Fremstilling af Neutrally-ladede, pH-Responsive polymere nanopartikler til Cytosolic siRNA-levering
Summary
Metoder til at forberede og karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber og Bioaktivitet af neutrally-ladede, pH-Responsive siRNA nanopartikler præsenteres. Kriterier for vellykkede siRNA nanomediciner såsom størrelse, morfologi, overflade ladning, siRNA lastning, og genhæmning diskuteres.
Abstract
Den succes siRNA som en målrettet Molekylær medicin er afhængig af sin effektive cytosoliske levering til celler i vævet af patologi. Der er opnået klinisk succes med behandling af tidligere ‘ ubeskadigede ‘ hepatiske sygdoms mål med siRNA. Men, effektiv tumor siRNA levering kræver yderligere farmakokinetiske design overvejelser, herunder lang cirkulation tid, unddragelse af clearance organer (f. eks, leveren og nyrerne), og tumor penetration og fastholdelse. Her beskriver vi forberedelsen og in vitro fysisk-kemiske/biologiske karakterisering af polymere nanopartikler designet til effektiv siRNA levering, især til ikke-hepatisk væv såsom tumorer. SiRNA nanopartiklerne fremstilles ved elektrostatisk komplexering af siRNA og diblok copolymer poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-dB) til dannelse af polyion-komplekser ( polyplexer), hvor siRNA er afsondret inden for Polyplex-kernen, og PEG danner en hydrofile, neutrally-ladet Corona. Desuden bliver DB blokken membran-lytisk som vesikler af endolysosomale pathway acidificering (< pH 6,8), udløser endosomal flugt og cytosoliske levering af siRNA. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber af siRNA nanopartikler såsom størrelse, overflade ladning, partikel morfologi, og siRNA lastning er beskrevet. Bioaktivitet af siRNA nanopartikler måles ved hjælp af luciferase som et model-gen i en hurtig og høj gennemløb genhæmnings analyse. Design, der passerer disse indledende tests (såsom PEG-DB-baserede polyplexer) anses for passende til oversættelse til prækliniske dyreforsøg, der vurderer leveringen af siRNA til tumorer eller andre steder af patologi.
Introduction
Fordi sirnas hæmmer oversættelsen af proteiner fra mRNA-sekvenser, kan de teoretisk bruges til at stof alle kendte patologier1,2,3,4,5. Brugen af siRNA i medicin er imidlertid begrænset af den omfattende dårlige farmakokinetiske profil af siRNA-molekyler6,7. Når der injiceres intravenøst, ryddes sirnas hurtigt gennem nyrerne og/eller nedbrydes af nukleaser8,9. På grund af sin store størrelse og negative ladning kan siRNA ikke trænge ind i cellerne eller undslippe endolysosomal pathway for at få adgang til det RNA-inducerede lyddæmpnings kompleks (RISC), der findes i cytosol10,11,12, 13. det er Derfor har en omfattende indsats fokuseret på design og implementering af siRNA leveringsstrategier14. Denne indsats har i høj grad fokuseret på udvikling af lipid-og polymer-baserede nanopartikler, som pakke siRNA, beskytte det mod clearance og nedbrydning in vivo, og initiere cellulære optagelse og endosomal undslippe gennem ionizable, kationiske Amin grupper. Der er rapporteret om mange prækliniske succeser, og senest er den første kliniske succes blevet rapporteret for nanopartikel-baseret hepatisk siRNA-levering til behandling af arvelig transthyretin-medieret (hATTR) amyloidose15.
Der er mange kræftfremkaldende gener, der i øjeblikket er “ubeskadigede” af konventionelle farmakologi (dvs., små molekyle narkotika), motiverende design af polymere siRNA nanopartikler (si-NPs) til behandling af kræft16. Der er dog et separat sæt af design parametre, der skal overvejes for ikke-hepatisk siRNA levering. Leveringssystemet skal beskytte den kationiske ladning af Polyplex, som forårsager agglutinations i det systemiske kredsløb17,18,19. For tumor levering, specifikt, si-NP stabilitet er afgørende for udstyre lang cirkulation og dermed øget akkumulering inden tumorer via den forstærkede permeabilitet og retention (EPR) effekt20,21. Desuden, kontrol over si-NP størrelse er afgørende, da kun nanopartikler ca 20 – 200 Nm diameter i størrelse gearing EPR22, og mindre si-NPS (~ 20 – 50 nm diameter) udviser forbedret tumor penetration over større størrelse nanopartikler og mikropartikler23.
