Summary
Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.
Abstract
Dit protocol maakt gebruik van natuurlijke type I collageen te genereren drie-dimensionale (3-D) hydrogel voor het toezicht op en het analyseren van de axonale groei. Het protocol is gecentreerd op kweken kleine stukjes van de embryonale of vroege postnatale knaagdieren hersenen in een 3-D hydrogel gevormd door de rat staart pees-afgeleide type I collageen met specifieke porositeit. Weefsel stukken worden gekweekt in de hydrogel en geconfronteerd met specifieke hersen fragmenten of genetisch gemodificeerde cel aggregaten te produceren en afscheiden moleculen geschikt voor het creëren van een gradiënt in de poreuze matrix. De stappen van dit protocol zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar omvatten kritische stappen om zorgvuldig te worden overwogen tijdens de ontwikkeling ervan. Bovendien kan het gedrag van de groeiende axonen direct worden gecontroleerd en geanalyseerd met behulp van een phase-contrast Microscoop of mono/multi foton fluorescentiemicroscoop na fixatie door immunocytochemische methoden.
Introduction
Neuronale axonen, eindigend in axonale groei kegels, migreren lange afstanden door de extracellulaire matrix (ECM) van het embryo over specifieke wegen om hun juiste doelen te bereiken. De groei kegel is het distale gedeelte van Axon en het is gespecialiseerd om het fysieke en moleculaire milieu van cel te voelen1,2. Vanuit moleculair oogpunt, worden de groei kegels geleid door minstens vier verschillende moleculaire mechanismen: de aantrekkelijkheid van het contact, chemoattraction, de weerzin van het contact, en chemorepulsion veroorzaakt door verschillende axonale begeleidings cues3,4 , 5 , 6. contact-gemedieerde processen kunnen gedeeltelijk worden bewaakt in twee-dimensionale (2D) culturen op micro-patroon substraten (bijv. met strepen7,8 of spots9 met de moleculen). Nochtans, kunnen axons aan hun doel in een niet-Diffusive manier navigeren door verscheidene aantrekkelijke en weerzinwekkende molecules van guidepost cellen in het milieu4,5,10te ontdekken. Hier beschrijven we een eenvoudige methode van 3-D cultuur om te controleren of een afgescheiden molecuul induceert chemorepulsive of chemoattractive effecten op de ontwikkeling van axonen.
De vroegste studies gericht op het bepalen van de effecten van Axon begeleiding cues gebruikt explant culturen in drie-dimensionale (3-D) matrices te genereren gradiënten simuleren in vivo voorwaarden11,12. Deze aanpak, samen met in vivo experimenten, toegestaan voor de identificatie van vier grote families van oriëntatie cues: netrinse, spleten, semaphorins, en Ephrins4,5,6. Deze moleculaire cues en andere factoren13 zijn geïntegreerd door de groeiende axonen, triggering de dynamiek van adhesie complexen en transducing mechanische krachten via de cytoskelet14,15,16. Voor het genereren van moleculaire gradiënten in 3-D culturen voor axonale navigatie, baanbrekende onderzoekers gebruikt plasma stolsel substraten17, die ook werd gebruikt voor organotypic slice preparaten18. Nochtans, in 1958, werd een nieuw protocol om 3-D collageen hydrogels te produceren gerapporteerd voor het bestuderen met Maximow ´ s apparaten19, een cultuur platform, dat in verscheidene studies geschikt voor microscopische observaties20wordt gebruikt. Een andere pionier studie rapporteerde collageen gel als hulpmiddel om menselijke fibroblasten in te bedden voor het bestuderen van de differentiatie van fibroblasten in myofibroblasten in wond helende processen21. Parallel, Lumsden en Davies paste collageen van de boviene dermis toe om het vermeende effect van de factor van de zenuwgroei (NGF) op het begeleiden van sensorische zenuwvezels te analyseren22. Met de ontwikkeling van nieuwe cultuur platforms (b.v., multi-well platen) door verschillende bedrijven en laboratoria, werden de collageen culturen aangepast aan deze nieuwe apparaten6,23,24,25 ,26. Parallel, werd een uittreksel van ECM materiaal dat uit de Engelbreth-Holm-zwerm tumor cel lijn wordt afgeleid gemaakt commercieel beschikbaar om deze studies uit te breiden27.
