Summary
Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.
Abstract
Questo protocollo utilizza collagene di tipo naturale I per generare idrogel tridimensionale (3D) per il monitoraggio e l'analisi della crescita assonale. Il protocollo è incentrato sulla coltura di piccoli pezzi di cervelli embrionali o postnatali di roditori all'interno di un idrogel 3D formato dal tipo iderivato derivato dal tendine della coda di ratto con porosità specifica. I pezzi di tessuto sono coltivati all'interno dell'idrogel e confrontati con specifici frammenti cerebrali o aggregati cellulari geneticamente modificati per produrre e secernere molecole adatte per creare un gradiente all'interno della matrice porosa. I passaggi di questo protocollo sono semplici e riproducibili, ma includono passaggi critici da considerare attentamente durante il suo sviluppo. Inoltre, il comportamento degli assoni in crescita può essere monitorato e analizzato direttamente utilizzando un microscopio a contrasto di fase o un microscopio a fluorescenza mono/multifotonico dopo la fissazione mediante metodi immunocitochimici.
Introduction
Gli assoni neuronali, che terminano con coni di crescita assonale, migrano lunghe distanze attraverso la matrice extracellulare (ECM) dell'embrione su percorsi specifici per raggiungere i loro obiettivi appropriati. Il cono di crescita è la porzione distale dell'assone ed è specializzato per percepire l'ambiente fisico e molecolare della cellula1,2. Da un punto di vista molecolare, i coni di crescita sono guidati da almeno quattro diversi meccanismi molecolari: attrazione del contatto, chemioattrazione, repulsione del contatto e chemorepulsione innescata da diversi segnali di guida assonali3,4 , 5 Del numero 3( , 6. I processi mediati dal contatto possono essere parzialmente monitorati in colture bidimensionali (2D) su substrati micromodellati (ad esempio, con strisce7,8 o macchie9 contenenti le molecole). Tuttavia, gli assoni possono navigare verso il loro bersaglio in modo non diffuso rilevando diverse molecole attraenti e ripugnanti dalle cellule guidepost nell'ambiente4,5,10. Qui, descriviamo un metodo semplice della coltura 3D per verificare se una molecola secreta induce effetti chemorepulsivi o chemioattraenti sullo sviluppo degli assoni.
I primi studi miravano a determinare gli effetti dei segnali di guida assonati utilizzavano colture espiante in matrici tridimensionali (3D) per generare gradienti che simulano condizioni in vivo11,12. Questo approccio, insieme agli esperimenti in vivo, ha permesso l'identificazione di quattro grandi famiglie di spunti di orientamento: Netrins, Slits, Semaphorins ed Ephrins4,5,6. Questi segnali molecolari e altri fattori13 sono integrati dagli assoni in crescita, innescando la dinamica dei complessi di adesione e trasducindo le forze meccaniche attraverso il citoscheletro14,15,16. Per generare gradienti molecolari in colture 3D per la navigazione assonale, ricercatori pionieri hanno usato17substrati di coaguli di plasma, che è stato utilizzato anche per preparazioni di fette organotipiche18. Tuttavia, nel 1958, un nuovo protocollo per generare idrogel di collagene 3D è stato segnalato per lo studio con i dispositivi di Maximow19, una piattaforma di coltura, utilizzata in diversi studi adatti per osservazioni microscopiche20. Un altro studio pionieristico ha riportato il gel di collagene come strumento per incorporare i fibroblasti umani per studiare la differenziazione dei fibroblasti nei miofibroblasti nei processi di guarigione delle ferite21. Parallelamente, Lumsden e Davies hanno applicato il collagene dal derma bovino per analizzare l'effetto putativo del fattore di crescita del nervo (NGF) sulla guida delle fibre nervose sensoriali22. Con lo sviluppo di nuove piattaforme di cultura (ad esempio, piatti multi-pozzi) da diverse aziende e laboratori, le colture di collagene sono state adattate a questi nuovi dispositivi6,23,24,25 ,26. Parallelamente, un estratto di materiale ECM derivato dalla linea di cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm è stato reso disponibile in commercio per espandere questi studi27.
Recentemente, sono stati sviluppati diversi protocolli per generare gradienti molecolari con ruoli putativi nella guida degli assa utilizzando idrogel 3D (ad esempio, collagene, fibrina, ecc.) 28.In alternativa, la molecola candidata può essere immobilizzata a concentrazione diversa in una matrice porosa (ad esempio, NGF29) o generata dalla coltura in una piccola regione degli aggregati di cellule idrogel 3D che secerneno la molecola per generare un gradiente4,23,24,25,26. L'ultima possibilità sarà spiegata in questo protocollo.
