הכנת מנטרל-טעון, pH-מגיבים חלקיקים פולימריים עבור משלוח ציטוזה מסירה
Summary
שיטות להכין ולאפיין את המאפיינים הפיסיוכימיים ואת אתריים של מחויב נייטרליים, מגיב pH-תגובה sirna מוצגים. הקריטריונים של siRNA nanomedicines מוצלחת כגון גודל, מורפולוגיה, טעינה משטח, העמסה siRNA, והשתקה גנים נדונים.
Abstract
ההצלחה של siRNA כרפואה מולקולרית ממוקד תלויה המסירה cytosolic יעיל שלה תאים בתוך רקמת הפתולוגיה. הצלחה קלינית לטיפול בעבר “undruggable” מטרות מחלות הכבד עם siRNA הושג. עם זאת, מסירה יעילה siRNA הגידול מחייבת שיקולים עיצוב נוספים פרמקוקינטיים, כולל זמן מחזור ארוך, התחמקות של איברי הסיווג (למשל, כבד וכליות), וחדירה לגידול ושמירה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ומבחינה גופנית פיסיופיזיולוגיה/ביולוגיים אפיון של חלקיקים פולימריים מיועד משלוח siRNA יעיל, במיוחד רקמות שאינן הכבד כגון גידולים. חלקיקים siRNA מוכנים על ידי complexation אלקטרוסטטית של siRNA ואת diblock סומד פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB) כדי ליצור מתחמי polyion ( פוליפלסים) כאשר siRNA ממוקם בתוך הליבה פוליפקס ו-פג צורות של הידרופיפילית, הקורונה הטעונה באופן נייטרליים. יתר על כן, בלוק DB הופך ממברנה-lytic כמו שלפוחיות של המסלול endolysoזומacidify (< pH 6.8), מפעיל בריחה אנדוזומטית ו ציטוסולג משלוח של siRNA. שיטות לאפיון המאפיינים הפיסיוכימיים של חלקיקים siRNA כגון גודל, משטח המטען, החלקיקים מורפולוגיה, ואת הטעינה siRNA מתוארים. Bioactivity של חלקיקים siRNA נמדד באמצעות לוציפראז כמו גן מודל בתוך מהירה, תפוקה גבוהה של גנים השתקה שיטת. עיצובים אשר עוברים אלה המבחנים הראשוניים (כגון מבוססי יתד-DB פוליפלסים) נחשבים מתאימים תרגום למחקרים בעלי חיים טרום קלינית הערכת המסירה של siRNA כדי גידולים או אתרים אחרים של פתולוגיה.
Introduction
בגלל sirnas לעכב את התרגום של חלבונים מ-mrna רצפים, הם יכולים תיאורטית לשמש סמים כל הפתווגיות ידוע1,2,3,4,5. עם זאת, השימוש sirna ברפואה מוגבל על ידי הפרופיל הטוב ביותר הפרמקוקינטיים של sirna מולקולות6,7. כאשר מוזרק באופן מהיר, sirnas מתנקה במהירות דרך הכליות ו/או מושפל על ידי נוקלאוסים8,9. בשל גודלו הגדול וחיוב שלילי, siRNA לא יכול להיכנס לתאים או לברוח מסלול endolysosomal כדי לגשת לקומפלקס השתקה מושרה RNA (RISC) שנמצא בתוך הציטוזול10,11,12, . שלוש עשרה כך, מאמץ נרחב התמקד בעיצוב ויישום של אסטרטגיות משלוח siRNA14. מאמץ זה התמקד בעיקר בפיתוח של חלקיקי השומנים, פולימר מבוסס חלקיקים אשר חבילת siRNA, להגן עליו מפני הרשאה והשפלה ב vivo, וליזום ספיגת הסלולר ולהימלט אנדוזומתית דרך ionizable, הקבוצות מאמין. הצלחות טרום קליני רבים דווחו ולאחרונה, ההצלחה הקלינית הראשונה דווחה עבור משלוח ננו-חלקיק הכבד מבוסס siRNA לטיפול transthyretin תורשתי-תיווך (חטאר) עמילואידוזיס15.
ישנם הרבה סרטן גרימת הגנים כי הם כרגע “undruggable” על ידי פרמקולוגיה קונבנציונלי (כלומר, תרופות מולקולה קטנה), מוטיבציה העיצוב של חלקיקים מפולימר siRNA (si-NPs) לטיפול בסרטן16. עם זאת, יש קבוצה נפרדת של פרמטרי עיצוב שיש לשקול עבור משלוח siRNA לא הכבד. מערכת המסירה חייבת להגן על המטען המאסור של הפוליפקס שגורם להצמנות בתוך המחזור הסיסטמי17,18,19. עבור משלוח הגידול, במיוחד, si-NP יציבות חיונית כדי להעניק מחזור ארוך ולכן הצטברות מוגברת בתוך גידולים דרך חדירות משופרות ושמירה (epr) אפקט20,21. יתר על כן, שליטה על גודל si-NP הוא חיוני מאז רק חלקיקים כ 20-200 ננומטר קוטר בגודל מינוף EPR22, וקטן יותר Si-NPs (~ 20 – 50 בקוטר nm) התערוכה חדירה משופרת הגידול על חלקיקים בגודל גדול יותר מיקרוחלקיקים23.
