Summary
Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.
Abstract
Este protocolo usa o tipo natural mim colagénio para gerar o hidrogel tridimensional (3-D) para monitorar e analisar o crescimento axonal. O protocolo está centrado na cultura de pequenos pedaços de cérebros de roedores embrionários ou precoces no interior de um hidrogel 3-D formado pelo colágeno do tipo I derivado do tendão da cauda de rato com porosidade específica. Peças de tecido são cultivadas dentro do hidrogel e confrontados com fragmentos cerebrais específicos ou agregados celulares geneticamente modificados para produzir e secretar moléculas adequadas para a criação de um gradiente dentro da matriz porosa. As etapas deste protocolo são simples e reprodutíveis mas incluem etapas críticas a ser consideradas com cuidado durante seu desenvolvimento. Além disso, o comportamento de axônios crescentes pode ser monitorado e analisado diretamente usando um microscópio de fase-contraste ou um microscópio de fluorescência mono/multifóton após a fixação por métodos Immunocytochemical.
Introduction
Axônios neuronais, terminando em cones de crescimento axonal, migram longas distâncias através da matriz extracelular (ECM) do embrião sobre caminhos específicos para atingir seus alvos adequados. O cone de crescimento é a porção distal do AXON e é especializado para sentir o ambiente físico e molecular da célula1,2. Do ponto de vista molecular, os cones de crescimento são guiados por pelo menos quatro mecanismos moleculares diferentes: atração de contato, quimioatração, repulsão de contato e chemorepulsion desencadeada por diferentes pistas de orientação axonal3,4 , 5. º , 6. os processos mediados por contato podem ser parcialmente monitorados em culturas bidimensionais (2D) em substratos micropadronizados (por exemplo, com listras7,8 ou manchas9 contendo as moléculas). No entanto, axônios podem navegar para o seu alvo de forma não-diffusiva, sentindo várias moléculas atraentes e repulsivas de células guidepost no ambiente4,5,10. Aqui, nós descrevemos um método fácil da cultura 3-D para verific se uma molécula secretado induz efeitos chemorepulsive ou chemoattractive em axônios tornando-se.
Os primeiros estudos objetivaram determinar os efeitos das pistas de orientação AXON utilizadas culturas explantes em matrizes tridimensionais (3-D) para gerar gradientes simulando in vivo as condições11,12. Essa abordagem, juntamente com experimentos in vivo, permitiu a identificação de quatro grandes famílias de pistas de orientação: netrins, fendas, semaphorinas e ephrins4,5,6. Essas pistas moleculares e outros fatores13 são integrados pelos crescentes axônios, desencadeando a dinâmica dos complexos de adesão e as forças mecânicas transacionadoras através do citoesqueleto14,15,16. Para gerar gradientes moleculares em culturas 3-D para navegação axonal, pesquisadores pioneiros usaram substratos de coágulo plasmático17, que também foi utilizado para preparações organotípicas de fatia18. No entanto, em 1958, foi relatado um novo protocolo para a geração de hidrogéis de colágeno 3-D para estudar com os dispositivos da Maximow19, uma plataforma de cultura, utilizada em vários estudos adequados para observações microscópicas20. Outro estudo pioneiro relatou o gel de colágeno como uma ferramenta para incorporar fibroblastos humanos para estudar a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos em processos de cicatrização de feridas21. Paralelamente, Lumsden e Davies aplicaram colágeno da derme bovina para analisar o efeito putativo do fator de crescimento do nervo (NGF) na orientação das fibras nervosas sensoriais22. Com o desenvolvimento de novas plataformas de cultura (por exemplo, placas multipoços) por diferentes empresas e laboratórios, as culturas colágenas foram adaptadas a esses novos dispositivos6,23,24,25 ,26. Paralelamente, um extrato de material de ECM derivado da linhagem de células tumorais de Engelbreth-Holm-Swarm foi disponibilizado comercialmente para ampliar esses estudos27.
Recentemente, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar gradientes moleculares com papéis putativos na orientação do AXON usando hidrogéis 3-D (por exemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, a molécula candidata pode ser imobilizada em diferentes concentrações em uma matriz porosa (por exemplo, NGF29) ou gerada pela cultura em uma pequena região dos agregados de células hidrogel 3-D secretando a molécula para gerar um radial gradiente4,23,24,25,26. A última possibilidade será explicada neste protocolo.