La procedura qui presentata è un metodo facile, veloce e altamente riproducibile basato sull'analisi della crescita assonale nelle colture di idrogel 3D del cervello embrionale del topo. Rispetto ad altri metodi, il protocollo è adatto per i ricercatori non addestrati e può essere completamente sviluppato dopo una breve formazione (1-2 settimane). In questo protocollo, isoliamo prima il collagene dalle code di ratto adulto per generare ulteriormente matrici 3D in cui gli aggregati cellulari geneticamente modificati vengono coltivati davanti al tessuto neuronale embrionale. Questi aggregati cellulari formano gradienti chimici radiali di una molecola candidata che suscita una risposta per gli assoni in crescita. Infine, la valutazione degli effetti della molecola sugli assoni in crescita può essere facilmente eseguita utilizzando una microscopia a contrasto di fase o, in alternativa, metodi immunocitochimici.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida e i protocolli del Comitato Etico per la sperimentazione animale (CEEA) dell'Università di Barcellona, e il protocollo per l'uso dei roditori in questo studio è stato rivisto e approvato dalla CEEA del Università di Barcellona (approvazione CEEA #276/16 e 141/15).
1. Purificazione del collagene coda di ratto
- Raccogli le code di ratto Sprague-Dawley adulti (8-9 settimane) dopo aver sacrificato l'animale seguendo le linee guida etiche e risciacqualo nel 95% di etanolo. Mettere 2-4 code sul ghiaccio (4 gradi centigradi) e tenerle coperte di ghiaccio durante il processo.
- Per ottenere i tendini della coda, fissare la coda alle vertebre più caudali della coda utilizzando un emostatore e comprimere la coda con un secondo emostatorio posizionato intorno a 5-7 mm dal primo. Rompere la coda torcendola bruscamente con entrambi gli hemostats. Per fare questo, piegare / aprire le vertebre più volte fino a quando non si rompe.
- Tirare le vertebre lentamente con l'emotoma per staccare i tendini dalla loro guaina come esce. In questo momento, tagliare i tendini con piccole forbici. Conservare questi pezzi di tendine in una parabola Petri sterile da 100 mm sul ghiaccio.
- Ripetere la serlatura e lo scorrimento per il resto della coda fino a quando i tendini sono completamente estratti.
- Ripetere i passaggi da 1.2-1.4 per tutte le code ottenute.
- Osservare i tendini al microscopio. Scartare i vasi sanguigni tagliando con piccole forbici e tenendo con pinze fini dritte per migliorare la purezza del tendine e risciacquare i tendini 3 volte con acqua ultrapura.
- Raccogliere 3-4 g di tendini bagnati. Sciogliere i tendini in 150 mL di 3% di acido acetico glaciale a 4 gradi centigradi in una fiaschetta conica di vetro da 200-250 mL per 24-36 h, sotto agitazione delicata.
- Centrifuga a 20.000 x g per 1 h. Parallelamente, preparare la membrana del tubo di dialisi tagliando un pezzo di circa 10-15 cm di lunghezza e farla bollire in acqua ultrapura contenente 1 mM di acido etilenediaminetraatico (EDTA) per 15 min. Successivamente, sciacquare delicatamente la membrana di dialisi accuratamente con acqua ultrapura.
- Dopo la centrifuga, raccogliere il supernatante nella membrana di tubazione di dialisi per decantazione. Il pellet contiene materiale acido insolubile (proteine non collagenose) e il supernatante contiene proteine di collagene solubili.
- Diallyze il supernatante contro 2 L di sterile 0.1x Minimo Essenziale Medio Aquila (MEM), pH 4.0 in un bicchiere di vetro da 2-5 L. Dialyze per 3 giorni. Modificare la soluzione MEM 0,1x almeno due volte al giorno controllando il pH ad ogni modifica prima dell'uso. Se il pH è diventato di base, modificarlo con qualche goccia di acido acetico 0,1 M fino a 4,0.
- Dopo la dialisi, aggiungere antibiotici (1,5 mL di penicillina/streptomicina (Pen-Strep)) alla soluzione di collagene dializzato. Fare 5 aliquote mL della soluzione di brodo di collagene e conservare a 4 gradi centigradi.
NOT: Da questo punto, tutte le procedure di movimentazione devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di flusso laminare. -
Procedere con il test di gelazione della soluzione di brodo di collagene preparato seguendo i passaggi successivi.