כדי לטפל אלה אילוצי העיצוב הנוספים עבור המסירה גידול מערכתית של siRNA בעקבות והעברת המינהל, באופן נייטרליים טעונה, pH-תגובה si-NPs פותחו (איור 1)24. הג-NPs האלה הם מנובטים, או לאחרונה, Zwitterionated25, עבור טעינה משטח נייטרלי ועמידות לספיחה חלבונים וopsonization במחזור הדם. כיוון שהם לא יכולים להסתמך אך ורק על האופי לנהוג משלוח תאיים, בריחה יעילה מאוד אנדוזומלית היא הכרחית להשגת גנים חזקים השתקה. לפיכך, הליבה של אלה si-NPs מורכב ליבה אנדוסומאין מאוד, אשר הוא אינרטי ב-pH מסחטות (7.4), אבל אשר מופעלת בצורה כמו מתג בתנאים acidified של מסלול endolysoזומבית [pH 6.8 (מוקדם אנזומים) – 5.0 ( ליסוזומים)]. לבסוף, תערובת של תכנים הידרוליים ומופובי בליבת סי-NPs מספקים הן כוחות הייצוב האלקטרוסטטית והן של ואן דר ואלס, שיפור יציבותו של ה-si-NPs בדם לעומת מערכות המזרות בלבד.
שילוב של פונקציות רבות לתוך עיצוב פשוט יחסית ניתן להשתמש בתוספת הפיכה שרשרת פיצול (רפסודה) מבוקרת לייצר פולימרים עם ארכיטקטורה מורכבת וקומפוזיציה מדויקת. כדי לייצר si-NPs עם המטען הנייטרלי הקרקע, pH-תגובתיות, ו NP יציבות, הרפסודה משמש לסנתז פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB; איור 1A). יתד-DB הוא אלקטרוסטטי משלימה עם siRNA, ויוצרים si-NPs עם הקורונה יתד ו DB/siRNA core (איור 1B). פג יוצרת שכבת הידרופיפילית. לא מופעלת על הקורונה סי-NP בלוק DB מורכב מ-50:50 היחס הטוחנת של 2-(dimethylamino) אתיל מתיונין (DMAEMA) ו בוטיל מתיונין (BMA). מכלולי מערכות בעלי מבנה סטטי מחויב siRNA. BMA שותפים עצמאיים בתוך ליבת NP על ידי האינטראקציות ואן דר ואלס, הגדלת יציבות NP. ביחד, DMAEMA ו-BMA להקנות השומנים תלויי-pH בלהה-lytic התנהגות לחסום את הפולימר DB. ב-pH מסחטות, בלוק DB מובאת si-NP הליבה והוא האינרטי bilayers השומנים. תחת תנאים חומציים, כגון אלה בתוך מסלול endolysoזוממה, ionizable DMAEMA בתוך בלוק DB מקלה על אפקט ספוג פרוטונים, שם מאגרים אנדוזומאים מוביל אוסמוטי נפיחות וקרע26. בנוסף, BMA הידרופובי moieties בתוך בלוק DB באופן פעיל להשתלב ו lyse השומנים bilayers, וכתוצאה מכך אנדוסווליזיס חזק. Thus, siRNA היא משלימה עם יתד-DB לטופס si-NPs כי הם נייטרליים טעונה ויציבה מאוד ב-pH מסירה אבל אשר משבש bilayers השומנים ב pH חומצי, להבטיח משלוח ציטוסולג של המטען siRNA.
להלן מתוארים ההליכים הניסיוניים להפקת si-NPs מ-יתד-DB. שיטות לאפיון הפרמטרים הפיזיקליים והביופעילות של סי-NPs מוצגים ודנים. על מנת להעריך במהירות את הפעילות הביוגנטית של si-NP, לוציפראז משמש כגן מודל עבור המשך הלימודים. גחלילית לluciferase הוא החלבון האחראי ‘ זוהר ‘ של גחליליות27. בהתאם לכך, תאים של מיונקים המזוהמים בגנים הלוצילזיים של גחלילית מייצרים “זוהר” ביולוגינט שניתן ללכוד באמצעות לימלומטר כדי לכמת את רמות הביטוי של לוציפראז. כאן, אנו משתמשים לוציפראז כדי להעריך אתריים של si-NPs על ידי אספקת sirna נגד לluciferase וכימות הפחתת המקבילה בביולומינסנציה ב-לוציפראז-הבעת תאים לעומת תאים המקבלים sirna מעורבל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ה-si-NPs המתואר כאן מיוצרים על ידי האגודה האלקטרוסטטית של הארגון האנייוני והפולימרים הניגיים לתוך polyion מתחמי (פוליפוניים). Complexing אלקטרוסטטית של siRNA ואת בלוק DB הנתונים של הפולימרים יתד-DB הוא הקלה על ידי ערבוב ב-pH נמוך (4.0). ב-pH 4.0, DMAEMA הוא מאוד protonated, וכתוצאה מכך בלוק DB טעונה מאוד. זה מבטיח כי הפולימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה לג. קרייג דובאל ורבקה קוק לגישה למידע ולמשאבי מעבדה לניהול מחקר זה. המחברים אסירי תודה למכון ואנדרבילט למדע ננו-סקאלה והנדסה (VINSE) עבור גישה DLS ו-TEM (NSF EPS 1004083) כלים. המחברים אסירי תודה לקרן המדע הלאומית לתמיכה בתוכנית המלגות למחקר בוגר (NSF 1445197). המחברים אסירי תודה למכון הלאומי לבריאות לתמיכה כספית (NIH R01 EB019409). המחברים אסירי תודה למחלקה להגנת Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי לתמיכה כספית (משרד ההגנה CDMRP OR130302).
Materials
| 0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