Onlangs, zijn verscheidene protocollen ontwikkeld om moleculaire gradiënten met vermeende rollen in axon begeleiding te produceren gebruikend 3-D hydrogels (b.v., collageen, fibrine, enz.) 28. als alternatief kan de kandidaat-molecuul worden gemobiliseerd op verschillende concentratie in een poreuze matrix (BIJV. NGF29) of gegenereerd door kweken in een klein gebied van de 3-D hydrogel cel aggregaten afscheiden van het molecuul om een radiale genereren gradiënt4,23,24,25,26. De laatste mogelijkheid zal worden toegelicht in dit protocol.
De hier gepresenteerde procedure is een eenvoudige, snelle en zeer reproduceerbare methode gebaseerd op de analyse van de axonale groei in 3-D hydrogel culturen van de embryonale muis hersenen. In vergelijking met andere methoden, is het protocol zeer geschikt voor niet-opgeleide onderzoekers en kan volledig worden ontwikkeld na een korte opleiding (1-2 weken). In dit protocol, isoleren we eerst collageen van volwassen rat staarten om verder te genereren 3-D matrices waarin genetisch gemodificeerde cel aggregaten worden gekweekt in de voorkant van de embryonale neuronale weefsel. Deze cel aggregaten vorm radiale chemische gradiënten van een kandidaat-molecuul dat een reactie voor de groeiende axonen ontlokt. Ten slotte kan de evaluatie van de effecten van het molecuul op de groeiende axonen gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van een fasecontrast microscopie of, alternatief, immunocytochemische methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de richtlijnen en protocollen van de ethische commissie voor dierproeven (CEEA) van de Universiteit van Barcelona, en het protocol voor het gebruik van knaagdieren in deze studie werd herzien en goedgekeurd door de CEEA van de Universiteit van Barcelona (CEEA goedkeuring #276/16 en 141/15).
1. reiniging van de rat staart collageen
- Verzamel volwassen Sprague-Delombaerde rat staarten (8-9 weken oud) na het offeren van het dier na ethische richtlijnen en spoel in 95% ethanol. Plaats 2-4 staarten op ijs (4 °C) en houd ze bedekt met ijs tijdens het proces.
- Voor het verkrijgen van de staart pezen, bevestig de staart op de meest caudale wervels van de staart met behulp van een hemostaat en comprimeren van de staart met een tweede hemostaat geplaatst rond 5-7 mm van de eerste. Breek de staart door het draaien van het scherp met beide hemostats. Om dit te doen, vouwen/ontvouwen de wervels meerdere malen totdat het breekt.
- Trek de wervels langzaam met de hemostaat om de pezen los te koppelen van hun mantel als het naar buiten komt. Op dit moment, gesneden pezen met een kleine schaar. Houd deze pees stukken in een steriele 100 mm Petri schaaltje op ijs.
- Herhaal de klemmen en glijden voor de rest van de staart tot de pezen zijn volledig geëxtraheerd.
- Herhaal stappen 1.2-1.4 voor alle verkregen staarten.
- Observeer de pezen onder een microscoop. Gooi de bloedvaten door te snijden met kleine scharen en holding met rechte fijne tang om de pees zuiverheid te verbeteren en spoel de pezen 3 keer met ultrapuur water.
- Verzamel 3-4 g natte pezen. Los de pezen op in 150 mL van 3% glaciale azijnzuur bij 4 °C in een 200-250 mL glas kegel kolf voor 24-36 h, onder zacht roeren.
- Centrifugeer bij 20.000 x g voor 1 h. In parallel, de voorbereiding van de dialyse slang membraan door het snijden van een stuk van ongeveer 10-15 cm in lengte en kook het in ultrapuur water met 1 mM ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) voor 15 min. Daarna voorzichtig spoelen het dialyse membraan grondig met ultrapuur water.
- Na centrifugeren, verzamelen de bovendrijvende in de dialyse buis membraan door decantatie. De pellet bevat zure onoplosbare materiaal (niet-collagene eiwitten) en de bovendrijvende bevat oplosbare collageen eiwitten.