O procedimento apresentado aqui é um método fácil, rápido e altamente reprodutível baseado na análise do crescimento axonal em culturas 3-D do hidrogel do cérebro embrionário do rato. Em comparação com outros métodos, o protocolo é bem adequado para pesquisadores não treinados e pode ser totalmente desenvolvido após um treinamento curto (1-2 semanas). Neste protocolo, Nós isolamos primeiramente o colagénio das caudas adultas do rato para gerar mais matrizes 3-D em que os agregados genetically-modificados da pilha são cultivados na frente do tecido neuronal embrionário. Estes agregados de células formam gradientes químicos radiais de uma molécula candidata que provoca uma resposta para os axônios crescentes. Finalmente, a avaliação dos efeitos da molécula em axônios crescentes pode ser facilmente realizada usando uma microscopia de contraste de fase ou, alternativamente, métodos imunocitróxicos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados as diretrizes e protocolos do Comitê de ética para experimentação animal (CEEA) da Universidade de Barcelona, e o protocolo para o uso de roedores neste estudo foi revisado e aprovado pelo CEEA do Universidade de Barcelona (CEEA aprovação #276/16 e 141/15).
1. purificação do colagénio da cauda do rato
- Colete adultos Sprague-Dawley caudas de ratos (8-9 semanas de idade) depois de sacrificar o animal seguindo as orientações éticas e enxaguar em 95% etanol. Coloque 2-4 caudas no gelo (4 ° c) e mantenha-os cobertos com gelo durante o processo.
- Para obter tendões da cauda, fixar a cauda nas vértebras mais caudais da cauda usando um hemostato e comprimir a cauda com um segundo hemostato posicionado em torno de 5-7 mm a partir do primeiro. Quebre a cauda girando-a agudamente com ambos os hemostats. Para fazer isso, dobre/desdobrar as vértebras várias vezes até que ele quebre.
- Puxe as vértebras lentamente com o hemostato para separar os tendões de sua bainha como ele sai. Neste momento, corte os tendões com pequenas tesouras. Mantenha estas partes do tendão em um prato de Petri estéril de 100 milímetros no gelo.
- Repita a fixação e deslize para o resto da cauda até que os tendões são totalmente extraídos.
- Repita os passos 1.2-1.4 para todas as caudas obtidas.
- Observe os tendões um microscópio. Descarte os vasos sanguíneos cortando com pequenas tesouras e segurando com fórceps fino reto para melhorar a pureza do tendão e enxaguar os tendões 3 vezes com água ultrapura.
- Colete 3-4 g de tendões molhados. Dissolver os tendões em 150 mL de 3% de ácido acético glacial a 4 ° c em um balão cônico de vidro de 200-250 mL para 24-36 h, agitação suave.
- Centrifugador a 20.000 x g por 1 h. Em paralelo, prepare a membrana da tubagem de diálise cortando uma peça de cerca de 10-15 cm de comprimento e ferva-a em água ultrapura contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) durante 15 min. Em seguida, enxague suavemente a membrana de diálise cuidadosamente com água ultrapura.
- Após a centrifugação, recolher o sobrenadante na membrana da tubagem de diálise por decantação. A pelota contem o material insolúvel ácido (proteínas não-collagenous) e o sobrenadante contem proteínas solúveis do colagénio.
- Dialyze o sobrenadante contra 2 L de estéril 0,1 x mínimo essencial águia média (MEM), pH 4,0 em um copo de vidro de 2-5 L. Dialyze por 3 dias. Mude a solução de 0.1 x MEM pelo menos duas vezes por dia verificando o pH em cada mudança antes de usar. Se o pH se tornou básico, modifique-o com algumas gotas de ácido acético a 0,1 M até que o pH seja 4,0.
- Após a diálise, adicione antibióticos (1,5 mL de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) à solução de colágeno dialítico. Faça alíquotas de 5 mL da solução de colágeno e armazene a 4 ° c.
Nota: A partir deste ponto, todos os procedimentos de manuseio devem ser realizados condições estéreis em uma capa de fluxo laminar. -
Prossiga com o teste de gelação da solução de colágeno preparada seguindo os próximos passos.
- Uma vez que o colágeno de ações é geralmente muito concentrado, prepare 3 diluições de trabalho (75%, 50% e 25% de solução de colágeno), diluindo o estoque em 0,1 x MEM, pH 4,0. O volume final recomendado para cada diluição de trabalho é de 5 mL. Em cada condição, verifique a concentração proteica usando um ensaio colorimétrico protéico.
