Summary
Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.
Abstract
Dieses Protokoll verwendet natürliches Kollagen Typ I, um dreidimensionales (3-D) Hydrogel zur Überwachung und Analyse des axonalen Wachstums zu erzeugen. Das Protokoll konzentriert sich auf die Kultivierung kleiner Stücke embryonaler oder früher postnataler Nagetierhirne in einem 3-D-Hydrogel, das durch die von der Rattenschwanzsehne abgeleitete Art I Kollagen mit spezifischer Porosität gebildet wird. Gewebeteile werden im Hydrogel kultiviert und mit bestimmten Hirnfragmenten oder genetisch veränderten Zellaggregaten konfrontiert, um Moleküle zu erzeugen und abzusondern, die geeignet sind, einen Gradienten innerhalb der porösen Matrix zu erzeugen. Die Schritte dieses Protokolls sind einfach und reproduzierbar, enthalten jedoch kritische Schritte, die bei seiner Entwicklung sorgfältig zu berücksichtigen sind. Darüber hinaus kann das Verhalten wachsender Axone direkt mit einem Phasenkontrastmikroskop oder einem Mono-/Multiphotonenfluoreszenzmikroskop nach Fixierung mit immunzytochemischen Methoden überwacht und analysiert werden.
Introduction
Neuronale Axone, die in axonalen Wachstumskegeln enden, wandern große Entfernungen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) des Embryos über bestimmte Pfade, um ihre entsprechenden Ziele zu erreichen. Der Wachstumskegel ist der distale Teil des Axons und es ist spezialisiert, die physikalische und molekulare Umgebung der Zelle1,2zu spüren. Aus molekularer Sicht werden Wachstumskegel durch mindestens vier verschiedene molekulare Mechanismen geleitet: Kontaktanziehung, Chemoattraktion, Kontaktabstoßung und Chemorepulsion, ausgelöst durch verschiedene axonale Leitlinien3,4 , 5 , 6. Berührungsvermittelte Prozesse können teilweise in zweidimensionalen (2D) Kulturen auf mikrogemusterten Substraten überwacht werden (z.B. mit Streifen7,8 oder Flecken9, die die Moleküle enthalten). Axone können jedoch auf nicht-diffusive Weise zu ihrem Ziel navigieren, indem sie mehrere attraktive und abstoßende Moleküle aus Leitpfostenzellen in der Umgebungerfassen 4,5,10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode der 3D-Kultur, um zu überprüfen, ob ein abgesondertes Molekül chemorepulsive oder chemoattraktive Effekte auf die Entwicklung von Axonen induziert.
Die frühesten Studien zielten darauf ab, die Auswirkungen von Axon-Leitlinien zu bestimmen, die Explantkulturen in dreidimensionalen (3-D) Matrizen verwendeten, um Gradienten zu erzeugen, die in vivo Bedingungen11,12simulierten. Dieser Ansatz ermöglichte zusammen mit In-vivo-Experimenten die Identifizierung von vier Hauptfamilien von Beratungsstellen: Netrins, Slits, Semaphorins und Ephrins4,5,6. Diese molekularen Hinweise und andere Faktoren13 werden durch die wachsenden Axone integriert, die die Dynamik von Haftkomplexen auslösen und mechanische Kräfte über das Zytoskelett14,15,16transduzieren. Um molekulare Gradienten in 3D-Kulturen für die axonale Navigation zu erzeugen, verwendeten Pionierforscher Plasmagerinnselsubstrate17, die auch für organotypische Scheibenpräparate18verwendet wurden. 1958 wurde jedoch ein neues Protokoll zur Erzeugung von 3D-Kollagenhydrogelen für das Studium mit Maximows Geräten19berichtet, einer Kulturplattform, die in mehreren Studien verwendet wurde, die für mikroskopische Beobachtungen geeignetsind 20. Eine weitere Pionierstudie berichtete kollagengel als Werkzeug zur Einbettung menschlicher Fibroblasten zur Untersuchung der Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten in Wundheilungsprozessen21. Parallel dazu setzten Lumsden und Davies Kollagen aus der Rinderdermis ein, um die vermeintliche Wirkung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) auf die leitenden Sensornervenfasern zu analysieren22. Mit der Entwicklung neuer Kulturplattformen (z.B. Multi-Well-Platten) durch verschiedene Firmen und Labore wurden Kollagenkulturen an diese neuen Geräte angepasst6,23,24,25 ,26. Parallel dazu wurde ein Extrakt aus ECM-Material aus der Engelbreth-Holm-Swarm-Tumorzelllinie kommerziell zur Verfügung gestellt, um diese Studien zu erweitern27.