- Dialyze de bovendrijvende tegen 2 L steriel 0,1 x minimale essentiële medium Eagle (MEM), pH 4,0 in een 2-5 L glazen beker. Dialyze voor 3 dagen. Verandering 0,1 x MEM oplossing ten minste tweemaal per dag het controleren van de pH bij elke verandering voor gebruik. Als pH is geworden Basic, wijzigen met een paar druppels van 0,1 M azijnzuur tot pH is 4,0.
- Na dialyse, voeg antibiotica (1,5 mL van penicilline/streptomycine (pen-keelontsteking)) aan de dialyzed collageen oplossing. Maak 5 mL hoeveelheid van de collageen stockoplossing en bewaar deze bij 4 °C.
Opmerking: Vanaf dit punt moeten alle behandelingsprocedures onder steriele omstandigheden in een laminaire stromings kap worden uitgevoerd. -
Ga verder met de gelering test van de voor bereide collageen stockoplossing naar aanleiding van de volgende stappen.
- Aangezien de voorraad collageen is meestal te geconcentreerd, bereiden 3 werk verdunningen (75%, 50%, en 25% collageen oplossing) door verdunning van de voorraad in 0,1 x MEM, pH 4,0. Het uiteindelijke volume aanbevolen voor elke werkverdunning is 5 mL. In elke voorwaarde, Controleer de eiwitconcentratie gebruikend een eiwit colorimetrische assay.
- Plaats een aantal lege 1,5 mL kegel centrifuge buizen (een voor elke werkende verdunning), 10x MEM tubes, 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en verschillende werk verdunningen van collageen op ijs. Wacht tot deze worden gekoeld.
- Voeg 40-50 µ L van 10x MEM toe aan een koude (4 °C) centrifugebuis. Vervolgens Meng het zachtjes met 7-8 l van natriumbicarbonaat oplossing.
- Voeg 310-330 l van een van de verschillende collageen verdunningen toe aan deze buis en meng het voorzichtig met de pipet om de vorming van bubbels te vermijden. Houd het collageen-MEM-natriumbicarbonaat mengsel op ijs (4 °C) voor minstens 5 min.
- Pipetteer 10-25 l van het mengsel in een 35 mm Petri schaaltje.
- Plaats de Petri schaal in de CO2 incubator ingesteld op 37 °c tot de gelering van de hydrogel (± 15-20 min) wordt waargenomen.
- Herhaal de stappen 1.12.3-1.12.6 voor de resterende collageen verdunningen in verschillende Petri schalen.
- Selecteer de collageen werkverdunning die de beste resultaten oplevert.
Opmerking: De beste gegeleerde hydrogel moet een uniform doorschijnend textuur, grijze kleur en mag niet worden bubbel of stringy. In onze ervaring, een verdunning van 3:1 (collageen: 0.1 x MEM) genereert de beste experimentele resultaten.
2. voorbereiding van de cel (COS1) aggregaten genetisch gemodificeerd om een kandidaat-molecuul afscheiden in 3-D collageen hydrogels
- Plaat 2 x 106 COS1 cellen in een 35 mm Petri schalen en incubeer met complete kweekmedium, samengesteld uit 100 ml D-mem met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum, 0,5% (WT/vol) glutamine en 1% (WT/vol) pen/keelontsteking in een cel cultuur incubator, om te bereiken 70-80% confluentie 's nachts. Bereid een Petri schaaltje voor elke transfectie procedure.
-
De volgende dag transfect COS1 cellen met de DNA-codering van de kandidaat-molecule (Netrin-1 of Sema3E) met behulp van liposoom-gebaseerde transfectie methode volgens de instructies van de fabrikant.
- Om dit te doen, meng 250 µ L van serum-vrij middel en DNA (1-2 μg per voorwaarde) aan een 1,5 mL centrifugebuis (de buis van DNA) en mengeling. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 5 min. bereid een tweede buis (Liposomale buis) door toevoeging van 240 µ L van het serum vrije medium en 10 µ L van de liposomale transfectie reagens. Incubeer bij RT voor 5 min.
