-marqué) ou en traitant les médias de culture après transfection par l'ouest Buvard. Une limitation à considérer est que la distance entre l'agrégat cellulaire et l'explantation de tissu est cruciale. S'ils sont très éloignés les uns des autres, nous ne pourrons pas voir d'effet clair de la molécule sécrétée sur l'explantation tissulaire, mais s'ils sont très proches les uns des autres, l'effet sera trop fort pour être considéré comme un bon résultat. D'après notre expérience, la distance appropriée est d'environ une explante de taille (400-500 m) parce que le gradient moléculaire généré par l'agrégat cellulaire s'étendra radialement à partir de 400-500 m après 24 h en culture.
Alternativement, on peut employer l'extrait commercial tumeur-dérivé d'ECM au lieu du collagène de queue de rat. Dans ce cas, toutes les procédures doivent être effectuées entre 4 et 10 oC, puisque la gélation de l'extrait commercial d'ECM dépend de la température. Ainsi, un soin particulier devrait être pris pour s'assurer que tous les plats de culture, les conseils de pipette, les médias de culture, et les solutions sont maintenus à 4 oC.
Enfin, bien que la méthode présentée ici soit principalement associée à l'analyse des fonctions neuronales telles que la croissance axonale ou la migration neuronale, elle devient également une technique utile pour le criblage pharmacologique, les analyses d'adhérence, la fibrillation in vitro d'expériences et de stratégies d'ingénierie tissulaire34,35,36.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Tom Yohannan pour les conseils éditoriaux et M. Segura-Feliu pour l'assistance technique. Ces travaux ont été financés par le programme CERCA et par la Commission des universités et de la recherche du Département de l'innovation, des universités et de l'entreprise de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Ces travaux ont été financés par le Ministère espagnol de la recherche, de l'innovation et de l'université (MEICO) par l'intermédiaire de BFU2015-67777-R et RTI2018-099773-B-100, le Réseau Prion espagnol (Prionet Espagne AGL2017-90665-REDT), et l'Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
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