Kürzlich wurden mehrere Protokolle entwickelt, um molekulare Gradienten mit vermeintlichen Rollen in der Axonführung mit 3-D-Hydrogelen (z. B. Kollagen, Fibrin usw.) zu erzeugen. 28. Alternativ kann das Kandidatenmolekül in unterschiedlicher Konzentration in einer porösen Matrix (z.B. NGF29) immobilisiert oder durch Kultivierung in einem kleinen Bereich der 3D-Hydrogelzellaggregate erzeugt werden, die das Molekül absondern, um eine radiale Gradient4,23,24,25,26. Die letzte Möglichkeit wird in diesem Protokoll erläutert.
Das hier vorgestellte Verfahren ist eine einfache, schnelle und hochreproduzierbare Methode, die auf der Analyse des axonalen Wachstums in 3-D-Hydrogelkulturen des embryonalen Maushirns basiert. Im Vergleich zu anderen Methoden eignet sich das Protokoll gut für nicht ausgebildete Forscher und kann nach einer kurzen Ausbildung (1-2 Wochen) voll entwickelt werden. In diesem Protokoll isolieren wir zunächst Kollagen aus erwachsenen Rattenschwänzen, um weitere 3D-Matrizen zu erzeugen, in denen genetisch veränderte Zellaggregate vor dem embryonalen neuronalen Gewebe kultiviert werden. Diese Zellaggregate bilden radiale chemische Gradienten eines Kandidatenmoleküls, was eine Reaktion auf die wachsenden Axone auslöst. Schließlich kann die Bewertung der Auswirkungen des Moleküls auf wachsende Axone leicht mit einer Phasenkontrastmikroskopie oder alternativ immunzytochemischen Methoden durchgeführt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien und Protokollen des Ethikausschusses für Tierversuche (CEEA) der Universität Barcelona durchgeführt, und das Protokoll für die Verwendung von Nagetieren in dieser Studie wurde von der CEEA der Universität Barcelona (CEEA-Zulassung #276/16 und 141/15).
1. Reinigung von Rattenschwanz kollagen
- Sammeln Sie erwachsene Sprague-Dawley Rattenschwänze (8-9 Wochen alt), nachdem sie das Tier nach ethischen Richtlinien geopfert und in 95% Ethanol abspülen. 2-4 Schwänze auf Eis (4 °C) legen und während des Prozesses mit Eis bedeckt halten.
- Um Schwanzsehnen zu erhalten, fixieren Sie den Schwanz an den kaudalsten Wirbeln des Schwanzes mit einem Hämostat und komprimieren Sie den Schwanz mit einem zweiten Hämostat, das um 5-7 mm vom ersten entfernt positioniert ist. Brechen Sie den Schwanz, indem Sie ihn mit beiden Hämostaten scharf verdrehen. Falten/entfalten Sie dazu die Wirbel mehrmals, bis sie bricht.
- Ziehen Sie die Wirbel langsam mit dem Hämostat, um die Sehnen von ihrer Hülle zu lösen, wie sie herauskommt. In diesem Moment Sehnen mit kleiner Schere schneiden. Bewahren Sie diese Sehnenstücke in einer sterilen 100 mm Petrischale auf Eis auf.
- Wiederholen Sie das Spannen und Gleiten für den Rest des Schwanzes, bis die Sehnen vollständig extrahiert sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.4 für alle erhaltenen Schwänze.
- Beobachten Sie die Sehnen unter dem Mikroskop. Entsorgen Sie die Blutgefäße, indem Sie mit einer kleinen Schere schneiden und mit geraden feinen Zangen halten, um die Reinheit der Sehne zu verbessern und spülen Sie die Sehnen 3 mal mit Reinstwasser ab.
- Sammeln Sie 3-4 g nasse Sehnen. Lösen Sie die Sehnen in 150 ml von 3% Eisessig bei 4 °C in einem 200-250 ml Glaskonuskolben für 24-36 h unter sanftem Rühren auf.
- Zentrifuge bei 20.000 x g für 1 h. Parallel dazu bereiten Sie die Dialyse-Schlauchmembran vor, indem Sie ein Stück von etwa 10-15 cm Länge schneiden und in reinstem Wasser mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 15 min kochen. Danach die Dialysemembran vorsichtig gründlich mit Reinstwasser abspülen.
- Nach der Zentrifugation den Überstand in der Dialyseschlauchmembran durch Dekantierung sammeln. Das Pellet enthält saures unlösliches Material (nicht-kollagenhaltige Proteine) und der Überstand enthält lösliche Kollagenproteine.