- Coloque vários tubos de centrifugação cônicos vazios de 1,5 mL (um para cada diluição de trabalho), tubos de 10x MEM, solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e diferentes diluições de trabalho de colágeno no gelo. Aguarde até que estes sejam arrefecidos.
- Adicionar 40-50 μL de 10x MEM a um tubo de centrifugação a frio (4 ° c). Em seguida, misture suavemente com 7-8 μL de solução de bicarbonato de sódio.
- Adicione 310-330 μL de uma das diferentes diluições de colágeno a este tubo e misture suavemente com a pipeta evitando qualquer formação de bolhas. Manter a mistura de bicarbonato de colágeno-MEM-sódio no gelo (4 ° c) durante pelo menos 5 min.
- Pipete 10-25 μL da mistura para um prato de Petri de 35 mm.
- Coloque a placa de Petri na incubadora CO2 definida a 37 ° c até que a geladura do hidrogel (± 15-20 min) seja observada.
- Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para as restantes diluições de colágeno em diferentes pratos de Petri.
- Selecione a diluição de trabalho do colagénio que rende os melhores resultados.
Nota: O melhor hidrogel gelificada deve ter uma textura translúcida uniforme, cor cinzenta e não deve ser irregular ou stringy. Em nossa experiência, uma diluição de 3:1 (colágeno: 0,1 x MEM) gera os melhores resultados experimentais.
2. preparação de agregados celulares (COS1) geneticamente modificados para secretar uma molécula candidata em hidrogéis de colágeno 3-D
- Placa 2 x 106 COS1 células em pratos de Petri de 35 mm e incubar com meio de cultura completo composto por 100 ml de D-mem contendo 10% (Vol/Vol) de soro bovino fetal inativado por calor, 0,5% (WT/vol) de glutamina e 1% (WT/vol) Pen/Strep em uma cultura celular incubadora, a fim de atingir 70-80% de confluência durante a noite. Prepare um prato de Petri para cada procedimento do transfection.
-
O dia seguinte transfecção COS1 pilhas com o ADN que codifica a molécula do candidato (netrin-1 ou Sema3E) usando o método liposome-baseado do transfection que segue as instruções do fabricante.
- Para fazer isso, misture 250 μL de meio livre de soro e DNA (1-2 μg por condição) para um tubo de centrifugação de 1,5 mL (tubo de DNA) e misture. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Prepare um segundo tubo (tubo lipossómico) adicionando 240 μL do meio livre de soro e 10 μL do reagente de transfecção lipossómica. Incubar em RT por 5 min.
- Após a incubação, adicione o conteúdo do tubo de DNA ao tubo lipossómico e misture suavemente. Agora incubar em RT por 15 min. Substitua o meio nas células cultivadas com 1,5 mL do meio livre de soro e adicione a mistura de DNA-lipossomas à placa de Petri lentamente Dropwise. Incubar por 3 h na incubadora da cultura da pilha do CO2 .
- Após 3 h de incubação do transfection, substitua o meio com o meio de cultura completo e incubar durante a noite na incubadora.
- No dia seguinte, enxágüe as células com 0,1 M Dulbecco ' s fosfato salina tamponado (D-PBS), tratar culturas com Trypsin-EDTA (800 μL por cada prato para 5-15 min na incubadora de CO2 ) e recolher células destacadas com 15 ml de meio de cultura completo.
- Centrifugar as células a 4 ° c a 130 x g durante 5 min. Após a centrifugação, remova a mídia e preserve a pelota contendo COS1 células no gelo.
- Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para preparar a mistura de trabalho de colágeno.
- Adicionar 100-150 μL da mistura de colagénio à pelota das células transfectadas e misturar suavemente introduzindo e descendo e distribuindo 45-50 μL desta mistura numa placa de Petri (35 mm de diâmetro) para formar uma faixa uniforme de células colágenas de cerca de 1 a 1,5 cm de comprimento. Coloque o prato na incubadora a 37 ° c (5% CO2) até que a Geladura (± 15-20 min) seja observada.