- Poiché il collagene di stock è solitamente troppo concentrato, preparare 3 diluizioni di lavoro (75%, 50% e 25% soluzione di collagene) diluindo lo stock in 0.1x MEM, pH 4.0. Il volume finale consigliato per ogni diluizione di lavoro è di 5 mL. In ogni condizione, controllare la concentrazione proteica utilizzando un saggio colorimetrico della proteina.
- Posizionare diversi tubi di centrifuga conicali da 1,5 ml vuoti (uno per ogni diluizione di lavoro), 10 volte tubi MEM, soluzione di bicarbonato di sodio 7,5% e diverse diluizioni di lavoro di collagene sul ghiaccio. Attendere che questi siano raffreddati.
- Aggiungete 40-50 l una di 10 volte il MEM ad un tubo di centrifuga freddo (4 gradi centigradi). Successivamente, mescolare delicatamente con 7-8 - L di soluzione di bicarbonato di sodio.
- Aggiungere 310-330 l di uno dei diversi diluizioni di collagene in questo tubo e mescolare delicatamente con la pipetta evitando qualsiasi formazione di bolle. Conservare la miscela di bicarbonato di collagene-MEM-sodio sul ghiaccio (4 gradi centigradi) per almeno 5 min.
- Pipetta 10-25 - L della miscela in una piastra Petri da 35 mm.
- Collocare la parabola Petri nell'incubatrice di CO2 fissata a 37 gradi centigradi fino a quando non si osserva la gelata dell'idrogel (15-20 min).
- Ripetere i passaggi da 1.12.3-1.12.6 per le restanti diluizioni di collagene in diversi piatti Petri.
- Selezionare la diluizione di lavoro collagene che rende i migliori risultati.
NOT: Il miglior idrogel gelato dovrebbe avere una texture traslucida uniforme, colore grigio e non deve essere grumoso o filante. Nella nostra esperienza, una diluizione di 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) genera i migliori risultati sperimentali.
2. Preparazione delle cellule (COS1) Aggrega geneticamente modificata per secernere una molecola candidata in idrogel di collagene 3-D
- Piastra 2 x 106 cellule COS1 in un piatto Petri 35 mm e incubare con mezzo di coltura completo composto da 100 mL di D-MEM contenente 10% (vol/vol) siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,5% (wt/vol) glutammina e 1% (wt/vol) Pen/Strep in una coltura cellulare incubatrice, al fine di raggiungere 70-80% confluenza durante la notte. Preparare una piastra Petri per ogni procedura di trasfezione.
-
Il giorno seguente trasfecare le cellule COS1 con il DNA che codifica la molecola candidata (Netrin-1 o Sema3E) utilizzando il metodo di trasfezione a base di liposoma seguendo le istruzioni del produttore.
- Per fare questo, mescolare 250 l di mezzo senza siero e DNA (1-2 g per condizione) in un tubo di centrifuga di 1,5 mL (tubo di DNA) e mescolare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Preparare un secondo tubo (tubo liposomico) aggiungendo 240 L del mezzo senza siero e 10 L del reagente di trasfezione liposomica. Incubare a RT per 5 min.
- Dopo l'incubazione, aggiungere il contenuto del tubo del DNA al tubo liposomico e mescolare delicatamente. Ora incubare a RT per 15 min. Sostituire il mezzo sulle cellule coltivate con 1,5 mL del mezzo senza siero e aggiungere la miscela di DNA-liposomi al piatto Petri lentamente goccia. Incubare per 3 h nell'incubatore di coltura cellulare CO 2.
- Dopo 3 h di incubazione trasfezione, sostituire il mezzo con il mezzo di coltura completo e incubare durante la notte nell'incubatrice.
- Il giorno successivo, sciacquare le cellule con 0,1 M di Soffato bufferizzato salina (D-PBS), trattare le colture con Trypsin-EDTA (800 dollari per ogni piatto per 5-15 min nell'incubatrice di CO 2) e raccogliere le cellule staccate con 15 mL di mezzo di coltura completo.
- Centrifugare le cellule a 4 gradi centigradi a 130 x g per 5 min. Dopo la centrifuga, rimuovere i supporti e conservare il pellet contenente le cellule COS1 sul ghiaccio.
- Ripetere i passaggi 1.12.3-1.12.6 per preparare la miscela di lavoro del collagene.
- Aggiungete 100-150 l di miscela di collagene al pellet delle cellule trasfetate e mescolate delicatamente pipetting su e giù e stendete 45-50 l di questa miscela su una piastra Petri (di35 mm di diametro) per formare una banda uniforme di collagene di circa 1-1,5 cm di lunghezza. Collocare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi centigradi (5% CO2) fino a quando non si osserva la gelazione (15-20 min).