- Dialyse den Überstand gegen 2 L sterilen 0.1x Minimum Essential Medium Eagle (MEM), pH 4.0 in einem 2-5 L Glasbecher. Dialyze für 3 Tage. Ändern Sie 0,1x MEM-Lösung mindestens zweimal täglich überprüfen Sie den pH-Wert bei jeder Änderung vor der Verwendung. Wenn sich der pH-Wert grundlegend gedreht hat, modifizieren Sie ihn mit ein paar Tropfen 0,1 M Essigsäure, bis der pH-Wert 4,0 beträgt.
- Nach der Dialyse Antibiotika (1,5 ml Penicillin/Streptomycin (Pen-Strep)) in die dialysierte Kollagenlösung geben. 5 ml Aliquots der Kollagen-Lagerlösung herstellen und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt müssen alle Handhabungsverfahren unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube durchgeführt werden. -
Fahren Sie mit dem Gelationstest der vorbereiteten Kollagen-Stammlösung nach den nächsten Schritten fort.
- Da das Kollagen in der Regel zu konzentriert ist, bereiten Sie 3 Arbeitsverdünnungen (75%, 50% und 25% Kollagenlösung) durch Verdünnung des Bestands in 0,1x MEM, pH 4,0 vor. Das für jede Arbeitsverdünnung empfohlene Endvolumen beträgt 5 ml. Überprüfen Sie in jedem Zustand die Proteinkonzentration mit einem proteinkolorimetrischen Assay.
- Legen Sie mehrere leere 1,5 ml konische Zentrifugenröhren (eine für jede Arbeitsverdünnung), 10x MEM-Röhren, 7,5% Natriumbicarbonatlösung und verschiedene Arbeitsverdünnungen von Kollagen auf Eis. Warten Sie, bis diese abgekühlt sind.
- 40-50 l von 10x MEM in ein kaltes (4 °C) Zentrifugenrohr geben. Als nächstes mischen Sie es vorsichtig mit 7-8 l Natriumbicarbonat-Lösung.
- Fügen Sie 310-330 l einer der verschiedenen Kollagenverdünnungen zu diesem Rohr hinzu und mischen Sie es sanft mit der Pipette, um blasenbildung zu vermeiden. Das Kollagen-MEM-Natrium-Bicarbonat-Gemisch mindestens 5 min auf Eis (4 °C) aufbewahren.
- Pipette 10-25 l der Mischung in eine 35 mm Petrischale.
- Legen Sie die Petrischale in den CO2-Inkubator auf 37 °C, bis die Gelation des Hydrogels (ca. 15-20 min) beobachtet wird.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.12.3-1.12.6 für die restlichen Kollagenverdünnungen in verschiedenen Petrischalen.
- Wählen Sie die Kollagen-Arbeitsverdünnung aus, die die besten Ergebnisse liefert.
HINWEIS: Das beste gegelte Hydrogel sollte eine gleichmäßige transluzente Textur, graue Farbe haben und sollte nicht klumpig oder stringy sein. Nach unserer Erfahrung erzeugt eine Verdünnung von 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) die besten experimentellen Ergebnisse.
2. Vorbereitung von Zell (COS1) Aggregaten genetisch modifiziert, um ein Kandidatenmolekül in 3-D-Kollagen-Hydrogelen zu sezernieren
- Platte 2 x 106 COS1-Zellen in ein 35 mm Petrigeschirr und inkubieren mit komplettem Kulturmedium bestehend aus 100 ml D-MEM mit 10% (vol/vol) wärmeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 0,5% (wt/vol) Glutamin und 1% (wt/vol) Pen/Strep in einer Zellkultur Inkubator, um 70-80% Konfluenz über Nacht zu erreichen. Bereiten Sie eine Petrischale für jedes Transfektionsverfahren vor.
-
Am nächsten Tag transfekieren COS1-Zellen mit der DNA, die das Kandidatenmolekül (Netrin-1 oder Sema3E) kodiert, mit liposomenbasierter Transfektionsmethode nach den Anweisungen des Herstellers.
- Dazu 250 L serumfreies Medium und DNA (1-2 g pro Zustand) in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr (DNA-Röhre) mischen und mischen. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. Bereiten Sie eine zweite Röhre (liposomale Röhre) vor, indem Sie 240 l des serumfreien Mediums und 10 l des liposomalen Transfektionsreageims hinzufügen. Inkubieren Bei RT für 5 min.