- Prepare uma segunda tira contendo células de controle (transfection mock) em um segundo prato de cultura e placa-lo na incubadora (± 15-20 min) e quando a geladura é concluída adicionar 3-4 ml de aquecido (37 ° c) COS1 completo meio de cultura para cada prato contendo o gelificada as tiras das colagénio-pilhas e mantêm-nas na incubadora da cultura da pilha do CO2 . Depois disso, corte as tiras de células colágenas para gerar pequenas peças quadradas (400 a 500 μm de comprimento) usando um bisturi fino ou um helicóptero de tecido.
- Transfira todas as seções da mesma condição do transfection a um prato de Petri que contem 3-3.5 mL de meios de cultura neuronal (NCM) e verific um microscópio da dissecção a qualidade das partes. Mais uma vez, mantê-los na incubadora de cultura de células CO2 .
Nota: O meio de cultura neuronal consiste em meio Neurobasal contendo 1-5% (Vol/Vol) de soro de cavalo inativado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (WT/vol) de glicose, 1% (WT/vol) solução Pen-Strep e 0, 44% (WT/vol) NaHCO3. Assegure-se de que o pH esteja entre 7.2-7.3.
3. geração de explante embrionário para a cultura
- Esterilize as ferramentas cirúrgicas (tesouras, punho da lâmina do bisturi, fórceps reto e curvado) por autoclavagem depois das directrizes rotineiras da esterilização. Em paralelo, prepare 500 mL de solução equilibrada de sal de Hank-tampão de glicose e 4-5 pratos de Petri (100 mm de diâmetro) contendo 10 mL de HBSS-G. Coloque estas placas no gelo (4 ° c).
- Sacrifique o rato fêmea grávido (dia Embryonic 16,5) fora da área estéril, seguindo os procedimentos éticos aprovados. Corte os chifres do embrião com a tesoura da cavidade abdominal e coloc o em um grande prato de Petri que contem o HBSS-G frio.
- Coloque o prato na capa de fluxo laminar e extraia os embriões com fórceps reto. Coloque-os em um novo prato contendo HBSS-G frio. Em seguida, retire a pele do embrião usando fórceps pequeno e cuidadosamente dissecar o cérebro usando o fórceps curvo e reto. Coloque-os em um prato contendo HBSS-G frio.
- um microscópio dissecando, corte o cérebro ao meio ao longo da linha média para separar ambos os hemisférios com o bisturi ou a tesoura fina e remova o diencephalon, as meninges e os vasos sanguíneos das partes do cérebro com fórceps fino.
- Repita os passos 3.3-3.4 com o resto dos embriões. Não atrasar a dissecção por mais de 2 h para preservar a qualidade do tecido.
- Limpe todas as partes do picador de tecido com 100% de etanol (especialmente a placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) e a lâmina de barbear). Mantenha o helicóptero do tecido na capa do fluxo laminar a iluminação UV por 15 minutos.
- Transfira cada peça de tecido (por exemplo, córtex com hipocampo) para a placa de corte do helicóptero do tecido. Para o hipocampo, coloque-o perpendicular à lâmina de barbear e obtenha secções de tecido de 450-500 μm de espessura.
- Prepare vários pratos de Petri de 35 mm com 3-4 mL de NCM completos e peças de tecido de transferência da placa de Chopper de tecido para os pratos de Petri. Muitos pratos podem ser necessários como regiões de interesse são dissecados.
- Termine a dissecção do tecido no NCM completo usando agulhas finas do tungstênio. Verifique a qualidade das fatias obtidas o microscópio de dissecação. Certifique-se de que as camadas são claramente identificáveis na óptica Darkfield e dissecar a região de interesse (por exemplo, região do CA do hipocampo) com agulhas de tungstênio. Descarte as fatias danificadas. Mantenha explantes do hipocampal no meio completo de NCM na incubadora do CO2 .
4. preparação de co-culturas 3-D em hidrogéis de colágeno
- Coloc diversas placas estéreis da cultura de 4 poços na capa do fluxo laminar e prepare uma mistura de trabalho do colagénio como indicada previamente nas etapas 1.12.2-1.12.6.
- Coloque 15-20 μL da mistura de hidrogel na parte inferior de um poço para produzir uma base de colágeno circular. Repita este passo para o resto dos poços. Não Prepare mais de cinco placas ao mesmo tempo para evitar a evaporação líquida excessiva da base do hidrogel.
- Mantenha os pratos na incubadora até que a gelação completa (± 15-20 min) seja observada e leve as placas para fora da incubadora somente quando a gelação estiver concluída. Verifique a qualidade do colágeno gelado.