- Na incubatie, voeg de inhoud van de DNA-buis aan de liposomale buis en meng zachtjes. Nu Incubeer bij RT 15 min. Vervang het medium op de gekweekte cellen met 1,5 mL van het serum vrije medium en voeg het DNA-liposomen mengsel toe aan de Petri schaal langzaam dropwise. Incubeer voor 3 uur in de CO2 Cell kweek incubator.
- Na 3 h van transfectie incubatie, vervang het medium met de volledige cultuurmedium en broeden 's nachts in de incubator.
- Volgende dag, spoel de cellen met 0,1 M Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS), behandel culturen met trypsine-EDTA (800 µ L per schotel voor 5-15 min in de CO2 incubator) en het verzamelen van vrijstaande cellen met 15 ml van de volledige kweekmedium.
- Centrifugeer de cellen bij 4 °C bij 130 x g voor 5 min. Na centrifugeren, verwijder de media en het behoud van de pellet met COS1 cellen op het ijs.
- Herhaal stappen 1.12.3-1.12.6 om de collageen werkend mengsel voor te bereiden.
- Voeg 100-150 l van het collageen mengsel toe aan de pellet van de transfected cellen en meng zachtjes door op en neer te pipetteren en verspreid 45-50 µ L van dit mengsel op een Petri schaaltje (35 mm diameter) te vormen een uniforme band van collageen-cellen van ongeveer 1-1,5 cm in lengte. Plaats de schotel in de incubator bij 37 °C (5% CO2) tot de gelering (± 15-20 min) wordt waargenomen.
- Bereid een tweede strook met controlecellen (mock transfectie) in een tweede kweekschaal en plaat het in de incubator (± 15-20 min) en wanneer gelering is voltooid toe te voegen 3-4 mL van de opgewarmde (37 ° c) COS1 volledige kweekmedium aan elk gerecht met de gegeleerde collageen-cellen stroken en bewaar ze in de CO2 Cell kweek incubator. Daarna, snijd de collageen-cellen strips te genereren kleine vierkante stukjes (400 tot 500 µm in lengte) met behulp van een fijne scalpel of een tissue Chopper.
- Breng alle secties van dezelfde transfectie voorwaarde om een Petri schaaltje met 3-3,5 mL van neuronale cultuurmedia (NCM) en controleer onder een dissectie Microscoop de kwaliteit van de stukken. Nogmaals, houd ze in de CO2 Cell kweek incubator.
Opmerking: Neuronale cultuurmedium bestaat uit Neurobasal medium met 1-5% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd Horse serum, 2 mM glutamine, 0,5% (WT/vol) glucose, 1% (WT/vol) pen-keelontsteking oplossing en 0,044% (WT/vol) NaHCO3. Zorg ervoor dat de pH tussen 7.2-7.3 ligt.
3. generatie van embryonale explant voor cultuur
- Steriliseer de chirurgische hulpmiddelen (schaar, scalpel mes handvat, rechte en gebogen Tang) door autoclaaf volgende routine sterilisatie richtlijnen. Bereid tegelijkertijd 500 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank-glucose buffer en 4-5 Petri schalen (100 mm diameter) die 10 mL Peeters-G bevatten. Leg deze platen op ijs (4 °C).
- Offer de zwangere vrouwelijke rat (embryonale dag 16,5) buiten de steriele gebied, naar aanleiding van de goedgekeurde ethische procedures. Snijd het embryo hoorns met een schaar uit de buikholte en plaats deze in een grote Petri schaaltje met koude Peeters-G.
- Plaats de schotel in de laminaire stromings kap en haal de embryo's met rechte Tang. Plaats ze in een nieuw gerecht met koude Peeters-G. Vervolgens verwijdert u de huid van het embryo met behulp van kleine Tang en zorgvuldig ontleden de hersenen met behulp van de gebogen en rechte Tang. Plaats ze in een schotel met koude Peeters-G.
- Onder een ontleden Microscoop, snijd de hersenen in de helft langs de middellijn te scheiden zowel de halfronden met de scalpel of fijne schaar en verwijder de diencephalon, de meninges en bloedvaten uit de hersenen stukken met fijne Tang.