- Nach der Inkubation den Inhalt der DNA-Röhre in die liposomale Röhre geben und sanft mischen. Jetzt bei RT für 15 min inkubieren. Ersetzen Sie das Medium auf den kultivierten Zellen mit 1,5 ml des serumfreien Mediums und fügen Sie die DNA-Liposomen-Mischung langsam tropfenweise in die Petrischale ein. Inkubieren Sie für 3 h im CO2-Zellkultur-Inkubator.
- Nach 3 h Transfektionsinkubation das Medium durch das gesamte Kulturmedium ersetzen und über Nacht im Inkubator inkubieren.
- Am nächsten Tag die Zellen mit 0,1 M Dulbeccos Phosphatgepufferter Saline (D-PBS) abspülen, Kulturen mit Trypsin-EDTA (800 l pro Schale für 5-15 min im CO2-Inkubator) behandeln und freistehende Zellen mit 15 ml komplettem Kulturmedium sammeln.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4 °C bei 130 x g für 5 min. Nach der Zentrifugation Medien entfernen und das pellet enthaltende COS1-Zellen auf Eis bewahren.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.12.3-1.12.6, um die Kollagen-Arbeitsmischung vorzubereiten.
- Fügen Sie dem Pellet der transfizierten Zellen 100-150 l der Kollagenmischung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pfeifen und 45-50 l dieser Mischung auf eine Petrischale (35 mm Durchmesser) verteilen, um ein gleichmäßiges Band von Kollagenzellen von etwa 1-1,5 cm Länge zu bilden. Legen Sie die Schale bei 37 °C (5%CO2) in den Inkubator, bis die Gelation (ca. 15-20 min) beobachtet wird.
- Bereiten Sie einen zweiten Streifen mit Kontrollzellen (Mock-Transfektion) in einer zweiten Kulturschale vor und verkleben Sie ihn im Inkubator (ca. 15-20 min) und fügen Sie nach Abschluss der Gelation 3-4 ml erwärmtes (37 °C) COS1-Gesamtkulturmedium zu jedem Gericht hinzu, das das gegelte Kollagenzellen streifen und bewahren sie im CO2-Zellkultur-Inkubator auf. Danach schneiden Sie die Kollagenzellenstreifen, um kleine quadratische Stücke (400 bis 500 m Lang) mit einem feinen Skalpell oder einem Gewebehäcksler zu erzeugen.
- Übertragen Sie alle Abschnitte aus dem gleichen Transfektionszustand auf eine Petrischale, die 3-3,5 ml neuronale Kulturmedien (NCM) enthält, und überprüfen Sie unter einem Seziermikroskop die Qualität der Stücke. Bewahren Sie sie erneut im CO 2-Zellkultur-Inkubator auf.
HINWEIS: Neuronales Kulturmedium besteht aus neurobasalen Medien, die 1-5% (vol/vol) hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 2 mM Glutamin, 0,5% (wt/vol) Glukose, 1% (wt/vol) Pen-Strep-Lösung und 0,044% (wt/vol) NaHCO3enthalten. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert zwischen 7.2-7.3 liegt.
3. Erzeugung von Embryonalen Explantationen für Kultur
- Sterilisieren Sie die chirurgischen Werkzeuge (Schere, Skalpellklingengriff, gerade und gekrümmte Zange) durch Autoklavieren nach Routinesterilisationsrichtlinien. Parallel 500 ml von Hanks ausgewogenem Salzlösungs-Glukosepuffer und 4-5 Petrischalen (100 mm Durchmesser) mit 10 ml HBSS-G vorbereiten. Legen Sie diese Platten auf Eis (4 °C).
- Opfern Sie die schwangere weibliche Ratte (Embryonaltag 16.5) außerhalb des sterilen Bereichs, nach den zugelassenen ethischen Verfahren. Schneiden Sie die Embryohörner mit einer Schere aus der Bauchhöhle und legen Sie sie in eine große Petrischale mit kaltem HBSS-G.
- Legen Sie die Schale in die laminare Fließhaube und extrahieren Sie die Embryonen mit geraden Zangen. Legen Sie sie in ein neues Gericht mit kaltem HBSS-G. Als nächstes entfernen Sie die Haut des Embryos mit kleinen Zangen und sezieren das Gehirn vorsichtig mit den gekrümmten und geraden Zangen. Legen Sie sie in ein Gericht mit kaltem HBSS-G.
- Schneiden Sie das Gehirn unter einem Sezierendes Mikroskop entlang der Mittellinie in die Hälfte, um beide Hemisphären mit dem Skalpell oder einer feinen Schere zu trennen und das Diencephalon, die Hirnhirne und die Blutgefäße mit feiner Zange aus den Hirnstücken zu entfernen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.4 mit den übrigen Embryonen. Verzögern Sie die Sezieren nicht um mehr als 2 h, um die Gewebequalität zu erhalten.
