Summary
Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.
Abstract
Este protocolo utiliza colágeno natural tipo I para generar hidrogel tridimensional (3-D) para monitorear y analizar el crecimiento axonal. El protocolo se centra en el cultivo de pequeños trozos de cerebros de roedores embrionarios o postnatales tempranos dentro de un hidrogel 3D formado por el colágeno tipo I derivado del tendón de la cola de rata con porosidad específica. Las piezas de tejido se cultivan dentro del hidrogel y se enfrentan a fragmentos cerebrales específicos o agregados celulares modificados genéticamente para producir y secretar moléculas adecuadas para crear un gradiente dentro de la matriz porosa. Los pasos de este protocolo son simples y reproducibles, pero incluyen pasos críticos a considerar cuidadosamente durante su desarrollo. Además, el comportamiento de los axons en crecimiento se puede monitorear y analizar directamente utilizando un microscopio de contraste de fase o un microscopio de fluorescencia mono/multifoto después de la fijación mediante métodos inmunocitoquímicos.
Introduction
Los axónicos neuronales, que terminan en conos de crecimiento axonal, migran largas distancias a través de la matriz extracelular (ECM) del embrión sobre vías específicas para alcanzar sus objetivos apropiados. El cono de crecimiento es la porción distal del axón y estáespecializado para detectar el entorno físico y molecular de la célula 1,2. Desde un punto de vista molecular, los conos de crecimiento se guían por al menos cuatro mecanismos moleculares diferentes: atracción de contacto, quimioatracción, repulsión de contacto y quemorepulsión desencadenada por diferentes señales de orientación axonal3,4 , 5 , 6.Los procesos mediados por contacto pueden monitorizarse parcialmente en cultivos bidimensionales (2D) en sustratos micropatrones (por ejemplo, con rayas 7,8 o manchas9 que contengan las moléculas). Sin embargo, los axons pueden navegar a su objetivo de una manera no difusa mediante la sensación de varias moléculas atractivas y repulsivas de las células de la guía en el medio ambiente4,5,10. Aquí, describimos un método fácil de cultivo 3D para comprobar si una molécula secretada induce efectos chemorepulsivas o quimioatractivos en el desarrollo de axones.
Los primeros estudios tenían como objetivo determinar los efectos de las señales de orientación de axón utilizadas en cultivos explantados en matrices tridimensionales (3-D) para generar gradientes que simulaban en condiciones vivas11,12. Este enfoque, junto con los experimentos in vivo, permitió la identificación de cuatro familias principales de señales de orientación: Netrins, Slits, Semaphorins, y Ephrins4,5,6. Estas señales moleculares y otros factores13 están integradas por los axons en crecimiento, desencadenando la dinámica de los complejos de adhesión y transduciendo las fuerzas mecánicas a través del citoesqueleto14,15,16. Para generar gradientes moleculares en cultivos tridimensionales para la navegación axonal, investigadores pioneros utilizaron sustratos de coágulos plasmáticos17,que también se utilizaron para preparaciones de rodajas organotípicas18. Sin embargo, en 1958, se informó de un nuevo protocolo para generar hidrogeles de colágeno 3D para estudiar con los dispositivos de Maximow19,una plataforma de cultivo, utilizada en varios estudios adecuados para observaciones microscópicas20. Otro estudio pionero informó el gel de colágeno como una herramienta para incrustar fibroblastos humanos para estudiar la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos en procesos de cicatrización de heridas21. Paralelamente, Lumsden y Davies aplicaron colágeno de la dermis bovina para analizar el efecto putativo del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la orientación de las fibras nerviosas sensoriales22. Con el desarrollo de nuevas plataformas de cultivo (por ejemplo, placas multipozos) pordiferentes empresas y laboratorios, los cultivos de colágeno se adaptaron a estos nuevos dispositivos 6,23,24,25 ,26. Paralelamente, un extracto de material ECM derivado de la línea de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm se puso a disposición comercialmente para ampliar estos estudios27.
Recientemente, se han desarrollado varios protocolos para generar gradientes moleculares con funciones putativas en la orientación de axón utilizando hidrogeles 3D (por ejemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, la molécula candidata puede ser inmovilizada a diferente concentración en una matriz porosa (por ejemplo, NGF29) o generada por el cultivo en una pequeña región de los agregados de células hidrogel 3D que segregan la molécula para generar una gradiente4,23,24,25,26. La última posibilidad se explicará en este protocolo.
