Summary

Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

Published: June 12, 2019
doi:

Summary

Pinselzellen sind seltene cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die in der naiven Maustrache gefunden werden. Aufgrund ihrer begrenzten Anzahl ist die Ex-vivo-Bewertung ihrer funktionellen Rolle bei der Atemwegsimmunität und dem Umbau eine Herausforderung. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen durch Durchflusszytometrie.

Abstract

Trachealbürstenzellen sind cholinerge chemosensorische Epithelzellen, die bereit sind, Signale aus dem Atemwegslumen an das Immunsystem und das Nervensystem zu übertragen. Sie sind Teil einer Familie von chemosensorischen Epithelzellen, die Tuffsteinzellen in der Darmschleimhaut, Bürstenzellen in der Luftröhre und einsame chemosensorische und mikrovillous Zellen in der Nasenschleimhaut enthalten. Chemosensorische Zellen in verschiedenen Epithelkompartimenten teilen sich wichtige intrazelluläre Marker und eine transkriptionelle Kernsignatur, weisen aber auch eine signifikante transkriptionelle Heterogenität auf, die wahrscheinlich die lokale Gewebeumgebung widerspiegelt. Die Isolierung von Trachealbürstenzellen aus einzelzelligen Suspensionen ist erforderlich, um die Funktion dieser seltenen Epithelzellen im Detail zu definieren, aber ihre Isolierung ist eine Herausforderung, möglicherweise aufgrund der engen Wechselwirkung zwischen Trachealbürstenzellen und Nervenenden oder aufgrund der luftwegspezifischen Zusammensetzung von engen und haftenden Kreuzungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von Bürstenzellen aus Maustrachealepithel. Das Verfahren basiert auf einer anfänglichen Trennung des Trachealepithels von der Submucosa, was eine spätere kürzere Inkubation des Epithelblatts mit Papain ermöglicht. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und bequeme Lösung für die zytometrische Durchflusssortierung und funktionelle Analyse lebensfähiger Trachealbürstenzellen.

Introduction

Pinselzellen gehören zu einer Klasse von chemosensorischen Epithelzellen, die sich durch die Expression von bitteren Geschmacksrezeptoren und der Geschmacksrezeptor-Transduktionsmaschinerie in Geschmacksknospenzellen auszeichnen. Im Gegensatz zu Geschmacksknospenzellen sind chemosensorische Epithelzellen in epithelialen Oberflächen verstreut und werden als einsame chemosensorische Zellen (SCCs) und mikrovillous Zellen im Nasenepithel1,2, Bürstenzellen in der Luftröhre bezeichnet 3,4und Büschelzellen im Darm5,6. Epithelzellen, die bittere Geschmacksrezeptoren und die bitteren Geschmackstransduktionsmaschinen exdrücken, finden sich auch in der Harnröhre7,8 und der Gehörröhre9. Atemwegsbürstenzellen haben einzigartige Funktionen in neurogenen und immunen Atemwegsreaktionen. Sie sind Acetylcholin-produzierende Chemosensorienzellen, die bei Aktivierung mit Bitterverbindungen und bakteriellen Metaboliten wie quorum-sensing Substanzen10schützende Atemreflexe evozieren. Atemwegsbürstenzellen sind auch die dominante Atemwegsepithelquelle von IL-25, die aeroallergen-entlöste Typ-2-Entzündungen in den Atemwegen reguliert3.

Die Charakterisierung des vollständigen Transkriptoms der unteren Atemwegsbürstenzellen und ihre Reaktion auf Umweltreize wurde durch ihre geringe Anzahl im Trachealepithel und sehr begrenzte Zahlen über die großen Bronchien hinaus begrenzt10. Techniken zur Isolierung von chemosensorischen Zellen aus dem Darmepithel haben keine proportional hohen Zahlen aus der Luftröhre ergeben, möglicherweise aufgrund der intimen Kontakte von Trachealbürstenzellen mit Nervenenden10 oder anderen gewebespezifische Faktoren in der Atemschleimhaut wie die Zusammensetzung von Aufenthalten und engen Knotenproteinen. Jüngste Berichte über eine erfolgreiche Isolierung von Trachealbürstenzellen in höheren Zahlen für die einzellige RNA-Sequenzierungsanalyse verwendeten entweder eine 2 h Inkubation mit Papain oder eine 18 h Inkubation mit Pronase11,12. Da längere Inkubationen mit Verdauungsenzymen die Zelllebensfähigkeit verringern und das Transkriptionsprofil von Zellen aus verdauten Geweben verändern können13, könnte dies eine vergleichende Analyse mit anderen chemosensorischen Epithelpopulationen vortragen.

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Trachealbürstenzellen zur RNA-Sequenzierung3. Die Behandlung der Luftröhre mit hochdosierter Dispase trennt das Epithel von der Submucosa. Die anschließende Verdauung des Epithelblatts mit Papain ermöglicht eine hervorragende Rückgewinnung dieser Strukturzelle.

Protocol

Stellen Sie vor der Durchführung der folgenden Experimente sicher, dass alle Tierpflege- und -protokolle vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem “Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortiere” (8. Auflage, 2011) und die ARRIVE-Richtlinien. Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung im Brigham and Women es Hospital überprüft und genehmigt. <…

Representative Results

Dieses Verfahren wurde erfolgreich implementiert, um Trachealbürstenzellen für die RNA-Sequenzierung3zu isolieren. Nach Isolierung der Luftröhre und Verdauung des Gewebes mit einem 2-stufigen Protokoll (Abbildung 1) wurden Zellen gesammelt und mit fluoreszierend gekennzeichneten CD45 und EpCAM nach Ausschluss abgestorbener Zellen mit PI gefärbt. Nachdem wir Doublets basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuungsmerkmalen herausgezäunt hatten, definierten wir Bürst…

Discussion

Wir fanden heraus, dass eine Kombination von hochdosierter Dispase-Behandlung für 40 min gefolgt von einer kurzen Papain-Behandlung (30 min) ein optimales Protokoll für die Trachealverdauung und die Isolierung von Bürstenzellen bietet. Diese Kombination vermeidet eine umfangreiche Verdauung und erzeugt die höchste Ausbeute an Bürstenzellen im Vergleich zu alternativen Protokollen.

Während die Lungenverdauung zur Extraktion hämatopoetischer Zellen sich klassischerweise auf milde Verdauun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Adam Chicoine vom Brigham and Women es Human Immunology Center Flow Core für seine Hilfe bei der zytometrischen Sortierung durch Fluss. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) und K08 AI132723 (L.G.B) und von der American Academy of Allergy, Asthma, and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), durch den AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), den Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), den Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) und großzügige Spende der Familie Vinik (L.G.B.).

Materials

Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

References

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Cite This Article
Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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