- Reinigen Sie alle Teile des Gewebehäckslers mit 100% Ethanol (insbesondere die Schneidplatte Aussenbau (PtFE) aus Polytetrafluorethylen und die Rasierklinge). Halten Sie den Gewebehäcksler 15 min lang in der laminaren Flusshaube unter UV-Beleuchtung.
- Übertragen Sie jedes Gewebestück (z.B. Kortex mit Hippocampus) auf die Schneidplatte des Gewebehäckslers. Für Hippocampus, legen Sie es senkrecht zur Rasierklinge und erhalten Gewebeabschnitte von 450-500 m Dicke.
- Bereiten Sie mehrere 35 mm Petrischalen mit 3-4 ml komplettem NCM zu und übertragen Sie Gewebestücke von der Tissue-Chopperplatte auf die Petri-Gerichte. Viele Gerichte können benötigt werden, da Regionen von Interesse seziert werden.
- Beenden Sie die Gewebesektion in der kompletten NCM mit feinen Wolframnadeln. Überprüfen Sie die Qualität der erhaltenen Scheiben unter dem Sezierendes Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Schichten in der Dunkelfeldoptik eindeutig identifizierbar sind und sezieren Sie den Interessenbereich (z. B. CA-Bereich des Hippocampus) mit Wolframnadeln. Verwerfen Sie beschädigte Scheiben. Halten Sie Hippocampus-Expflanzen in vollständigem NCM-Medium im CO2-Inkubator auf.
4. Herstellung von 3D-Kokulturen in Kollagen-Hydrogelen
- Legen Sie mehrere sterile 4-Well-Kulturplatten in die laminare Strömungshaube und bereiten Sie eine Kollagen-Arbeitsmischung vor, wie zuvor in den Schritten 1.12.2-1.12.6 angegeben.
- Legen Sie 15-20 l des Hydrogelgemisches in den Boden eines Brunnens, um eine kreisförmige Kollagenbasis zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen Schritt für den Rest der Brunnen. Bereiten Sie nicht mehr als fünf Platten gleichzeitig vor, um eine übermäßige Flüssigkeitsverdunstung von der Hydrogelbasis zu vermeiden.
- Bewahren Sie die Gerichte im Brutkasten auf, bis die vollständige Gelation (ca. 15-20 min) beobachtet wird, und nehmen Sie die Teller erst nach Abschluss der Gelation aus dem Brutkasten. Überprüfen Sie die Qualität des gegelten Kollagens.
- Übertragen Sie ein kleines Stück COS1-Zellaggregat mit einer Pipette. Legen Sie es auf die Hydrogelbasis und legen Sie ein Gewebestück auf die gleiche Basis mit einer Pipette in der Nähe des Zellstücks Aggregat bei einer Explantationsgröße.
- Bereiten Sie eine neue arbeitende Kollagenmischung auf Eis wie in den Schritten 1.12.2-1.12.6 vor.
- Sanfte Pipette 15-20 l dieser neuen Mischung und decken das Explant und Zellaggregat ab. Eine Sandwich-ähnliche Hydrogelkultur wird beobachtet. In diesem Moment, neuausrichtung die Explantation mit einer feinen Wolframnadel (berühren Sie nicht das COS1-Zellaggregat!), so dass es dem Zellaggregat bei 500-600 m gegenübersteht.
- Geben Sie die Platte in den Inkubator zurück, bis die Gelation beobachtet ist (ca. 10-15 min) und 0,5 ml vollständiger NCM, ergänzt durch 2% B27-Ergänzung, und halten Sie Kulturen für 36 bis 48 h im Inkubator (37 °C, 5% CO2).
5. Fixierung von Explant-Zell-Aggregat-Kokulturen und immunzytochemischeverfahren
- Nach 36-48 h Inkubation das Medium entfernen und mit 0,1 M Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS), pH 7,3 ausspülen. Danach die Kulturen für 1 h mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,3, bei 4 °C fixieren.
- Entfernen Sie die fixative und sanft spülen Sie die Kulturen 3-4 mal (10-15 min jeweils) in 0,1 M PB, pH 7,3.
- Lösen Sie das Hydrogel-Sandwich vom Boden des Brunnens mit Spachtel oder Zange. Übertragen Sie den Kollagenblock mit einem feinen Pinsel auf eine 6-Well-Kulturplatte mit 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Reinigungsmittel.
- Frei schwebende Hydrogele in der Blockierlösung (10% Serum, 0,5% nichtionisches Tensid und 0,2% Gelatine in 0,1 M PBS) für 2-3 h bei RT mit sanfter Rührung inkubieren.