El procedimiento presentado aquí es un método fácil, rápido y altamente reproducible basado en el análisis del crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3D del cerebro de ratón embrionario. En comparación con otros métodos, el protocolo es adecuado para investigadores no entrenados y se puede desarrollar completamente después de un breve entrenamiento (1-2 semanas). En este protocolo, primero aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que los agregados celulares modificados genéticamente se cultivan frente al tejido neuronal embrionario. Estos agregados celulares forman gradientes químicos radiales de una molécula candidata que provoca una respuesta para los axones en crecimiento. Por último, la evaluación de los efectos de la molécula en los axónicos en crecimiento se puede realizar fácilmente mediante una microscopía de contraste de fase o, alternativamente, métodos inmunocitoquímicos.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las directrices y protocolos del Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Barcelona, y el protocolo para el uso de roedores en este estudio fue revisado y aprobado por el CEEA de la CEEA de la Universidad de Barcelona (aprobación de la CEEA #276/16 y 141/15).
1. Purificación del colágeno de la cola de rata
- Recoger colas de rata Sprague-Dawley adultas (8-9 semanas de edad) después de sacrificar al animal siguiendo las pautas éticas y enjuagar en 95% etanol. Colocar 2-4 colas sobre hielo (4oC) y mantenerlas cubiertas de hielo durante el proceso.
- Para obtener tendones de cola, fijar la cola en las vértebras más caudales de la cola usando un hemostat y comprimir la cola con un segundo hemostat situado alrededor de 5-7 mm desde el primero. Rompe la cola torciéndola bruscamente con ambos hemostats. Para ello, doble/desdoble las vértebras varias veces hasta que se rompa.
- Tire de las vértebras lentamente con el hemostat para separar los tendones de su vaina a medida que sale. En este momento, cortar tendones con tijeras pequeñas. Mantenga estas piezas de tendón en un plato estéril de 100 mm Petri sobre hielo.
- Repita la sujeción y deslizamiento durante el resto de la cola hasta que los tendones estén totalmente extraídos.
- Repita los pasos 1.2-1.4 para todas las colas obtenidas.
- Observe los tendones bajo un microscopio. Deseche los vasos sanguíneos cortando con tijeras pequeñas y sosteniendo con fórceps finos rectos para mejorar la pureza del tendón y enjuague los tendones 3 veces con agua ultrapura.
- Recoger 3-4 g de tendones húmedos. Disolver los tendones en 150 ml de ácido acético glacial al 3% a 4 oC en un matraz cónico de vidrio de 200-250 ml durante 24-36 h, bajo agitación suave.
- Centrífuga a 20.000 x g durante 1 h. En paralelo, prepare la membrana de tubos de diálisis cortando una pieza de alrededor de 10-15 cm de longitud y hervirla en agua ultrapura que contenga 1 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) durante 15 minutos. A continuación, enjuague suavemente la membrana de diálisis con agua ultrapura.
- Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante en la membrana de tubos de diálisis por decantación. El pellet contiene material insoluble ácido (proteínas no colágenos) y el sobrenadante contiene proteínas de colágeno solubles.
- Dialyze el sobrenadante contra 2 L de águila media esencial mínima de 0,1x estéril (MEM), pH 4.0 en un vaso de vidrio de 2-5 L. Dialyze durante 3 días. Cambie la solución MEM 0,1x al menos dos veces al día comprobando el pH en cada cambio antes de usar. Si el pH se ha vuelto básico, modifíquelo con unas gotas de ácido acético de 0,1 M hasta que el pH sea 4,0.
- Después de la diálisis, agregue antibióticos (1,5 ml de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) a la solución de colágeno dializado. Hacer alícuotas de 5 ml de la solución de callos y almacenar a 4 oC.
NOTA: A partir de este punto, todos los procedimientos de manipulación deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. -
Proceda con la prueba de gelificación de la solución de colágeno preparada siguiendo los siguientes pasos.
- Dado que el colágeno en stock suele estar demasiado concentrado, preparar 3 diluciones de trabajo (75%, 50% y 25% solución de colágeno) diluyendo el stock en 0.1x MEM, pH 4.0. El volumen final recomendado para cada dilución de trabajo es de 5 ml. En cada condición, compruebe la concentración de proteínas utilizando un ensayo colorimétrico de proteínas.