- Transfira um pequeno pedaço de agregado celular COS1 com uma pipeta. Coloc o na base do hidrogel e coloc uma parte do tecido na mesma base com uma pipeta perto da parte de pilhas agregado em um explant-tamanho.
- Prepare uma nova mistura de colágeno de trabalho no gelo como nas etapas 1.12.2-1.12.6.
- Pipeta delicadamente 15-20 μL desta mistura nova e cubra o agregado do explante e da pilha. Um sanduíche-como A cultura do hidrogel será observado. Neste momento, re-orientar o explante com uma agulha de tungstênio multa (não toque no agregado celular COS1!), por isso enfrenta o agregado celular em ± 500-600 μm.
- Retorne a placa à incubadora até que a geladura esteja observada (± 10-15 min), e 0,5 mL do NCM completo suplementado com o suplemento de 2% B27 e mantenha culturas para 36 a 48 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2).
5. fixação das co-culturas agregadas do explant-Cell e do procedimento de Immunocytochemical
- Após 36-48 h de incubação, remover o meio e enxaguar com 0,1 M fosfato tampão salino (PBS), pH 7,3. Posteriormente, fixar as culturas por 1 h com paraformaldeído 4% em tampão fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 ° c.
- Retire o fixador e enxague suavemente as culturas 3-4 vezes (10-15 min cada) em 0,1 M PB, pH 7,3.
- Retire o sanduíche de hidrogel da parte inferior do poço com espátula ou pinça. Transfira o bloco de colágeno com um pincel fino para uma placa de cultura de 6 poços contendo 0,1 M de PBS com 0,5% de detergente não iônico.
- Incubar hidrogéis flutuantes livres na solução de bloqueio (10% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina em 0,1 M PBS) para 2-3 h em RT com agitação suave.
- Enxágüe 3 vezes (10-15 min cada) com 0,1 M PBS contendo 0,5% de surfactante não iônico.
- Incubar com anticorpo primário diluído em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico, 0,2% de gelatina e 0, 2% de azida sódica. Incubar com o anticorpo preliminar para 36-48 h em 4 ° c em um abanador.
Nota: Geralmente um anticorpo de encontro à classe III β-tubulin (α-Tuj-1) (diluído 1:2000) é usado para definir o crescimento axonal em culturas do hidrogel 3-D. - Após a incubação, enxague como na etapa 5,5.
- Incubar com anticorpo secundário para 4 h em RT (ou 6-7 h a 4 ° c) em um Shaker diluído em 5% soro, 0,5% surfactante não-iônico, e 0,2% gelatina. Um anticorpo biotinylated do anti-rato do cavalo (1:200 diluído) é usado neste experimento.
- Enxágüe culturas como em 5,5.
- Incubar as culturas durante 2 dias a 4 ° c com solução de complexo avidina-biotina (ABC) 1:100 diluída em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina. Alternativamente, use a peroxidase de rábano (HRP)-Tagged estreptavidina (diluído 1:300-400) no mesmo buffer.
- Enxágüe culturas como descrito em 5,5.
- Enxague as culturas várias vezes com 0,1 M tampão Tris-HCl, pH 7,6 por 1 h.
- Incubar as culturas com 0, 3% de 3,4 ′-diaminobenzidina hidrocloreto (DAB) solução em 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Adicionar 5-8 μL de 1% H2o2 e aguarde 10-15 min. Monitore o desenvolvimento de DAB um microscópio usando um objetivo de 4-10x.
- Pare a reacção removendo a solução DAB com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6.
- Enxágüe as culturas em PBS por 30 min (várias mudanças).
- Monte os hidrogéis em lâminas de vidro usando suportes de montagem aquosos.
- Analise o comprimento e a distribuição dos axônios dentro do hidrogel usando o plug-in de análise Sholl ou com o plug-in neuritej para o software ImageJ30.
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Representative Results
Aqui, nós apresentamos uma metodologia extensamente acessível para estudar o crescimento axonal em culturas do colagénio do hidrogel 3-D do sistema nervoso embrionário do rato. Para este fim, Nós isolamos o colagénio das caudas adultas do rato para gerar as matrizes 3-D em que nós cultivou agregados genetically-modificados da pilha que expressam netrin-1 ou Sema3E confrontado com o tecido neuronal embrionário (por exemplo, região do CA do hipocampo). Estes agregados da pilha deram forma a um inclinação radialmente distribuído da molécula do candidato dentro da matriz do colagénio. Finalmente, para avaliar a resposta neuronal a diferentes moléculas, rotulamos as culturas usando métodos imunocitoquímicos (por exemplo, α-TUJ-1) e aplicando um método de quantificação simples e fácil, obtivemos dados suficientes para determinar o efeito do putativo candidato no comportamento axonal.