- Spülen Sie 3 mal (jeweils 10-15 min) mit 0,1 M PBS mit 0,5% nichtionischem Tensid.
- Inkubieren Sie mit primärer Antikörper, der in PBS verdünnt ist und 5 % Serum, 0,5 % nichtionisches Tensid, 0,2 % Gelatine und 0,02 % Natriumazid enthält. Mit dem Primärantikörper für 36-48 h bei 4 °C auf einem Shaker inkubieren.
HINWEIS: Üblicherweise wird ein Antikörper gegen das A-Tubulin der Klasse III (-TUJ-1) (verdünnt 1:2.000) verwendet, um das axonale Wachstum in 3D-Hydrogelkulturen zu definieren. - Nach der Inkubation wie in Schritt 5.5 abspülen.
- Mit sekundärem Antikörper für 4 h bei RT (oder 6-7 h bei 4 °C) auf einem Shaker in 5% Serum, 0,5% nichtionisches Tensid und 0,2% Gelatine inkubieren. In diesem Experiment wird ein biotinylierter Antikörper gegen die Pferdeanti-Maus (verdünnt 1:200) verwendet.
- Spülen Sie Kulturen wie in 5.5.
- Inkubieren Sie die Kulturen für 2 Tage bei 4 °C mit Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Lösung 1:100 verdünnt in PBS mit 5% Serum, 0,5% nicht-ionischem Tensid und 0,2% Gelatine. Alternativ können Sie Meerrettichperoxidase (HRP)-getaggtes Streptavidin (verdünnt 1:300-400) im selben Puffer verwenden.
- Spülen Sie Kulturen, wie in 5.5 beschrieben.
- Spülen Sie die Kulturen mehrmals mit 0,1 M Tris-HCl Puffer, pH 7,6 für 1 h.
- Inkubieren Sie die Kulturen mit 0,03% der 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid(DAB)-Lösung in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Fügen Sie 5-8 l von 1% H2O2 hinzu und warten Sie 10-15 min. Überwachen Sie die Entwicklung von DAB unter dem Mikroskop mit einem 4-10x Objektiv.
- Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die DAB-Lösung mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6 entfernen.
- Spülen Sie die Kulturen in PBS für 30 min (mehrere Änderungen).
- Montieren Sie die Hydrogele mit wässrigen Montagemedien auf Glasschlitten.
- Analysieren Sie die Länge und Verteilung der Axone im Hydrogel mit dem Sholl-Analyse-Plug-in oder mit dem NeuriteJ-Plug-in für imageJ Software30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier stellen wir eine weithin zugängliche Methodik zur Untersuchung des axonalen Wachstums in 3-D-Hydrogel-Kollagenkulturen des embryonalen Mausnervensystems vor. Zu diesem Zweck isolierten wir Kollagen aus erwachsenen Rattenschwänzen, um 3D-Matrizen zu erzeugen, in denen wir genetisch veränderte Zellaggregate kultivierten, die Netrin-1 oder Sema3E mit embryonalem neuronalem Gewebe (z. B. CA-Region des Hippocampus) konfrontiert emittierten. Diese Zellaggregate bildeten einen radial verteilten Gradienten des Kandidatenmoleküls innerhalb der Kollagenmatrix. Um die neuronale Reaktion auf verschiedene Moleküle zu bewerten, haben wir die Kulturen mit immunzytochemischen Methoden (z. B. Kandidat für axonales Verhalten.
In unserem Experiment, als Hippocampus-Axone mit Netrin-1 konfrontiert wurden, wuchsen diese Axone bevorzugt in Richtung der Quelle von Netrin-1, was darauf hindeutet, dass Netrin-1 als chemoattraktives Molekül für diese Axone wirkt (Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu wuchsen die meisten von ihnen gegenüber dem Zellaggregat, was darauf hindeutet, dass Sema3E für sie ein chemorepulsives Molekül ist (Abbildung 1C). In der Kontrollbedingung (Mock-Transfektion) wuchsen alle Axone radial ohne Richtungspräferenz (Abbildung 1A). Abbildung 1 D-E sind schematische Darstellungen der axonalen Antwort- und Quantifizierungsmethode. Nach der Bildaufnahme zeichneten wir eine Linie in der Mitte der Explantation, die die proximalen (nahe zellakulierenden) und die distalen (gegenüber dem Zellaggregat) Quadranten abgrenzte, um das proximale/distale Verhältnis (P/D-Verhältnis) zu berechnen. Unter Den Kontrollbedingungen waren die Axone gleichmäßig in beiden Quadranten verteilt (radiales Auswuchs), was auf ein Verhältnis P/D = 1 (Abbildung 1D) hindeutete. Wenn Explanten eine erhöhte Anzahl von Axonen im proximalen Quadranten im Vergleich zum distalen (indizierten Chemoattraction) zeigten, betrug das Verhältnis P/D > 1 (Abbildung 1E) und wenn die Anzahl der Axone im distalen Quadranten höher war als im proximal (indiziert Chemorepulsion) war das Verhältnis P/D < 1 (Abbildung 1F).