- Colocar varios tubos centrífugos cónicos vacíos de 1,5 ml (uno para cada dilución de trabajo), 10 tubos MEM, 7,5% de solución de bicarbonato sódico y diferentes diluciones de trabajo de colágeno sobre hielo. Espere hasta que se enfríen.
- Añadir 40-50 l de 10 MEM a un tubo centrífugo frío (4 oC). A continuación, mezcle suavemente con 7-8 ml de solución de bicarbonato sódico.
- Añadir 310-330 l de una de las diferentes diluciones de colágeno a este tubo y mezclarsuavemente con la pipeta evitando cualquier formación de burbujas. Mantenga la mezcla de bicarbonato de colágeno-MEM-sodio sobre hielo (4 oC) durante al menos 5 minutos.
- Pipetear 10-25 l de la mezcla en una placa Petri de 35 mm.
- Colocar la placa Petri en la incubadora de CO2 a 37oC hasta que se observe la gelifación del hidrogel (a 15-20 min).
- Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para las diluciones de colágeno restantes en diferentes platos de Petri.
- Seleccione la dilución de trabajo de colágeno que represente los mejores resultados.
NOTA: El mejor hidrogel gelizado debe tener una textura translúcida uniforme, color gris y no debe ser abultado o frito. En nuestra experiencia, una dilución de 3:1 (Colágeno: 0,1x MEM) genera los mejores resultados experimentales.
2. Preparación de células (COS1) Agregados genéticamente modificados para secretar una molécula candidata en hidrogeles de colágeno 3-D
- Placa 2 x 106 COS1 células en un 35 mm platos Deli e incubar con medio de cultivo completo compuesto por 100 ml de D-MEM que contiene 10% (vol/vol) suero bovino fetal inactivado por calor, 0,5% (wt/vol) glutamina y 1% (wt/vol) Pen/Strep en un cultivo celular incubadora, con el fin de alcanzar el 70-80% de confluencia durante la noche. Prepare un plato de Petri para cada procedimiento de transfección.
-
Al día siguiente, las células COS1 transfectos con el ADN codifican la molécula candidata (Netrin-1 o Sema3E) utilizando el método de transfección basado en liposomas siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Para ello, mezcle 250 ml de medio libre de suero y ADN (1-2 g por condición) en un tubo centrífugo de 1,5 ml (tubo de ADN) y mezcle. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Preparar un segundo tubo (tubo liposomal) añadiendo 240 ml del medio libre de suero y 10 ml del reactivo de transfección liposomal. Incubar a RT durante 5 min.
- Después de la incubación, agregue el contenido del tubo de ADN al tubo liposomal y mezcle suavemente. Ahora incubar a RT durante 15 minutos. Reemplace el medio en las células cultivadas con 1,5 ml del medio libre de suero y agregue la mezcla de liposomas de ADN a la placa Petri lentamente en gota. Incubar durante 3 h en la incubadora de cultivo celular CO 2.
- Después de 3 h de incubación de transfección, sustituya el medio por el medio de cultivo completo e incubadurante durante la noche en la incubadora.
- Al día siguiente, enjuague las células con 0,1 M de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS), trate los cultivos con trippsina-EDTA (800 ml por cada plato durante 5-15 minutos en la incubadora de CO 2) y recoja las células separadas con 15 ml de medio de cultivo completo.
- Centrifugar las células a 4oC a 130 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, retire los medios y conserve el pellet que contiene células COS1 en hielo.
- Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para preparar la mezcla de trabajo de colágeno.
- Añadir 100-150 l de la mezcla de colágeno al pellet de las células transsemicadas y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y esparcir 45-50 l de esta mezcla en una placa Petri (35 mm de diámetro) para formar una banda uniforme de células de colágeno de alrededor de 1-1,5 cm de longitud. Colocar el plato en la incubadora a 37oC (5% CO2) hasta que se observe la gelidación (a 15-20 min).
- Preparar una segunda tira que contenga células de control (transfección simulada) en un segundo plato de cultivo y placarla en la incubadora (15-20 min) y cuando se complete la gelidación añadir 3-4 ml de COS1 COS1 caliente medio de cultivo completo a cada plato que contenga el gelizado las tiras de células de colágeno y mantenerlas en la incubadora de cultivo celular de CO 2. A partir de entonces, corte las tiras de células de colágeno para generar pequeñas piezas cuadradas (400 a 500 m de longitud) usando un bisturí fino o un helicóptero de tejido.