Em nosso experimento, quando os axônios hipocampais foram confrontados com netrin-1, esses axônios cresceram preferencialmente para a fonte de netrin-1, o que indica que a netrin-1 atua como uma molécula quimioatrativa para esses axônios (Figura 1B). Em contraste, quando os axônios hipocampais onde confrontados com células secretando Sema3E, a maioria deles cresceu oposto ao agregado celular indicando que Sema3E é uma molécula quimorepulsiva para eles (Figura 1C). Na condição de controle (transfecção simulada), todos os axônios cresceram radialmente sem qualquer preferência direcional (Figura 1A). Figura 1 D-e são representações esquemáticas do método de resposta e quantificação axonal. Após a aquisição da imagem, traçamos uma linha no meio do explante que delimitou os quadrantes proximal (próximo ao agregado celular) e distal (oposto ao agregado celular), a fim de calcular a relação proximal/distal (razão P/D). Nas condições de controle, os axônios foram distribuídos igualmente em ambos os quadrantes (outgrowth radial) que indicaram uma relação P/D = 1 (Figura 1d). Quando os explantes mostraram aumento do número de axônios no quadrante proximal em comparação com o distal (indicando quimioatração) a razão foi P/D > 1 (Figura 1e) e quando o número de axônios foi maior no quadrante distal do que no proximal (indicando quimorepulsão) a razão foi P/D < 1 (Figura 1F).
A fim de alcançar excelentes resultados com esta técnica, devemos garantir que a polimerização do colágeno é homogênea, a transfecção celular é eficiente, e a distância entre o explante tecidual e o agregado celular é apropriada (ver discussão).
Em conclusão, podemos confirmar que a geração de hidrogéis à base de colágeno 3-D é uma técnica útil para avaliar o crescimento axonal e as respostas de comportamento a moléculas de orientação de candidatos que podem estar desempenhando papéis essenciais na migração axonal durante desenvolvimento do sistema nervoso.
Figura 1 : Exemplos de explantes que crescem em hidrogéis 3-D em experimentos de confrontação e métodos de quantificação. (A-C) Os explantes foram obtidos da região do hipocampal em E 14.5, cultivados por 48 h in vitro, e rotulados com βIII-tubulin (α-TUJ-1) por imunocoloração. As diferenças no crescimento axonal podem ser observadas visualmente. Por favor, Compare (A) com (B-C). (D-E) Representações esquemáticas do método de resposta e quantificação axonal. A linha pontilhada delimeia o quadrante proximal (P) e distal (D) para calcular a razão P/D. relação P/D = 1 representa um padrão radial de crescimento (d); P/D > 1 indica uma resposta quimioatrativa (e), e p/d < 1 indica um efeito chemorepulsive (F). Abreviaturas: CA = CA1-3 regiões hipocampais; D = quadrante distal; P = quadrante proximal. Barras de escala = 200 μm (A-C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O crescimento de axônios em desenvolvimento é principalmente invasivo e inclui a degradação e a remodelação do ECM. Usando o procedimento aqui apresentado, os pesquisadores podem obter uma matriz 3-D homogênea formada pelo colágeno tipo I natural, em que os axônios (ou células) podem responder a um gradiente químico secretado por células geneticamente modificadas como eles fazem in vivo. Diferentes respostas axonais a gradientes de pistas atraentes ou inibitórias (proteínas, lipídios, etc.) podem ser facilmente comparadas ao controle específico (células transfectadas simuladas). Como vantagens, devemos mencionar que os tendões são fáceis de isolar e, na verdade, eles podem ser remanescentes de experimentação animal. Além disso, os tendões são altamente colágeno eu concentrado em comparação com outros tecidos, como a pele ou pulmão31.