Um mit dieser Technik hervorragende Ergebnisse zu erzielen, müssen wir sicherstellen, dass die Kollagenpolymerisation homogen ist, die Zelltransfektion effizient ist und der Abstand zwischen dem Gewebeexplant und dem Zellaggregat angemessen ist (siehe Diskussion).
Abschließend können wir bestätigen, dass die Erzeugung von 3D-Kollagen-basierten Hydrogelen eine nützliche Technik ist, um axonale Wachstums- und Verhaltensreaktionen auf Kandidatenleitmoleküle zu bewerten, die bei der axonalen Migration während der axonalen Migration eine wesentliche Rolle spielen können. Entwicklung des Nervensystems.
Abbildung 1 : Beispiele für Expflanzen, die in 3-D-Hydrogelen in Konfrontationsexperimenten und Quantifizierungsmethodenwachsen. (A-C) Die Explantationen wurden aus der Hippocampusregion bei E14.5 gewonnen, für 48 h in vitro kultiviert und durch Immunfärbung mit iii-Tubulin (-TUJ-1) gekennzeichnet. Unterschiede im axonalen Wachstum können visuell beobachtet werden. Bitte vergleichen Sie (A) mit (B-C). (D-E) Schematische Darstellungen der axonalen Antwort- und Quantifizierungsmethode. Gepunktete Linie begrenzt sowohl den proximalen (P) als auch den distalen (D) Quadranten, um das Verhältnis P/D zu berechnen. Verhältnis P/D = 1 stellt ein radiales Wachstumsmuster dar (D); P/D > 1 zeigt eine chemoattraktive Reaktion (E) und P/D < 1 auf einen chemorepulsiven Effekt (F). Abkürzungen: CA = CA1-3 Hippocampus-Regionen; D = distaler Quadrant; P = proximaler Quadrant. Skalenbalken = 200 m (A-C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Wachstum der Entwicklung von Axonen ist hauptsächlich invasiv und umfasst ECM-Abbau und Umbau. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Forscher eine homogene 3D-Matrix erhalten, die durch das natürliche Kollagen Typ I gebildet wird, in dem Axone (oder Zellen) auf einen chemischen Gradienten reagieren können, der von genetisch veränderten Zellen abgesondert wird, wie sie es in vivo tun. Verschiedene axonale Reaktionen auf Gradienten attraktiver oder hemmender Cues (Protein, Lipide usw.) können leicht mit einer spezifischen Kontrolle verglichen werden (Mock transfikierte Zellen). Als Vorteile müssen wir erwähnen, dass Sehnen leicht zu isolieren sind und in der Tat Reste von Tierversuchen sein können. Darüber hinaus sind Sehnen hoch kollagen i konzentriert im Vergleich zu anderen Geweben wie Haut oder Lunge31.
Obwohl die hier vorgestellte Methodik einfach durchzuführen ist, gibt es einige Schritte, die während des Prozesses besondere Aufmerksamkeit erfordern. In Bezug auf die Kollagenextraktion ist es unerlässlich, unerwünschte Blutgefäße und Hautablagerungen von Schwanzsehnen zu entfernen, um die Kollagenreinheit und die Qualität der Gelation zu verbessern. Außerdem ist es obligatorisch, sterile Bedingungen zu erhalten, indem einige Schritte unter einer sterilen laminaren Durchflusshaube ausgeführt und die chirurgischen Werkzeuge vor gebrauchen sterilisiert werden. Darüber hinaus ist es wichtig, die entsprechenden pH- und Temperaturbedingungen der Lösungen aufrechtzuerhalten. Wenn beispielsweise MEM 10x- und Bicarbonat-Lösungen nicht optimal sind, polymerisiert die Kollagenmatrix nicht homogen, so dass das axonale Wachstum und das Ergebnis negativ beeinflusst werden. Darüber hinaus, wenn die Kollagen-Stammlösung zu konzentriert oder zu verdünnt ist, werden die Matrizen nicht richtig gelieren. Unserer Erfahrung nach beträgt die beste Kollagen-Lagerkonzentration ca. 5-5,5 mg/ml Protein (quantifiziert durch ein kolorimetrisches Protein-Assay-Kit) und wir verwenden eine 3:1-Verdünnung (Kollagen: 0,1x MEM), um perfekte Hydrogelmatrizen zu erhalten. In Bezug auf die Zelltransfektion und die Zellaggregatbildung ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten und eine mögliche Kontamination zu vermeiden, beispielsweise ist die Reinigung von Plasmidvektoren mit endotoxinfreien Plasmid-DNA-Reinigungskits obligatorisch. Außerdem müssen wir betonen, dass die Transfektionsbedingungen je nach Zelltyp, Durchgangszahl und Plasmideigenschaften variieren. Hier haben wir die optimalen und routinemäßigen Bedingungen in unseren Händen berichtet. Daher sollten die Forscher die vom Hersteller angegebenen empfohlenen Konzentrationen testen oder anpassen, um ihre eigenen optimalen Bedingungen zu bestimmen.