- Preparare una seconda striscia contenente le celle di controllo (trasfezione simulata) in una seconda parabola di coltura e piattarlo nell'incubatrice (15-20 min) e quando la gelazione è completata aggiungere 3-4 mL di misura di coltura completa cos1 riscaldata (37 gradi centigradi) ad ogni piatto contenente il piatto gelledo strisce di cellule di collagene e tenerli nell'incubatore di coltura cellulare CO 2. Successivamente, tagliare le strisce di collagene-cellule per generare piccoli pezzi quadrati (400 a 500 m di lunghezza) utilizzando un bisturi fine o un chopper di tessuto.
- Trasferire tutte le sezioni dalla stessa condizione di trasfezione a una parabola Petri contenente 3-3,5 mL di mezzi di coltura neuronale (NCM) e controllare sotto un microscopio di dissezione la qualità dei pezzi. Ancora una volta, tenerli nell'incubatore di coltura cellulare CO 2.
NOT: Il mezzo di coltura neuronale è costituito da un mezzo Neurobasal contenente 1-5% (vol/vol) di siero di cavallo inattivato dal calore, 2 mM glutammina, 0,5% di glucosio (wt/vol), soluzione Pen-Strep (wt/vol) e 0,044% (wt/vol) NaHCO3. Assicurarsi che il pH sia compreso tra 7,2 e 7,3.
3. Generazione di espiante embrionali per la cultura
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, maniglia della lama del bisturi, pinze dritte e curve) automatizzando seguendo le linee guida di sterilizzazione di routine. In parallelo preparare 500 mL del buffer di glucosio bilanciato della soluzione sale di Hank e 4-5 piatti Petri (100 mm di diametro) contenenti 10 mL di HBSS-G. Collocare queste piastre sul ghiaccio (4 gradi centigradi).
- Sacrificare il ratto femminile incinta (giorno embrionale 16.5) al di fuori dell'area sterile, seguendo le procedure etiche approvate. Tagliare le corna degli embrioni con le forbici dalla cavità addominale e metterle in una grande tegame Petri contenente HBSS-G freddo.
- Posizionare il piatto nel cofano a flusso laminare ed estrarre gli embrioni con pinze dritte. Metteteli in un nuovo piatto contenente HBSS-G freddo. Successivamente, rimuovere la pelle dell'embrione utilizzando piccole pinze e sezionare attentamente il cervello utilizzando le pinze curve e dritte. Metteteli in un piatto contenente HBSS-G freddo.
- Sotto un microscopio dissecinte, tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana per separare entrambi gli emisferi con il bisturi o forbici sottili e rimuovere il diencefalo, le meningi e i vasi sanguigni dai pezzi cerebrali con pinze sottili.
- Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,4 con il resto degli embrioni. Non ritardare la dissezione per più di 2 h per preservare la qualità del tessuto.
- Pulire tutte le parti dell'elicottero tissutale con la piastra di taglio 100% etanolo (soprattutto la piastra di taglio in politetrafluoroetilene (PTFE) e la lama del rasoio. Mantenere l'elicottero dei tessuti nel cappuccio del flusso laminare sotto illuminazione UV per 15 min.
- Trasferire ogni pezzo di tessuto (ad esempio, corteccia con ippocampo) alla piastra di taglio dell'elicottero di tessuto. Per l'ippocampo, posizionarlo perpendicolare alla lama del rasoio e ottenere sezioni di tessuto di 450-500 m di spessore.
- Preparare diversi piatti Petri da 35 mm con 3-4 mL di NCM completo e trasferire pezzi di tessuto dal piatto di tessuto chopper ai piatti Petri. Molti piatti possono essere necessari come regioni di interesse sono sezionati.
- Finire la dissezione dei tessuti nel NCM completo utilizzando aghi di tungsteno fini. Controllare la qualità delle fette ottenute al microscopio sezionato. Assicurarsi che gli strati siano chiaramente identificabili nell'ottica del campo scuro e sezionare la regione di interesse (ad esempio, la regione CA dell'ippocampo) con aghi di tungsteno. Eliminare le fette danneggiate. Conservare gli espianti ippocampali in un supporto NCM completo nell'incubatrice di CO 2.
4. Preparazione di coculture 3D in idrogel di collagene
- Mettere diverse piastre di coltura sterili a 4 pozze nella cappa di flusso laminare e preparare una miscela di lavoro di collagene come indicato in precedenza nei passaggi 1.12.2-1.12.6.