- Herhaal de stappen 3.3-3.4 met de rest van de embryo's. Stel de dissectie voor meer dan 2 uur niet uit om de kwaliteit van het weefsel te behouden.
- Reinig alle delen van het weefsel Chopper met 100% ethanol (met name de polytetrafluorethyleen (PTFE) snijplaat en het scheermesje). Houd het weefsel Chopper in de laminaire flux kap onder UV-verlichting voor 15 minuten.
- Breng elk weefsel stuk (b.v., schors met zeepaardje) aan de scherpe plaat van de weefsel Chopper over. Voor Hippocampus, plaats deze loodrecht op het scheermesje en het verkrijgen van weefsel delen van 450-500 µm in dikte.
- Bereid verscheidene 35 mm Petri schotels met 3-4 mL van volledige NCM en overdrachts weefsel stukken van de weefsel Chopper plaat aan de Petri schalen voor. Veel gerechten kunnen nodig zijn als regio's van belang zijn ontleed.
- Afwerking van het weefsel dissectie in de volledige NCM met behulp van fijne Tungsten naalden. Controleer de kwaliteit van de verkregen segmenten onder de ontleden Microscoop. Zorg ervoor dat de lagen duidelijk herkenbaar zijn in de Darkfield optiek en ontleden de regio van belang (bijv. CA regio van de hippocampus) met Tungsten naalden. Beschadigde segmenten verwijderen. Houd hippocampale Explants in complete NCM medium in de CO2 incubator.
4. voorbereiding van 3-D co-culturen in collageen hydrogels
- Plaats verschillende steriele 4-well cultuur platen in de laminaire stroom kap en bereid een collageen werkend mengsel zoals eerder aangegeven in stappen 1.12.2-1.12.6.
- Plaats 15-20 l van het hydrogel mengsel in de bodem van een put om een cirkelvormige collageen basis te produceren. Herhaal deze stap voor de rest van de putten. Bereid niet meer dan vijf platen op hetzelfde moment om overmatige vloeibare verdamping te voorkomen van de hydrogel basis.
- Houd de gerechten in de incubator tot de volledige gelering (± 15-20 min) wordt waargenomen en neem de platen uit de incubator alleen wanneer de gelering is voltooid. Controleer de kwaliteit van de gegeleerde collageen.
- Breng een klein stukje COS1 cel aggregaat met een pipet. Plaats het op de hydrogel basis en plaats een tissue stuk op dezelfde basis met een pipet dicht bij het stuk cellen aggregaat op een explant-formaat.
- Bereid een nieuw werkend collageen mengsel op ijs zoals in stappen 1.12.2-1.12.6.
- Pipet voorzichtig 15-20 l van dit nieuwe mengsel en bedek het explant en de cel aggregaat. Een sandwich-achtige hydrogel cultuur zal worden waargenomen. Op dit moment, re-oriënteren de explant met een fijne Tungsten naald (niet aanraken van de COS1 cel aggregaat!), zodat het geconfronteerd met de cel aggregaat op ± 500-600 μm.
- Breng de plaat terug naar de incubator tot de gelering wordt waargenomen (± 10-15 min), en 0,5 mL volledige NCM aangevuld met 2% B27 supplement en houd culturen voor 36 tot 48 h in de incubator (37 °C, 5% CO2).
5. fixatie van explant samenwerking en immunocytochemische procedure
- Na 36-48 h van incubatie, verwijder het medium en spoel met 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,3. Daarna, bevestig de culturen voor 1 h met 4% Paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,3, bij 4 °C.
- Verwijder de fixatief en voorzichtig spoelen van de culturen 3-4 keer (10-15 min elk) in 0,1 M PB, pH 7,3.
- Maak de hydrogel sandwich los van de bodem van de put met spatel of Tang. Breng het collageen blok met een fijne penseel naar een 6-well cultuur plaat met 0,1 M PBS met 0,5% niet-ionische wasmiddel.
- Incubeer vrij zwevende hydrogels in de blokkerende oplossing (10% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine in 0,1 M PBS) voor 2-3 h bij RT met zachte agitatie.