- Transfiera todas las secciones de la misma condición de transfección a una placa Petri que contenga 3-3,5 ml de medios de cultivo neuronal (NCM) y compruebe bajo un microscopio de disección la calidad de las piezas. Una vez más, manténgalos en la incubadora de cultivo celular de CO 2.
NOTA: El medio de cultivo neuronal consiste en medio neurobasal que contiene 1-5% (vol/vol) suero de caballo inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (wt/vol) glucosa, 1% (wt/vol) Pen-Strep solución y 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Asegúrese de que el pH esté entre 7,2-7,3.
3. Generación de Explant embrionario para el cultivo
- Esterilice las herramientas quirúrgicas (tijeras, mango de la cuchilla del bisturí, fórceps rectos y curvos) autoclavendo siguiendo las pautas de esterilización rutinarias. En paralelo preparar 500 ml del tampón equilibrado de solución de sal-glucosa de Hank y 4-5 platos de Petri (100 mm de diámetro) que contienen 10 ml de HBSS-G. Coloque estas placas sobre hielo (4oC).
- Sacrificar a la rata embarazada (día embrionario 16.5) fuera de la zona estéril, siguiendo los procedimientos éticos aprobados. Corta los cuernos embrionarios con tijeras de la cavidad abdominal y colócalos en un plato grande de Petri que contenga HBSS-G frío.
- Coloque el plato en la campana de flujo laminar y extraiga los embriones con fórceps rectos. Colóquelos en un plato nuevo que contenga HBSS-G frío. A continuación, retire la piel del embrión usando pequeños fórceps y diseccione cuidadosamente el cerebro usando los fórceps curvos y rectos. Colóquelos en un plato que contenga HBSS-G frío.
- Bajo un microscopio de disección, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la línea media para separar ambos hemisferios con el bisturí o tijeras finas y eliminar el diencéfalo, las meninges y los vasos sanguíneos de las piezas cerebrales con fórceps finos.
- Repita los pasos 3.3-3.4 con el resto de los embriones. No retrase la disección durante más de 2 h para preservar la calidad del tejido.
- Limpie todas las partes del helicóptero de tejido con 100% de etanol (especialmente la placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) y la cuchilla de afeitar). Mantenga el helicóptero de tejido en la campana de flujo laminar bajo iluminación UV durante 15 minutos.
- Transfiera cada pieza de tejido (por ejemplo, corteza con hipocampo) a la placa de corte del helicóptero de tejido. Para el hipocampo, colóquelo perpendicular a la cuchilla de afeitar y obtenga secciones de tejido de 450-500 m de espesor.
- Preparar varios platos Petri de 35 mm con 3-4 ml de NCM completo y transferir piezas de tejido de la placa de chopper de tejido a los platos Petri. Muchos platos pueden ser necesarios ya que las regiones de interés se diseccionan.
- Terminar la disección de tejido en el MNC completo usando agujas finas de tungsteno. Compruebe la calidad de las rodajas obtenidas bajo el microscopio de disección. Asegúrese de que las capas son claramente identificables en la óptica de campo oscuro y diseccionar la región de interés (por ejemplo, la región de CA del hipocampo) con agujas de tungsteno. Deseche las rodajas dañadas. Mantenga los explantes hipocampales en medio NCM completo en la incubadora de CO 2.
4. Preparación de cocultivos 3D en hidrogeles de colágeno
- Coloque varias placas de cultivo estériles de 4 pocillos en la campana de flujo laminar y prepare una mezcla de trabajo de colágeno como se indicó anteriormente en los pasos 1.12.2-1.12.6.
- Colocar 15-20 l de la mezcla de hidrogel en la parte inferior de un pozo para producir una base circular de colágeno. Repita este paso para el resto de los pozos. No prepare más de cinco placas al mismo tiempo para evitar la evaporación excesiva de líquidode la base de hidrogel.
- Conservar los platos en la incubadora hasta que se observe la gelación completa (15-20 min) y sacar las placas de la incubadora sólo cuando se complete la gelidación. Compruebe la calidad del colágeno gelizado.
- Transfiera una pequeña pieza de agregado de células COS1 con una pipeta. Colóquelo en la base del hidrogel y coloque una pieza de tejido en la misma base con una pipeta cerca de la pieza de las células agregadas en un tamaño explanta.