- Collocare 15-20 l della miscela di idrogel sul fondo di un pozzo per produrre una base circolare di collagene. Ripetere questo passaggio per il resto dei pozzetto. Non preparare più di cinque piastre contemporaneamente per evitare un'eccessiva evaporazione liquida dalla base idrogel.
- Conservare i piatti nell'incubatrice fino a quando non viene osservata la gelazione completa (15-20 min) e togliere i piatti dall'incubatrice solo quando la gelazione è completata. Controllare la qualità del collagene gelificato.
- Trasferire un piccolo pezzo di aggregato di cellule COS1 con una pipetta. Posizionarlo sulla base idrogel e posizionare un pezzo di tessuto sulla stessa base con una pipetta vicino al pezzo di cellule aggregate in una dimensione di explant.
- Preparare una nuova miscela di collagene funzionante sul ghiaccio come nei passi 1.12.2-1.12.6.
- Delicatamente pipetta 15-20 - L di questa nuova miscela e coprire l'espianto e l'aggregato cellulare. Si osserverà una coltura di idrogel simile a un sandwich. In questo momento, riorientare l'espianto con un ago di tungsteno fine (non toccare l'aggregazione di celle COS1!), in modo che si trovi di fronte all'aggregato cellulare a 500-600 m.
- Riportare la piastra all'incubatrice fino a quando non si osserva la gelazione (10-15 min) e 0,5 mL di NCM completo integrato con 2% supplemento B27 e mantenere le colture per 36 a 48 h nell'incubatrice (37 , 5% CO2).
5. Fissazione delle cocolture aggregate delle cellule espiantate e della procedura immunocitochimica
- Dopo 36-48 h di incubazione, rimuovere il mezzo e risciacquare con 0,1 M fosfato buffered salina (PBS), pH 7.3. Successivamente, fissare le colture per 1 h con 4% paraformaldeide in buffer di fosfato da 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere il fissativo e sciacquare delicatamente le colture 3-4 volte (10-15 min ciascuna) in 0,1 M PB, pH 7.3.
- Staccare il panino idrogel dal fondo del pozzo con spatola o pinze. Trasferire il blocco di collagene con un pennello fine in una piastra di coltura a 6 piani contenente 0,1 M PBS con detergente non ionico dello 0,5%.
- Incubare idrogel galleggianti nella soluzione di blocco (10% siero, 0,5% surfactant non ionico e 0,2% gelatina in 0,1 M PBS) per 2-3 h a RT con agitazione delicata.
- Risciacquare 3 volte (10-15 min ciascuna) con 0,1 M PBS contenente lo 0,5% di sovrapfattimento non ionico.
- Incubazione con anticorpo primario diluito in PBS contenente 5% siero, 0.5% surfactant non-ionico, 0.2% gelatina, e 0.02% azide di sodio. Incubare con l'anticorpo primario per 36-48 h a 4 gradi centigradi su uno shaker.
NOT: Di solito un anticorpo contro la classe III tubulina (z-TUJ-1) (diluito 1:2,000) viene utilizzato per definire la crescita assonale nelle colture di idrogel 3D. - Dopo l'incubazione, risciacquare come nel punto 5.5.
- Incubare con anticorpo secondario per 4 h a RT (o 6-7 h a 4 gradi centigradi) su uno shaker diluito nel 5% di siero, 0,5% surfactant non-ionico e 0,2% gelatina. In questo esperimento viene utilizzato un anticorpo biotinylato antito-toepe (diluito 1:200) di cavallo.
- Risciacquare le culture come in 5.5.
- Incubare le colture per 2 giorni a 4 gradi centigradi con la soluzione complessa avidina-biotina (ABC) 1:100 diluita in PBS contenente il 5% di siero, lo 0,5% di surfactant non ionico e lo 0,2% di gelatina. In alternativa, utilizzare lo streptavidina con etichetta di rafano (HRP) (diluito 1:300-400) nello stesso buffer.
- Risciacquare le culture come descritto in 5.5.
- Risciacquare le colture più volte con buffer Tris-HCl da 0,1 M, pH 7,6 per 1 h.
- Incubare le colture con lo 0,03% della soluzione DAB (3,3-Diaminobenzidine tetraidrocchiride) in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
- Aggiungere 5-8 luna di 1% H2O2 e attendere 10-15 min. Monitorare lo sviluppo del DAB al microscopio utilizzando un obiettivo 4-10x.