Embora a metodologia aqui apresentada seja simples de realizar, existem algumas etapas que necessitam de atenção especial durante o processo. A respeito da extração do colagénio, é imperativo remover os vasos sanguíneos e os restos de pele indesejados dos tendões da cauda a fim melhorar a pureza do colagénio e a qualidade da gelação. Além disso, é obrigatório manter condições estéreis realizando algumas etapas uma capa de fluxo laminar estéril e esterilizando as ferramentas cirúrgicas antes de usar. Além disso, é importante manter as condições adequadas de pH e temperatura das soluções. Por exemplo, se as soluções de MEM 10x e de bicarbonato não forem ideais, a matriz de colágeno não polimeriza de forma homogênea e, consequentemente, o crescimento e o resultado axonal serão afetados negativamente. Além disso, se a solução de colágeno é muito concentrada ou muito diluído, as matrizes não gel corretamente. Em nossa experiência, a melhor concentração do estoque do colagénio é aproximadamente 5-5.5 mg/ml da proteína (quantificada por um jogo colorimétrico do ensaio da proteína) e nós usamos uma diluição 3:1 (colagénio: 0.1 x mem) para obter matrizes perfeitas do hidrogel. Em relação à transfecção celular e à formação de agregados celulares, é importante manter condições estéreis e evitar possíveis contaminações, por exemplo, os vetores purificadores de plasmídeo com kits de purificação de DNA plasmídeo livre de endotoxina são obrigatórios. Além disso, devemos enfatizar que as condições de transfecção variam de acordo com o tipo de célula, o número da passagem e as características do plasmídeo. Aqui, temos relatado as condições ideais e de rotina em nossas mãos. Portanto, os pesquisadores devem testar as concentrações recomendadas indicadas pelo fabricante ou ajustá-las para determinar suas próprias condições ideais.
Em relação aos problemas que podem surgir com essa técnica, devemos considerar que, às vezes, as matrizes 3-D não apresentam a estrutura homogênea de gel-like esperada. Neste caso, é importante verificar a temperatura e a condição de pH das soluções e descartá-las caso esteja incorreta. Além disso, recomenda-se realizar um teste de controle de qualidade, como a desnaturação eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), condições de redução para validar a pureza da preparação do estoque de colágeno. Com esta abordagem, o colágeno tipo I puro e não danificado mostra um padrão de migração típico constituído por 2 cadeias α monoméricas (α1 e α2), 3 cadeias β diméricas (β11, β12, variante β11) e 1 cadeia trimérica γ32,33. Se o colágeno obtido não se encaixar neste padrão, ele não deve ser usado. Finalmente, após a imunomarcação, os axônios podem aparecer radialmente distribuídos quando confrontados com células secretando uma molécula quimorepulsiva ou quimioatraente. Nesta situação, a eficiência do transfection deve ser verific executando uma técnica de mancha do ponto no sistema apropriado da cocultura (se os plasmídeos do ADN são fosfatase alcalino-etiquetados) ou processando os meios de cultura após o transfection por ocidental Mancha. Uma limitação a considerar é que a distância entre o agregado da pilha e o explante do tecido é crucial. Se eles estão muito distantes, não seremos capazes de ver qualquer efeito claro da molécula secretada no explante tecidual, mas se eles são muito próximos uns dos outros, o efeito será muito forte para ser considerado como um bom resultado. De nossa experiência, a distância apropriada é em torno de um explant-Size (400-500 μm) porque o inclinação molecular gerado pelo agregado da pilha se estenderá radialmente de ao longo de 400-500 μm após 24 h na cultura.
Alternativamente, pode-se usar extrato de ECM derivado do tumor comercial em vez de colágeno cauda de rato. Nesse caso, todos os procedimentos devem ser realizados entre 4 e 10 ° c, uma vez que a gelação do extrato comercial de ECM é dependente da temperatura. Assim, cuidados especiais devem ser tomados para garantir todos os pratos de cultura, pontas de pipeta, meios de cultura, e as soluções são mantidas a 4 ° c.
Finalmente, embora o método aqui apresentado esteja associado principalmente à análise de funções neuronais, como o crescimento axonal ou a migração neuronal, torna-se também uma técnica útil para a triagem farmacológica, ensaios de aderência, fibrilação in vitro experimentos e estratégias de engenharia de tecidos34,35,36.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Tom Yohannan pelo Conselho editorial e M. segura-Feliu pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo programa CERCA e pela Comissão para universidades e pesquisa do departamento de inovação, universidades e empresa da Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabalho foi financiado pelo Ministério espanhol de pesquisa, inovação e Universidade (MEICO) através de BFU2015-67777-R e e RTI2018-099773-B-100, a rede espanhola prion (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT), eo Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
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