- Preparar una nueva mezcla de colágeno de trabajo sobre hielo como en los pasos 1.12.2-1.12.6.
- Pipetear suavemente 15-20 l de esta nueva mezcla y cubrir el explant y el agregado celular. Se observará un cultivo de hidrogel similar a un sándwich. En este momento, reorientar la explantación con una aguja de tungsteno fino (¡no toque el agregado de celda COS1!), por lo que se enfrenta al agregado de celda a 500-600 m.
- Devolver la placa a la incubadora hasta que se observe la gelidación (10-15 min), y 0,5 ml de NCM completo complementado con suplemento de 2% B27y mantener los cultivos durante 36 a 48 h en la incubadora (37 oC, 5% CO 2).
5. Fijación de cocultivos agregados de células explantas y procedimiento inmunocitoquímico
- Después de 36-48 h de incubación, retire el medio y enjuague con 0.1 M de fosfato salina tamponada (PBS), pH 7.3. A partir de entonces, fijar los cultivos durante 1 h con 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 oC.
- Retire el fijador y enjuague suavemente los cultivos 3-4 veces (10-15 min cada uno) en 0,1 M PB, pH 7,3.
- Separe el sándwich de hidrogel de la parte inferior del pozo con espátula o fórceps. Transfiera el bloque de colágeno con un pincel fino a una placa de cultivo de 6 pocillos que contenga 0,1 M PBS con un detergente no iónico al 0,5%.
- Incubar hidrogeles flotantes en la solución de bloqueo (10% suero, 0,5% tensioactivo no iónico y 0,2% de gelatina en 0,1 M PBS) durante 2-3 h a RT con agitación suave.
- Enjuague 3 veces (10-15 min cada uno) con 0,1 M PBS que contenga un tensioactivo no iónico al 0,5%.
- Incubar con anticuerpo primario diluido en PBS que contenga un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5%, una gelatina al 0,2% y un 0,02% de azida sódica. Incubar con el anticuerpo primario durante 36-48 h a 4oC en una coctelera.
NOTA: Por lo general, se utiliza un anticuerpo contra la clase III de la tubulina (-TUJ-1) (diluido 1:2.000) para definir el crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3-D. - Después de la incubación, enjuague como en el paso 5.5.
- Incubar con anticuerpo secundario durante 4 h a RT (o 6-7 h a 4oC) sobre una coctelera diluida en suero del 5%, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. En este experimento se utiliza un anticuerpo biotinilado antiratón de caballo (diluido 1:200).
- Enjuague los cultivos como en 5.5.
- Incubar los cultivos durante 2 días a 4 oC con solución compleja de avidina-biotina (ABC) 1:100 diluida en PBS que contiene un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. Alternativamente, utilice la peroxidasa de rábano picante (HRP) con la etiqueta streptavidina (diluida 1:300-400) en el mismo búfer.
- Enjuague los cultivos como se describe en 5.5.
- Enjuague los cultivos varias veces con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7,6 durante 1 h.
- Incubar los cultivos con 0,03% de solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB) al 0,3 o-diaminobenzidina en 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Añadir 5-8 l de 1% H2O2 y esperar 10-15 min. Monitorear el desarrollo de DAB bajo un microscopio usando un objetivo de 4-10x.
- Detenga la reacción eliminando la solución DAB con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7.6.
- Enjuague los cultivos en PBS durante 30 min (varios cambios).
- Monte los hidrogeles en portaobjetos de vidrio utilizando medios de montaje acuosos.
- Analice la longitud y distribución de los axones dentro del hidrogel utilizando el plug-in de análisis Sholl o con el plug-in NeuriteJ para el software ImageJ30.
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Representative Results
Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible para estudiar el crecimiento axonal en cultivos de colágeno de hidrogel 3-D del sistema nervioso de ratón embrionario. Con este fin, aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que cultivamos agregados celulares modificados genéticamente expresando Netrin-1 o Sema3E confrontados con tejido neuronal embrionario (por ejemplo, región CA del hipocampo). Estos agregados celulares formaron un gradiente distribuido radialmente de la molécula candidata dentro de la matriz de colágeno. Por último, para evaluar la respuesta neuronal a diferentes moléculas, etiquetamos los cultivos utilizando métodos inmunocitoquímicos (p. ej., -TUJ-1) y aplicando un método de cuantificación simple y fácil, obtuvimos suficientes datos para determinar el efecto de la putativa candidato en el comportamiento axonal.
