En melanom patient-derived xenograft modell

Summary

Patienter som härrör xenograft (PDX) modeller mer robust recapitulate melanom molekylära och biologiska egenskaper och är mer prediktiva för behandlingssvar jämfört med traditionella plast vävnad kulturbaserade analyser. Här beskriver vi vårt standard drifts protokoll för etablering av nya PDX-modeller och karakterisering/experimenterande av befintliga PDX-modeller.

Abstract

Ackumulerande bevis tyder på att molekylära och biologiska egenskaper skiljer sig i melanomceller som odlas i traditionella tvådimensionella vävnadsodling fartyg kontra in vivo hos mänskliga patienter. Detta beror på flaskhalsen urvalet av klonala populationer av melanomceller som robust kan växa in vitro i avsaknad av fysiologiska tillstånd. Vidare, svar på behandling i tvådimensionella vävnadskulturer övergripande inte troget återspeglar svar på behandling hos melanom patienter, med majoriteten av kliniska prövningar inte visar effekten av terapeutiska kombinationer visat sig vara effektiva i In vitro. Även om xenograftering av melanomceller till möss ger den fysiologiska in vivo-kontexten frånvarande från tvådimensionella vävnads odlings analyser, har de melanomceller som används för inympning redan genomgått flaskhals val för celler som kan växa under två-dimensionella förhållanden när cell linjen upprättades. De oåterkalleliga förändringar som uppstår till följd av flaskhalsen inkluderar förändringar i tillväxt-och invasions egenskaper, liksom förlusten av specifika subpopulationer. Därför kan modeller som bättre recapitulate människans villkor in vivo bättre förutsäga terapeutiska strategier som effektivt öka den totala överlevnaden för patienter med metastaserande melanom. Den patient-härledda xenograft (PDX) teknik innebär direkt implantation av tumörceller från den mänskliga patienten till en mus mottagare. På detta sätt, tumörceller ständigt odlas under fysiologiska spänningar in vivo och aldrig genomgå den tvådimensionella flaskhalsen, som bevarar de molekylära och biologiska egenskaper som finns när tumören var i den mänskliga patienten. Anmärkningsvärda, PDX-modeller härledda från organ platser av metastaser (dvs. hjärnan) uppvisar likartad metastaserande kapacitet, medan PDX-modeller som härrör från behandlingsnaiva patienter och patienter med förvärvad resistens mot behandling (dvs. BRAF/MEK-hämmare) visar liknande känslighet för behandling.

Introduction

Prekliniska modeller är kritiska för alla aspekter av Translationell Cancerforskning, inklusive sjukdomkaraktärisering, upptäckt av angripbara sårbarheter som är unika för cancer kontra normala celler, och utveckling av effektiva terapier som utnyttjar dessa sårbarheter för att öka patienternas totala överlevnad. I melanom fältet, tiotusentals cellinjer modeller har varit tungt utnyttjas för Drug screening, med > 4000 bidragit med vår grupp ensam (WMXXX-serien). Dessa cellinjer modeller härstammar från melanom patienter med olika former av kutana melanom (dvs., acral, ukalv, och ytliga spridning) och olika genotyper (dvs., BRAF^V600-Mutant och neuroblastom ras viral onkogen homolog [ Nationella regleringsmyndigheter ^Q61R-Mutant]), som spänner över det spektrum av sjukdomar som finns i kliniken^1,2.

Otvetydigt, den mest framgångsrika, riktade terapi strategi i melanom fältet har uppstått från 1) den genomiska karakteriseringen av patienternas tumörer som identifierar BRAF -mutationer i ~ 50% av melanom³ och från 2) preklinisk undersökning utnyttja melanom cell linje modeller⁴. Kombinationen BRAF/MEK-hämmare var Food and Drug Administration (FDA)-godkänd i 2014 för behandling av patienter vars melanom Harbor aktiverande BRAF^V600E/K- mutationer och ståtar med en > 75% svarsfrekvens⁵. Trots denna initiala effekt, resistens uppstår snabbt i nästan alla fall på grund av mångskiftande inneboende och förvärvade resistensmekanismer och intratumorala heterogenitet. Tyvärr, cellinjer modeller inte recapitulate representativa biologiska heterogenitet när odlas i tvådimensionell kultur i plast fartyg, som döljer sin kliniskt prediktiva potential när utredare försök att experimentellt avgöra terapier som kan vara effektiva hos patienter med en specifik form eller genotyp av melanom⁶. Förstå hur man bäst modell patienten intratumorala heterogenitet kommer att göra det möjligt för utredare att bättre utveckla terapeutiska modaliteter som kan döda behandlingsresistenta subpopulationer som driver underlåtenhet att nuvarande standard-of-Care terapier.