Hinsichtlich der Probleme, die bei dieser Technik auftreten können, müssen wir bedenken, dass die 3D-Matrizen manchmal nicht die erwartete homogene gelartige Struktur aufweisen. In diesem Fall ist es wichtig, die Temperatur und den pH-Zustand der Lösungen zu überprüfen und sie zu verwerfen, falls sie falsch sind. Außerdem wird empfohlen, einen Qualitätskontrolltest durchzuführen, wie z. B. die Denaturierung der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen, um die Reinheit der Kollagenstoffpräparation zu validieren. Mit diesem Ansatz zeigt reines und unbeschädigtes Art-I-Kollagen ein typisches Migrationsmuster, das aus 2 monomeren Ketten (1 und 2), 3 dimerischen Ketten (11, 12, Variante 11) und 1 trimerischen Kette32,33besteht. Wenn das erhaltene Kollagen nicht zu diesem Muster passt, sollte es nicht verwendet werden. Schließlich können Axone nach der Immunfärbung radial verteilt erscheinen, wenn sie mit Zellen konfrontiert werden, die ein chemorepulsives oder chemoattraktives Molekül absondern. In diesem Fall muss die Wirksamkeit der Transfektion überprüft werden, indem eine Punktblotting-Technik auf dem richtigen Kokultursystem (wenn die DNA-Plasmide alkalische Phosphatase-markierte sind) oder durch Verarbeitung der Kulturmedien nach der Transfektion durch westliche Beflecken. Eine zu berücksichtigende Einschränkung ist, dass der Abstand zwischen dem Zellaggregat und dem Gewebeexplantation entscheidend ist. Wenn sie sehr weit voneinander entfernt sind, werden wir keine klare Wirkung des abgesonderten Moleküls auf das Gewebeexplant sehen können, aber wenn sie sehr nahe beieinander liegen, wird die Wirkung zu stark sein, um als gutes Ergebnis betrachtet zu werden. Aus unserer Erfahrung liegt der entsprechende Abstand bei etwa einer Explant-Größe (400-500 m), da sich der durch das Zellaggregat erzeugte molekulare Gradient radial von 400-500 'm nach 24 h in der Kultur erstrecken wird.
Alternativ kann man kommerzielle Tumor-abgeleitete ECM-Extrakt anstelle von Rattenschwanz Kollagen verwenden. In diesem Fall müssen alle Verfahren bei 4 bis 10 °C durchgeführt werden, da die Gelation von kommerziellem ECM-Extrakt temperaturabhängig ist. Daher ist besonders darauf zu achten, dass alle Kulturgerichte, Pipettenspitzen, Kulturmedien und Lösungen bei 4 °C erhalten bleiben.
Schließlich wird die hier vorgestellte Methode zwar hauptsächlich mit der Analyse neuronaler Funktionen wie axonalem Wachstum oder neuronaler Migration in Verbindung gebracht, aber auch zu einer nützlichen Technik für das pharmakologische Screening, Adhäsionstests, In-vitro-Fibrillation Experimente und Tissue Engineering Strategien34,35,36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Tom Yohannan für die redaktionelle Beratung und M. Segura-Feliu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das CERCA-Programm und die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung innovation, Universitäten und Unternehmen der Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) finanziert. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Forschung, Innovation und Universität (MEICO) über BFU2015-67777-R und RTI2018-099773-B-100, das spanische Prion-Netzwerk (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT) und das Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
- Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
- Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).
- Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
- Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
- von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
- Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
- Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
- Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
- Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
- Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
- Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
- Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
- Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
- Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
- Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
- Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
- Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
- Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
- Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
- Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
- Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
- Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
- Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).