En nuestro experimento, cuando los axones del hipocampo se enfrentaron con Netrin-1, estos axones crecieron preferentemente hacia la fuente de Netrin-1 que indica que Netrin-1 actúa como una molécula quimioatractiva para estos axones (Figura1B). Por el contrario, cuando los axones hipocampales se enfrentaron a células secretantes de Sema3E, la mayoría de ellos crecieron opuestos al agregado celular, lo que indica que Sema3E es una molécula quecresiva para ellos (Figura1C). En la condición de control (transfección simulada), todos los axons crecieron radialmente sin ninguna preferencia direccional (Figura1A). Figura 1 D-E son representaciones esquemáticas del método de cuantificación y respuesta axonal. Después de la adquisición de la imagen, dibujamos una línea en el medio de la explanta que delimitaba los cuadrantes proximal (cerca del agregado de celda) y los cuadrantes distales (opuestos al agregado de celda) para calcular la relación proximal/distal (relación P/D). En condiciones de control, los axons se distribuyeron equitativamente en ambos cuadrantes (crecimiento radial) que indicaba una relación P/D a 1 (Figura1D). Cuando los explantes mostraron un mayor número de axónes en el cuadrante proximal en comparación con el distal (indicando quimioatracción), la proporción fue P/D > 1 (Figura1E)y cuando el número de axónes fue mayor en el cuadrante distal que en el proximal (indicando quesinpulsión) la relación fue P/D < 1 (Figura1F).
Con el fin de lograr excelentes resultados con esta técnica, debemos asegurarnos de que la polimerización de colágeno sea homogénea, la transfección celular sea eficiente y que la distancia entre el tejido explantar y el agregado celular sea apropiado (ver Discusión).
En conclusión, podemos confirmar que la generación de hidrogeles a base de colágeno 3-D es una técnica útil para evaluar el crecimiento axonal y las respuestas de comportamiento a las moléculas de guía candidatas que pueden estar desempeñando un papel esencial en la migración axonal durante desarrollo del sistema nervioso.
Figura 1 : Ejemplos de explantes que crecen en hidrogeles 3D en experimentos de confrontación y métodosde cuantificación. (A-C) Los explantas se obtuvieron de la región del hipocampo en E14.5, se cultivaron durante 48 h in vitro, y se etiquetaron con la tubulina III por inmunomancha. Las diferencias en el crecimiento axonal se pueden observar visualmente. Compare (A) con (B-C). (D-E) Representaciones esquemáticas del método de cuantificación y respuesta axonal. La línea de puntos delimita tanto el cuadrante proximal (P) como el cuadrante distal (D) para calcular la relación P/D. Ratio P/D á 1 representa un patrón radial de crecimiento (D); P/D > 1 indica una respuesta quimioatractiva (E), y P/D < 1 indica un efecto chemorepulsive (F). Abreviaturas: CA - CA1-3 regiones hipocampales; D - cuadrante distal; P - cuadrante proximal. Barras de escala a 200 m (A-C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El crecimiento de los axons en desarrollo es principalmente invasivo e incluye la degradación y remodelación de ECM. Utilizando el procedimiento presentado aquí, los investigadores pueden obtener una matriz 3D homogénea formada por el colágeno natural tipo I en el que los axons (o células) pueden responder a un gradiente químico secretado por células modificadas genéticamente como lo hacen in vivo. Diferentes respuestas axonales a gradientes de señales atractivas o inhibitorias (proteínas, lípidos, etc.) se pueden comparar fácilmente con el control específico (células transinfectantes simuladas). Como ventajas, hay que mencionar que los tendones son fáciles de aislar y, de hecho, pueden ser restos de experimentación animal. Además, los tendones son altamente colágeno que concentré en comparación con otros tejidos como la piel o el pulmón31.