- Interrompere la reazione rimuovendo la soluzione DAB con buffer Tris-HCl da 0,1 M, pH 7.6.
- Risciacquare le colture in PBS per 30 min (diversi cambiamenti).
- Montare gli idrogel su vetrini di vetro utilizzando un supporto di montaggio acquoso.
- Analizzare la lunghezza e la distribuzione degli assoni all'interno dell'idrogel utilizzando Sholl analysis plug-in o con NeuriteJ plug-in per il software ImageJ30.
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Representative Results
Qui, presentiamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare la crescita assonale nelle colture di collagene idrogel 3D del sistema nervoso murino embrionale. A tal fine, abbiamo isolato il collagene dalle code di ratto adulto per generare matrici 3D in cui abbiamo coltivato aggregati cellulari geneticamente modificati che esprimevano Netrin-1 o Sema3E di fronte al tessuto neuronale embrionale (ad esempio, ca regione dell'ippocampo). Questi aggregati cellulari formavano un gradiente distribuito radialmente della molecola candidata all'interno della matrice del collagene. Infine, per valutare la risposta neuronale a diverse molecole, abbiamo etichettato le colture usando metodi immunocitochimici (ad es. candidato per comportamento assonale.
Nel nostro esperimento, quando gli assoni ippocampali si confrontarono con Netrin-1, questi assoni sono cresciuti preferenzialmente verso la fonte di Netrin-1 che indica che Netrin-1 agisce come una molecola chemioattraente per questi assoni (Figura 1B). Al contrario, quando gli assoni ippocampali si confrontavano con le cellule sema3E-secreting, la maggior parte di loro è cresciuta opposta all'aggregato cellulare indicando che Sema3E è una molecola chemorepulsiva per loro (Figura 1C). Nella condizione di controllo (trasfezione simulata), tutti gli assoni sono cresciuti radialmente senza alcuna preferenza direzionale (Figura 1A). Figura 1 D-E sono rappresentazioni schematiche del metodo di risposta e quantificazione assonale. Dopo l'acquisizione dell'immagine, abbiamo disegnato una linea al centro dell'espianto che ha delimitato il proxy (vicino all'aggregato cellulare) e i quadranti distale (opposto all'aggregato cellulare) al fine di calcolare il rapporto prossimale/distale (rapporto P/D). In condizioni di controllo, gli assoni sono stati distribuiti equamente in entrambi i quadranti (escrescenza radiale) che indicavano un rapporto P/D - 1 (Figura1D). Quando gli espiatori mostravano un aumento del numero di assoni nel quadrante prossimale rispetto al quadrante dissifisso (che indica la chemioattrazione) il rapporto era P/D > 1 (Figura 1E) e quando il numero di assoni era più alto nel quadrante dislocante rispetto al proximal (che indica la chemorepulsione) il rapporto era P/D < 1 (Figura 1F).
Al fine di ottenere risultati eccellenti con questa tecnica, dobbiamo fare in modo che la polimerizzazione del collagene sia omogenea, che la trasfezione cellulare sia efficiente e la distanza tra l'espianto dei tessuti e l'aggregato cellulare sia appropriata (vedere Discussione).
In conclusione, possiamo confermare che la generazione di idrogel a base di collagene 3D è una tecnica utile per valutare la crescita assonale e le risposte comportamentali alle molecole di guida candidate che possono svolgere ruoli essenziali nella migrazione assonale durante sviluppo del sistema nervoso.
Figura 1 : Esempi di espianti che crescono in idrogel 3D in esperimenti di confronto e metodi di quantificazione. (A-C) Gli espiantati sono stati ottenuti dalla regione dell'ippocampo all'E14.5, coltivati per 48 h in vitro, ed etichettati con z-tubulina-TUJ-1 per immunostaining. Le differenze nella crescita assonale possono essere osservate visivamente. Confrontare (A) con (B-C). (D-E) Rappresentazioni schematiche del metodo di risposta e quantificazione assonale. La linea punteggiata delimita sia il quadrante del proxy (P) che quello distale (D) per calcolare il rapporto P/D. Ratio P/D - 1 rappresenta un modello radiale di crescita (D); P/D > 1 indica una risposta chemioattraente (E) e P/D < 1 indica un effetto chemorepulsivo (F). Abbreviazioni: CA regioni ippocampali CA1-3; D - quadrante disalare; P - quadrante prossimale. Barre della scala: 200 m (A-C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La crescita degli assoni in via di sviluppo è principalmente invasiva e comprende la degradazione e il rimodellamento dell'ECM. Utilizzando la procedura qui presentata, i ricercatori possono ottenere una matrice omogenea 3D formata dal collagene di tipo naturale I in cui gli assoni (o le cellule) possono rispondere a un gradiente chimico secreto da cellule geneticamente modificate come fanno in vivo. Diverse risposte assonali a gradienti di segnali attraenti o inibitori (proteine, lipidi, ecc.) possono essere facilmente paragonati a un controllo specifico (cellule trasfettate fittizie). Come vantaggi, dobbiamo ricordare che i tendini sono facili da isolare e in effetti possono essere resti di sperimentazione animale. Inoltre, i tendini sono altamente collagene Ho concentrato rispetto ad altri tessuti come la pelle o polmone31.