- Spoel 3 keer (10-15 min elk) met 0,1 M PBS met 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof.
- Incubeer met primair antilichaam verdund in PBS dat 5% serum bevat, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, 0,2% gelatine, en 0,02% natrium azide. Incubeer met het primaire antilichaam voor 36-48 h bij 4 °C op een shaker.
Opmerking: Gewoonlijk wordt een antilichaam tegen klasse III β-tubulin (α-TUJ-1) (verdund 1:2000) gebruikt om de axonale groei in 3-D hydrogel culturen te bepalen. - Na incubatie, spoelen als in stap 5,5.
- Incubeer met secundair antilichaam voor 4 h bij RT (of 6-7 h bij 4 °C) op een shaker verdund in 5% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine. Een paard anti-muis biotinylated antilichaam (verdunde 1:200) wordt gebruikt in dit experiment.
- Spoel culturen zoals in 5,5.
- Incubatie de culturen voor 2 dagen bij 4 °C met avidin-Biotine complex (ABC) oplossing 1:100 verdund in PBS met 5% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine. Als alternatief, gebruik mierikswortelperoxidase (HRP)-tagged streptavidin (verdund 1:300-400) in dezelfde buffer.
- Spoel culturen zoals beschreven in 5,5.
- Spoel de culturen meerdere malen met 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6 voor 1 uur.
- Incubeer de culturen met 0,03% van 3, 3 ′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (schar) oplossing in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Voeg 5-8 µ L van 1% H2O2 en wacht 10-15 min. monitor de ontwikkeling van DAB onder een microscoop met behulp van een 4-10x doelstelling.
- Stop de reactie door het verwijderen van DAB-oplossing met 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6.
- Spoel de culturen in PBS voor 30 min (verscheidene veranderingen).
- Monteer de hydrogels op glazen glijbanen met behulp van op water gebaseerde montage media.
- Analyseer de lengte en distributie van de axonen in de hydrogel met behulp van Sholl analyse plug-in of met NeuriteJ plug-in voor ImageJ software30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we een algemeen toegankelijke methodologie om de axonale groei in 3-D hydrogel collageen culturen van embryonale muis zenuwstelsel studie. Hiertoe isoleerden we collageen van volwassen rat staarten om 3-D matrices te genereren waarin we gekweekte genetisch gemodificeerde cel aggregaten uitdrukken Netrin-1 of Sema3E geconfronteerd met embryonale neuronale weefsel (bijv. CA regio van de hippocampus). Deze cel aggregaten vormden een radiaal verdeelde gradiënt van de kandidaat-molecule binnen de collageen matrix. Tot slot, om de neuronale reactie op verschillende moleculen te evalueren, labelden we de culturen met behulp van immunocytochemische methoden (bijv. α-TUJ-1) en door het toepassen van een eenvoudige en eenvoudige kwantificering methode, verkregen we voldoende gegevens om het effect van de vermeende te bepalen kandidaat op axonale gedrag.
In ons experiment, toen hippocampale axons werden geconfronteerd met Netrin-1, deze axonen groeide bij voorkeur naar de bron van Netrin-1, die aangeeft dat Netrin-1 fungeert als een chemoattractive molecuul voor deze axonen (Figuur 1B). In tegenstelling, wanneer hippocampale axons waar geconfronteerd met Sema3E-afscheidende cellen, de meesten van hen groeide tegenover de cel aggregaat waaruit blijkt dat Sema3E is een chemorepulsive molecuul voor hen (Figuur 1C). In de controle voorwaarde (mock transfectie), alle axonen groeide radiaal zonder enige directionele voorkeur (Figuur 1a). Figuur 1 D-E zijn schematische voorstellingen van de axonale respons en kwantificatie methode. Na beeld overname, trokken we een lijn in het midden van de explant die de proximale (dicht bij cel aggregaat) en de distale (tegengesteld aan de cel geaggregeerde) kwadranten afgebakend om de proximale/distale ratio (P/D ratio) te berekenen. In controle omstandigheden, werden axons eveneens verdeeld in beide kwadranten (radiale uitgroei) die een verhouding P/D = 1 (Figuur 1D) aanwees. Toen Explants gestegen aantal axons in het proximale Kwadrant in vergelijking met DISTAAL toonde (wijzend op chemoattraction) de verhouding was P/D > 1 (Figuur 1E) en toen het aantal axons hoger was in het distale Kwadrant dan in de proximaal één (wijzend op chemorepulsion) de verhouding was P/D < 1 (Figuur 1F).
