Summary

Aislamiento y evaluación cuantitativa de células de pincel de tráqueas de ratón

Published: June 12, 2019
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Summary

Las células del cepillo son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas raras que se encuentran en la tráquea de ratón ingenua. Debido a su número limitado, la evaluación ex vivo de su papel funcional en la inmunidad y remodelación de las vías respiratorias es un desafío. Describimos un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal por citometría de flujo.

Abstract

Las células del cepillo traqueal son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas a las que se encuentra para transmitir señales desde el lumen de las vías respiratorias al sistema inmunitario y nervioso. Son parte de una familia de células epiteliales quimiosensoriales que incluyen células de mechón en la mucosa intestinal, células de cepillo en la tráquea, y células quimiosensoriales y microvasas solitarias en la mucosa nasal. Las células quimiosensoriales en diferentes compartimentos epiteliales comparten marcadores intracelulares clave y una firma transcripcional central, pero también muestran una heterogeneidad transcripcional significativa, probablemente reflejo del entorno tisular local. Se requiere aislamiento de las células del cepillo traqueal de las suspensiones de una sola célula para definir la función de estas células epiteliales raras en detalle, pero su aislamiento es difícil, potencialmente debido a la estrecha interacción entre las células del cepillo traqueal y las terminaciones nerviosas o debido a la composición específica de las vías respiratorias de uniones apretadas y adheridas. Aquí, describimos un procedimiento para el aislamiento de las células del cepillo del epitelio traqueal del ratón. El método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa, lo que permite una posterior incubación más corta de la lámina epitelial con papaína. Este procedimiento ofrece una solución rápida y conveniente para la clasificación citométrica de flujo y el análisis funcional de células de cepillo traqueal viables.

Introduction

Las células de cepillo pertenecen a una clase de células epiteliales quimiosensoriales caracterizadas por la expresión de receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de receptores de sabor que se encuentra en las células de los paladares. A diferencia de las células de los cogollos de sabor, las células epiteliales quimiosensoriales se dispersan en superficies epiteliales y se conocen como células quimiosensoriales solitarias (SCC) y células microvasas en el epitelio nasal1,2, células de cepillo en la tráquea 3,4, y células de mechón en el intestino5,6. Las células epiteliales que expresan receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de sabor amargo también se encuentran en la uretra7,8 y el tubo auditivo9. Las células del cepillo de las vías respiratorias tienen funciones únicas en las respuestas neurogénicas e inmunitarias. Son células quimiosensoriales productoras de acetilcolina que evocan reflejos respiratorios protectores tras la activación con compuestos amargos y metabolitos bacterianos como las sustancias de observación de quórum10. Las células de cepillo de las vías respiratorias son también la fuente epitelial dominante dela VÍA respiratoria de IL-25, que regula la inflamación del tipo 2 con aeroallos en las vías respiratorias 3.

La caracterización del transcriptoma completo de las células del cepillo de las vías respiratorias inferiores y su respuesta a los estímulos ambientales se ha visto limitada por su bajo número en el epitelio traqueal y un número muy limitado más allá de los grandes bronquios10. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de células quimiosensoriales del epitelio intestinal no han dado resultados proporcionalmente altos de la tráquea, posiblemente debido a los contactos íntimos de las células del cepillo traqueal con terminaciones nerviosas10 u otras factores específicos del tejido en la mucosa respiratoria, como la composición de adheridos y proteínas de unión apretada. Informes recientes de aislamiento exitoso de células de cepillo traqueal en números más altos para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula emplearon una incubación de 2 h con papaína o una incubación de 18 h con pronasa11,12. Dado que las incubaciones más largas con enzimas digestivas pueden disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células de los tejidos digeridos13,esto podría sesgar el análisis comparativo con otras poblaciones epiteliales quimiosensoriales.

Aquí, informamos de un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN3. El tratamiento de la tráquea con dosis altas de dosis separa el epitelio de la submucosa. La digestión posterior de la lámina epitelial con papaína permite una excelente recuperación de esta célula estructural.

Protocol

Antes de llevar a cabo los siguientes experimentos, asegúrese de que todo el uso y protocolos de cuidado animal sean aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y realizados de acuerdo con la Guíapara el Cuidado y Uso del Consejo Nacional de Investigación Animales de Laboratorio” (8a Edición, 2011) y las directrices de LA ARRIVE. Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso d…

Representative Results

Este procedimiento se ha implementado con éxito para aislar células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN3. Después del aislamiento de la tráquea y ladigestión del tejido con un protocolo de 2 pasos (Figura 1), las células se recogieron y se mancharon con CD45 etiquetado fluorescentemente y EpCAM después de la exclusión de células muertas con PI. Después de hacer dobletes basados en las características de dispersión hacia adelante y lateral, de…

Discussion

Encontramos que una combinación de tratamiento de dosis altas durante 40 minutos seguido de un tratamiento corto con papaína (30 min) proporciona un protocolo óptimo para la digestión traqueal y el aislamiento de células de cepillo. Esta combinación evita una digestión extensa y produce el mayor rendimiento de células de cepillo, en comparación con los protocolos alternativos.

Mientras que la digestión pulmonar para extraer células hematopoyéticas se ha basado clásicamente en enzi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Adam Chicoine en el Centro de Inmunología Humana de Brigham and Women’s Flow Core por su ayuda con la clasificación citométrica de flujo. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones sanitarias R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B), y K08 AI132723 (L.G.B), y por la Academia Estadounidense de Alergia, Asma e Inmunología (AAAAI) / Alergia Pulmonar Americana Premio a la Enfermedad Respiratoria (N.A.B.), por el Premio de Desarrollo Docente de la Fundación AAAAI (L.G.B.), por el Premio Steven y Judy Kaye Young Innovators (N.A.B.), por el Fondo Joycelyn C. Austen para el Desarrollo Profesional de Mujeres Científicas Médicas (L.G.B.), y por un generosa donación de la familia Vinik (L.G.B.).

Materials

Antibodies
Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) Abcam cat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (G8.8) Biolegend cat#118214
APC Rat IgG2a, k isotype control Biolegend cat#400511
DAPI Biolegend cat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies/Molecular Probes cat#A-11055
Normal Goat IgG R&D Systems cat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) Biolegend cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control Biolegend cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend cat#101320
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
Dispase Gibco cat# 17105041 
DNase I Sigma  cat# 10104159001
HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter Boston BioProducts cat# PY-912
Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) Boston BioProducts cat# BSS-355
L-Cysteine Sigma cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt Sigma cat# L2023
Papain from papaya latex Sigma cat# P3125
Propidium iodide  Sigma cat# P4170
Experimental Models: Organisms/Strains
ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) The Jackson Laboratory 7902
Equipment
LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope Zeiss
LSRFortessa BD 647465
Disposable equipment
1.5 mL sterile tubes Thomas Scientific 1157C86
5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style Falcon 14-959-1A
50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style Falcon 352098
Feather Disposable Scalpel no.12 Fisher Scientific NC9999403
Petri dish, 100 x 15 mm Style Falcon 351029
Sterile cell strainer, 100 μm Fisherbrand cat#22363549

References

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Cite This Article
Ualiyeva, S., Yoshimoto, E., Barrett, N. A., Bankova, L. G. Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas. J. Vis. Exp. (148), e59496, doi:10.3791/59496 (2019).

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