Anche se la metodologia qui presentata è semplice da eseguire, ci sono alcuni passaggi che richiedono particolare attenzione durante il processo. Per quanto riguarda l'estrazione del collagene, è imperativo rimuovere i vasi sanguigni indesiderati e i detriti della pelle dai tendini della coda al fine di migliorare la purezza del collagene e la qualità della gelazione. Inoltre, è obbligatorio mantenere condizioni sterili eseguendo alcuni passaggi sotto una cappa sterile a flusso laminare e sterilizzando gli strumenti chirurgici prima dell'uso. Inoltre, è importante mantenere il pH appropriato e le condizioni di temperatura delle soluzioni. Ad esempio, se le soluzioni MEM 10x e bicarbonato non sono ottimali, la matrice di collagene non polimerizzerà omogenea e, di conseguenza, la crescita e il risultato assonale saranno influenzati negativamente. Inoltre, se la soluzione di brodo di collagene è troppo concentrata o troppo diluita, le matrici non si gelano correttamente. Nella nostra esperienza, la migliore concentrazione di brodo di collagene è di circa 5-5,5 mg/mL di proteine (quantificate da un kit di analisi proteica colorimetrica) e usiamo una diluizione 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) per ottenere matrici di idrogel perfette. Per quanto riguarda la trafezione cellulare e la formazione di aggregati cellulari, è importante mantenere condizioni sterili ed evitare possibili contaminazioni, ad esempio, è obbligatorio purificare i vettori plasmide con kit di purificazione del DNA privi di endotossina. Inoltre, dobbiamo sottolineare che le condizioni di trasfezione variano a seconda del tipo di cellula, del numero di passaggio e delle caratteristiche del plasmide. Qui, abbiamo segnalato le condizioni ottimali e di routine nelle nostre mani. Pertanto, i ricercatori dovrebbero testare le concentrazioni raccomandate indicate dal produttore o regolarle per determinare le proprie condizioni ottimali.
Per quanto riguarda i problemi che possono sorgere con questa tecnica, dobbiamo considerare che a volte le matrici 3D non presentano la struttura omogenea simile al gel previsto. In questo caso, è importante controllare la temperatura e la condizione di pH delle soluzioni e scartarle nel caso in cui non sia corretto. Inoltre, si raccomanda di eseguire un test di controllo di qualità come la disartura dell'elettroforesi del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) in condizioni di riduzione per convalidare la purezza della preparazione dello stock di collagene. Con questo approccio, il collagene di tipo puro e non danneggiato mostra un tipico modello di migrazione costituito da 2 catene monomeriche , 33 (n. 1 e 2), 3 catene dimerici (11, 12, variante n. 11) e 1 trimeric - catena32,33. Se il collagene ottenuto non si adatta a questo modello, non deve essere utilizzato. Infine, dopo l'immunostaining, gli assoni possono apparire distribuiti radialmente quando si confrontano con cellule che secernono una molecola chemorepulsiva o chemiobolista. In questa situazione, l'efficienza della trasfezione deve essere verificata eseguendo una tecnica di fusione dei punti sul sistema di co-coltura corretto (se i plasmidi del DNA sono etichettati con fosfatoalfo) o elaborando i mezzi di coltura dopo la trasfezione da parte occidentale Blotting. Una limitazione da considerare è che la distanza tra l'aggregato cellulare e l'espianto del tessuto è cruciale. Se sono molto distanti, non saremo in grado di vedere alcun chiaro effetto della molecola secreta sull'espianto del tessuto, ma se sono molto vicini l'uno all'altro, l'effetto sarà troppo forte per essere considerato come un buon risultato. Dalla nostra esperienza, la distanza appropriata è di circa un'estradizione di dimensioni (400-500 m) perché il gradiente molecolare generato dall'aggregato cellulare si estenderà radialmente da lungo 400-500 m dopo 24 ore di coltura.