For at løse disse yderligere konstruktions begrænsninger for systemisk tumor levering af siRNA efter intravenøs administration er der udviklet neutrally-ladede, pH-Responsive si-NP’er (figur 1)24. Disse si-NPs er pegyleret, eller senest, Zwitterionated25, for neutral overflade opladning og resistens over for protein adsorption og opsonisation i omløb. Da de ikke kan stole udelukkende på kationisk karakter til at drive intracellulære levering, ekstremt effektiv endosomal flugt er bydende nødvendigt for at opnå potent genhæmning. Derfor består kernen af disse si-NP’er af en meget endosomolytisk kerne, som er inaktiv ved ekstracellulær pH (7,4), men som udløses på en switch-lignende måde i de syrnede forhold på endolysosomal pathway [pH 6,8 (tidlige endosomer) – 5,0 ( lysosomer)]. Endelig giver en blanding af kationisk og Hydrofobisk indhold i kernen af si-NPs både elektrostatiske og van der Waals stabiliserings kræfter, hvilket forbedrer stabiliteten af si-NP’er i blodet sammenlignet med blot kationiske systemer.
Integrationen af mange funktioner i et relativt simpelt design er muligt ved hjælp af reversible addition-fragmentering kæde Transfer (RAFT) kontrolleret polymerisering til at producere polymerer med kompleks arkitektur og præcis sammensætning. For at producere si-NPs med neutral overflade opladning, pH-reaktionsevne, og NP stabilitet, er TØMMERFLÅDE bruges til at syntetisere poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-DB; Figur 1a). Peg-DB er elektrostatisk kompleks bundet med siRNA, der danner si-NPS med en peg Corona og DB/siRNA kerne (figur 1b). PEG danner et inert, neutralt ladet hydrofile lag på si-NP Corona. DB blokken består af en 50:50 molær ratio på 2-(dimethylamino) ethylmethacrylat (DMAEMA) og butylmethacrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatiske komplekser negativt opladet siRNA. BMA Self-Associates inden for NP kerne af van der Waals interaktioner, øge NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA overgive pH-afhængige lipid bilayer-lytisk opførsel til DB polymer blokken. Ved ekstracellulær pH, er DB blokken sekvenestered til si-NP kerne og er inaktiv til lipid bilag. Under sure forhold, såsom dem inden for endolysosomal pathway, letter ionisérbare dmaema inden for DB blokken proton svamp effekt, hvor endosomal buffer fører til osmotisk hævelse og ruptur26. Derudover er hydrofobe BMA-fuser i DB-blokken aktivt integreret i og lysere lipid-bilag, hvilket resulterer i potent endosomolyse. Således er siRNA kompleks bundet med peg-dB til at danne si-NPS, der er neutralt-ladede og meget stabile ved ekstracellulær pH, men som forstyrrer lipid bilag ved sur pH, hvilket sikrer cytosoliske levering af siRNA nyttelast.
Heri beskrives de eksperimentelle procedurer til fremstilling af si-NP’er fra PEG-DB. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske parametre og Bioaktivitet af si-NPs præsenteres og diskuteres. For hurtigt at kunne vurdere si-NP-Bioaktivitet anvendes luciferase som et model-gen til Knockdown undersøgelser. Firefly luciferase er det protein, der er ansvarlig for “glød” af ildfluer27. Derfor producerer pattedyrsceller, der er transficeret med Firefly luciferase-genet, en bioluminescerende ‘ glød ‘, der kan optages ved hjælp af et luminometer til kvantificering af niveauet af luciferase-ekspression. Her bruger vi luciferase til at vurdere Bioaktivitet af si-NPS ved at levere siRNA mod luciferase og kvantificere den tilsvarende reduktion i bioluminescens i luciferase-udtrykker celler sammenlignet med celler, der modtager en røræg siRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
De her beskrevne si-NPs dannes ved elektrostatisk sammenslutning af anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyionkomplekser (polyplexer). Elektrostatisk kompleksning af siRNA og den kationiske DB-blok af PEG-DB-polymerer lettes ved at blande ved lav pH-værdi (4,0). Ved pH 4,0 er DMAEMA meget protoneret, og derfor er DB blokken meget opladet. Dette sikrer, at polymerer opløses som unimere i opløsning i modsætning til at danne miceller, og at DB komplekser effektivt med siRNA. Efterfølgende justeres opløsningens …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for DRs. Craig Duvall og Rebecca Cook for adgang til data og lab ressourcer til at gennemføre denne forskning. Forfatterne er taknemmelige for Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) for adgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er taknemmelige for National Science Foundation for at støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er taknemmelige for de nationale institutter for sundhed for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er taknemmelige for Department of Defense Congressionally instrueret medicinsk forskning program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