Aunque la metodología presentada aquí es fácil de realizar, hay algunos pasos que necesitan una atención especial durante el proceso. En cuanto a la extracción de colágeno, es imperativo eliminar los vasos sanguíneos no deseados y los desechos de la piel de los tendones de la cola con el fin de mejorar la pureza del colágeno y la calidad de la gelación. Además, es obligatorio mantener condiciones estériles realizando algunos pasos bajo una campana de flujo laminar estéril y esterilizando las herramientas quirúrgicas antes de su uso. Además, es importante mantener las condiciones adecuadas de pH y temperatura de las soluciones. Por ejemplo, si las soluciones MEM 10x y bicarbonato no son óptimas, la matriz de colágeno no polimerizará homogéneamente, y en consecuencia, el crecimiento axonal y el resultado se verán afectados negativamente. Además, si la solución de stock de colágeno está demasiado concentrada o demasiado diluida, las matrices no se gelificarán correctamente. En nuestra experiencia, la mejor concentración de stock de colágeno es de aproximadamente 5-5,5 mg/ml de proteína (cuantificada por un kit de ensayo de proteína colorimétrica) y utilizamos una dilución 3:1 (Colágeno: 0,1x MEM) para obtener matrices de hidrogel perfectas. En cuanto a la transfección celular y la formación de agregados celulares, es importante mantener condiciones estériles y evitar posibles contaminaciones, por ejemplo, es obligatorio purificar vectores de plásmido con kits de purificación de ADN plásmido libre de endotoxinas. Además, debemos enfatizar que las condiciones de transfección varían dependiendo del tipo de celda, el número de pasaje y las características plásmidas. Aquí, hemos informado de las condiciones óptimas y rutinarias en nuestras manos. Por lo tanto, los investigadores deben probar las concentraciones recomendadas indicadas por el fabricante o ajustarlas para determinar sus propias condiciones óptimas.
En cuanto a los problemas que pueden surgir con esta técnica, debemos considerar que a veces las matrices 3D no presentan la estructura homogénea esperada similar al gel. En este caso, es importante comprobar la temperatura y el estado de pH de las soluciones y desecharlas en caso de que sea incorrecta. Además, se recomienda realizar una prueba de control de calidad como la electroforesis de gel de poliacrilamida desnaturalización (SDS-PAGE) en condiciones de reducción para validar la pureza de la preparación del stock de colágeno. Con este enfoque, el colágeno de tipo I puro y no dañado muestra un patrón de migración típico que consta de 2 cadenas monoméricas (n.o 1 y 2), 3 cadenas dimericas (11, 12, variante 11), y 1 cadena de trimé rico32,33. Si el colágeno obtenido no se ajusta a este patrón, no debe utilizarse. Por último, después de la inmunomancha, los axons pueden aparecer distribuidos radialmente cuando se enfrentan a células que secretan una molécula chemorepulsive o quimioatractiva. En esta situación, la eficiencia de la transfección debe comprobarse mediante la realización de una técnica de hinchado de puntos en el sistema de cocultivo adecuado (si los plásmidos de ADN están etiquetados con fosfatasa alcalina) o procesando los medios de cultivo después de la transfección por Blot. Una limitación a tener en cuenta es que la distancia entre el agregado celular y la explantación de tejido es crucial. Si están muy separados, no podremos ver ningún efecto claro de la molécula secretada en el tejido explant, pero si están muy cerca uno del otro, el efecto será demasiado fuerte para ser considerado como un buen resultado. A partir de nuestra experiencia, la distancia adecuada es alrededor de un tamaño de explanta (400-500 m) porque el gradiente molecular generado por el agregado celular se extenderá radialmente a lo largo de 400-500 m después de 24 m en cultivo.
Alternativamente, uno puede utilizar extracto comercial de ECM derivado del tumor en lugar de colágeno de cola de rata. En ese caso, todos los procedimientos deben realizarse entre 4 y 10 oC, ya que la gelificación del extracto comercial de ECM depende de la temperatura. Por lo tanto, se debe tener especial cuidado para asegurar que todos los platos de cultivo, puntas de pipeta, medios de cultivo y soluciones se mantengan a 4 oC.
Por último, aunque el método aquí presentado se asocia principalmente con el análisis de funciones neuronales como el crecimiento axonal o la migración neuronal, también se convierte en una técnica útil para el cribado farmacológico, ensayos de adhesión, fibrilación in vitro experimentos y estrategias de ingeniería de tejidos34,35,36.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Tom Yohannan por el asesoramiento editorial y a M. Segura-Feliu por la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Programa CERCA y por la Comisión de Universidades e Investigación del Departamento de Innovación, Universidades y Empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Investigación, Innovación y Universidad de España (MEICO) a través de BFU2015-67777-R y RTI2018-099773-B-100, la Red Española de Morones (Prionet España AGL2017-90665-REDT), y el Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
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