In alternativa, si può utilizzare l'estratto ECM derivato da tumore commerciale invece del collagene coda di ratto. In tal caso, tutte le procedure devono essere eseguite tra i 4 e i 10 gradi centigradi, poiché la gelazione dell'estratto eCM commerciale dipende dalla temperatura. Pertanto, è necessario prestare particolare attenzione per garantire che tutti i piatti di coltura, i suggerimenti per le pipette, i mezzi di coltura e le soluzioni siano mantenuti a 4 gradi centigradi.
Infine, anche se il metodo qui presentato è principalmente associato all'analisi delle funzioni neuronali come la crescita assonale o la migrazione neuronale, diventa anche una tecnica utile per lo screening farmacologico, i saggi di adesione, la fibrillazione in vitro esperimenti e strategie di ingegneria tissutale34,35,36.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Tom Yohannan per la consulenza editoriale e M. Segura-Feliu per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal programma CERCA e dalla Commissione per le Università e la Ricerca del Dipartimento di Innovazione, Università ed Impresa della Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero spagnolo della ricerca, dell'innovazione e dell'Università (MEICO) attraverso BFU2015-67777-R e rti2018-099773-B-100, la rete prione spagnola (Prionet Spagna AGL2017-90665-REDT), e l'Istituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB) | Sigma | D5905 | |
| Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) | Vector Labs | PK-4000 | |
| B27 serum-free supplement 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| cDNA plasmid vectors | |||
| COS1 cell lines | ATTC | CRL-1570 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 16325 | |
| D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium | Sigma | G8769 | |
| D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium | Invitrogen | 41966-029 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2++) (D-PBS) for cultures | Invitrogen | 14200 | |
| Ethanol | merck | 108543 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 17984-25 | |
| Gelatin powder | Sigma | G1890 | |
| Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008) | Panreac | 211008 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 24020083 | |
| Heat-inactivated foetal bovine serum | Invitrogen | 10108-165 | |
| Heat-inactivated horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water) | Sigma | 316989 | |
| L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium | Invitrogen | 25030-024 | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5) | Criffa-Credo, Lyon, France | ||
| Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Invitrogen | 11012-044 | |
| Monoclonal antibody against class III β-tubulin (clone TUJ-1) | Biolegend | 801201 | |
| N-2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 1,040,051,000 | |
| Penicillin/streptomycin solution 100x | Invitrogen | 15140-22 | |
| Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry | Invitrogen | AM9624 | |
| Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse | Vector Labs | BA-2000 | |
| Serum-free medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 11058-021 | |
| Sodium azide | Panreac | 162712 | |
| Sodium bicarbonate solution 7.5% | Invitrogen | 25080-094 | |
| Sterile culture grade H2O | Sigma | W3500 | |
| TritonTM X-100 | Sigma | X100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Equipment | |||
| 1 large and 1 small curved scissors for dissection | Fine tools Instruments or similar | ||
| 1.5 mL conical centrifuge tubes | Eppendorf or similar | ||
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning or similar | ||
| 2 haemostats | Fine tools Instruments or similar | ||
| 2 small straight dissecting scissors | Fine tools Instruments or similar | ||
| 200 mL centrifuge tubes for centrifugation | Nalgene or similar | ||
| 200 mL sterile glass conical flasks | |||
| 2 L glass beaker | |||
| 4- and 6-well culture plates | Nunc | 176740 and 140675 | |
| Automatic pipette pumps and disposable 10 mL and 25 mL filter-containing sterile plastic pipettes. | Gilson, Brand, Eppendorf or similar | ||
| Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips | Gilson, Eppendorf or similar | ||
| Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 mL tube adaptors) | Eppendorf, Beckman Coulter or similar | ||
| Cell culture incubator at 37 °C, 5% CO2 and 95% air | |||
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma | D9402 | |
| Dialysis tubing closures | Sigma | Z37101-7 | |
| Disposable glass pipettes | |||
| Dissecting microscope with dark field optics | Olympus SZ51 or similar | ||
| High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor | |||
| Laminar flow hood | |||
| Large 100 mm, 60 mm and small 35 mm Ø cell culture dishes | Nunc | 150679 , 150288 and 150318, respectively | |
| Magnetic stirrer and magnetic spin bars | IKA or similar | ||
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering | ||
| One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps | Fine tools Instruments or similar | ||
| Razor blades for the tissue chopper | |||
| Scalpels (number 15 and 11) | |||
| Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces | Fine tools Instruments or similar |
References
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