Met het oog op uitstekende resultaten met deze techniek te bereiken, moeten we ervoor zorgen dat collageen polymerisatie is homogeen, cel transfectie is efficiënt, en de afstand tussen het weefsel explant en de cel aggregaat is geschikt (zie discussie).
Concluderend, kunnen we bevestigen dat de generatie van 3-D collageen-based hydrogels is een nuttige techniek om axonale groei en gedrag reacties op kandidaat-begeleidings moleculen die kunnen spelen essentiële rollen in de axonale migratie te evalueren tijdens ontwikkeling van het zenuwstelsel.
Figuur 1 : Voorbeelden van Explants groeit in 3-D hydrogels in confrontatie experimenten en kwantificatie methoden. (a-C) Explants werden verkregen uit de hippocampale regio op E 14.5, gekweekt voor 48 h in vitro, en gelabeld met βIII-tubulin (α-TUJ-1) door immunokleuring. De verschillen in de axonale groei kunnen visueel waargenomen worden. Gelieve te vergelijken (a) met (B-C). (D-E) Schematische voorstellingen van de axonale respons-en kwantificatie methode. Stippellijn begrenst zowel het proximale (P) als het distale (D) Kwadrant om de verhouding P/D te berekenen. ratio P/D = 1 staat voor een radiaal groeipatroon (d); P/D > 1 duidt op een chemoattractive respons (E), en p/d < 1 duidt op een chemorepulsive effect (F). Afkortingen: CA = CA1-3 hippocampale regio's; D = distale Kwadrant; P = proximaal Kwadrant. Schaal staven = 200 μm (A-C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De groei van het ontwikkelen van axonen is hoofdzakelijk invasief en omvat ECM degradatie en het remodelleren. Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, kunnen onderzoekers verkrijgen van een homogene 3-D matrix gevormd door de natuurlijke type I collageen waarin axonen (of cellen) kan reageren op een chemische gradiënt afgescheiden door genetisch gemodificeerde cellen zoals ze doen in vivo. Verschillende axonale reacties op gradiënten van aantrekkelijke of remmende cues (eiwitten, lipiden, enz.) kan gemakkelijk worden vergeleken met specifieke controle (mock transfected cellen). Als voordelen, moeten we vermelden dat pezen zijn gemakkelijk te isoleren en inderdaad kunnen ze overblijfselen van dierlijke experimenten. Bovendien, pezen zijn zeer collageen ik geconcentreerd in vergelijking met andere weefsels, zoals de huid of Long31.
Hoewel de hier voorgestelde methodologie eenvoudig is uit te voeren, zijn er sommige stappen die speciale aandacht tijdens het proces vergen. Met betrekking tot collageen extractie, is het noodzakelijk om ongewenste bloedvaten en de huidpuin te verwijderen uit de staart pezen om de zuiverheid van collageen en de kwaliteit van gelering te verbeteren. Ook is het verplicht om steriele omstandigheden te handhaven door het uitvoeren van een aantal stappen onder een steriele laminaire stroming kap en steriliseren van de chirurgische hulpmiddelen voor gebruik. Daarnaast is het belangrijk om de juiste pH en temperatuur voorwaarden van de oplossingen te handhaven. Bijvoorbeeld, als MEM 10x en bicarbonaat oplossingen niet optimaal zijn, zal de collageen matrix niet polymeriseren homogeen, en dus de axonale groei en het resultaat zal negatief worden beïnvloed. Bovendien, als de collageen voorraad oplossing is te geconcentreerd of te verdund, zal de matrices niet gel goed. In onze ervaring, de beste collageen voorraad concentratie is ongeveer 5-5.5 mg/mL eiwit (gekwantificeerd door een colorimetrische eiwit assay kit) en we gebruiken een 3:1 verdunning (collageen: 0.1 x MEM) om perfecte hydrogel matrices te verkrijgen. Betreffende cel transfectie en cel samenstellende vorming, is het belangrijk om steriele voorwaarden te handhaven en mogelijke verontreiniging te vermijden, bijvoorbeeld, het zuiveren van plasmide vectoren met endotoxine plasmide de reinigings uitrustingen van DNA is verplicht. Ook moeten we benadrukken dat de transfectie voorwaarden variëren, afhankelijk van de cel type, passage nummer, en de plasmide kenmerken. Hier hebben we gemeld de optimale en routinematige omstandigheden in onze handen. Daarom moeten onderzoekers de aanbevolen concentraties die door de fabrikant zijn aangegeven, testen of aanpassen om hun eigen optimale condities te bepalen.