Avgörande för den begränsade prediktiva värdet av cellinjer modeller är hur de ursprungligen fastställts. Irreversibla förändringar förekommer i tumörens klonala landskap när en encellig suspension av en patient tumör odlas på tvådimensionella, plast vävnad kultur fartyg, inklusive förändringar i proliferativ och invasiv potential, eliminering av specifika subpopulationer, och förändringen av genetisk information⁷. Xenografts till möss av dessa melanom cell linje modeller representerar den mest använda in vivo plattform för prekliniska studier; men denna strategi lider också av den fattiga rekapitulation av komplexa tumör heterogenitet observerats kliniskt. För att övervinna denna brist har det funnits ett växande intresse av att införliva mer sofistikerade prekliniska modeller av melanom, inklusive PDX-modellen. PDX-modellerna har använts i > 30 år, med seminala studier på lungcancerpatienter som demonstrerade överensstämmelse mellan patienternas respons på cytotoxiska medel och responsen hos PDX-modellen som härrör från samma patient⁸. Nyligen har det varit en enhet att använda PDX modeller som verktyg för val för prekliniska utredningar både i branschen och i akademiska centra. PDX modeller, på grund av deras överlägsna rekapitulation av tumör heterogenitet hos mänskliga patienter, är mer kliniskt relevanta att använda i terapi optimering insatser än cellinjer xenograft⁹. I melanom, det finns enorma hinder som trubbigt den terapeutiska hanteringen av avancerad sjukdom¹⁰. Kliniskt relevanta PDX-modeller har använts för att modellera kliniskt motstånd och identifiera terapeutiska strategier med kliniskt tillgängliga medel för behandling av behandlingsresistenta tumörer^11,12. Kortfattat, det protokoll som presenteras här för att generera PDX modeller kräver subkutan implantation av färsk vävnad från primära eller metastaserande melanom (samlas in av biopsi eller kirurgi) till nod/scid/IL2 nätters-receptor null (NSG) möss. Olika grupper använder sig av skilda variationer i metodologisk metod. emellertid finns en grund kärna¹³.

Protocol

Följande djur protokoll följer riktlinjerna från Wistar Institutes humana etikkommitté och riktlinjer för djuromsorg. 1. melanom tumör vävnad insamling Samla tumör vävnad (kallas passage 0) från melanom patienter med en av följande kirurgi eller biopsi metoder. För kirurgisk excision vävnad, upprätthålla minst 1 g vävnad (resect metastaser och primära lesioner) i transport lagringsmedia (RPMI 1640 + 0,1% fungizone + 0,2% gentamicin) vid 4 ° c eller på is.</…

Representative Results

Tumör vävnad för melanom PDX modeller kan komma från en mängd olika källor och kan också bearbetas per tillväxtdynamik enskilda modeller och önskad användning av PDX vävnad. Prioriteringen vid upprättande av en PDX-modell är att ha tillräckligt med material till banken för framtida användning och DNA för karakterisering (figur 1). När tillräckligt material är bankas, tumör vävnad kan utökas i en av tre huvudsakliga metoder för att växa til…

Discussion

Vi har häri beskrivs genererar PDX modeller av melanom med patient vävnad som härrör från primära och metastaserande tumörer, kärnbiopsier, och FNAs. När direkt inympas i NSG-möss, tumörer uppvisar liknande morfologiska, genomiska, och biologiska egenskaper till de som observerats i patienten. I fallet när endast en liten mängd vävnad är tillgänglig för utredare, som ofta sker med FNAs, tillåter PDX tekniken för utbyggnad av tumör vävnad för DNA, RNA, och proteinkarakterisering, samt för behandling…

Materials

1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631