Met betrekking tot de problemen die zich kunnen voordoen met deze techniek, moeten we bedenken dat soms de 3-D matrices niet de verwachte homogene gel-achtige structuur aanwezig zijn. In dit geval is het belangrijk om de temperatuur en pH-conditie van de oplossingen te controleren en ze te verwijderen voor het geval het onjuist is. Ook, wordt het geadviseerd om een kwaliteitscontrole test zoals het denatureren Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-pagina) uit te voeren onder het verminderen van voorwaarden om de zuiverheid van collageen voorraad voorbereiding te valideren. Met deze aanpak, puur en onbeschadigd type I collageen toont een typische migratiepatroon bestaande uit 2 monomeer α-ketens (Α1 en α2), 3 dimeer β ketens (β11, β12, variant β11), en 1 trimere γ keten32,33. Als het verkregen collageen niet past bij dit patroon, mag het niet worden gebruikt. Tenslotte, na immunokleuring, kunnen axonen radiaal verdeeld verschijnen wanneer ze geconfronteerd worden met cellen die een chemorepulsive of chemoattractive molecuul afscheiden. In deze situatie moet de efficiëntie van transfectie worden gecontroleerd door het uitvoeren van een dot bevlekken techniek op de juiste co-cultuursysteem (als de DNA-plasmiden zijn alkalisch fosfatase-Tagged) of door de verwerking van de cultuurmedia na transfectie door westerse Bevlekken. Een beperking te overwegen is dat de afstand tussen de cel aggregaat en weefsel explant is van cruciaal belang. Als ze heel ver uit elkaar, zullen we niet in staat zijn om een duidelijk effect van de afgescheiden molecule op het weefsel explant te zien, maar als ze heel dicht bij elkaar, het effect zal te sterk zijn om te worden beschouwd als een goed resultaat. Vanuit onze ervaring, de juiste afstand is ongeveer een explant-formaat (400-500 μm), omdat de moleculaire gradiënt gegenereerd door de cel aggregaat zal radiaal uit te breiden van langs 400-500 μm na 24 uur in de cultuur.
Als alternatief kan men gebruik maken van commerciële tumor-afgeleide ECM-extract in plaats van Rat staart collageen. In dat geval moeten alle procedures worden uitgevoerd tussen 4 en 10 °C, aangezien de gelering van het commerciële ECM-extract afhankelijk is van de temperatuur. Zo moet er speciale aandacht worden besteed aan alle cultuur gerechten, pipet tips, cultuurmedia, en oplossingen worden gehandhaafd op 4 ° c.
Ten slotte, hoewel de hier gepresenteerde methode is voornamelijk geassocieerd met de analyse van neuronale functies, zoals axonale groei of neuronale migratie, het wordt ook een nuttige techniek voor de farmacologische screening, adhesie assays, in vitro fibrillatie experimenten en de strategieën van de weefseltechniek34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Tom Padt voor de redactionele advies en M. Segura-Feliu voor de technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door het CERCA-programma en door de Commissie voor universiteiten en onderzoek van het departement innovatie, universiteiten en ondernemingen van de Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dit werk werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van onderzoek, innovatie en Universiteit (MEICO) door middel van BFU2015-67777-R en en RTI2018-099773-B-100, de Spaanse-netwerk (PRIONET Spanje AGL2017-90665-REDT), en het Instituut Carlos III, CIBERNED ( WRIKKEN-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
