Представлены методы подготовки и характеристики физико-химических свойств и биоактивности нейтрали-заряженных, рН-отзывчивых наночастиц СиРНА. Обсуждаются критерии успешного, например, размер, морфология, поверхностная зарядка, нагрузка на иРНК и глушителей генов.
Успех СиРНА как целевой молекулярной медицины зависит от его эффективной цитозололиной доставки в клетки в тканях патологии. Клинический успех для лечения ранее не «безнаркоспособных» целевых показателей печеночной болезни с помощью Сирны был достигнут. Однако эффективная поставка опухоли СиРНА обусловливает необходимость в дополнительных фармакокинетических соображениях проектирования, включая длительное время циркуляции, уклонение от очистки органов (например, печень и почки), а так же проникновение и удержание опухоли. Здесь мы описываем подготовку и экстракорпоральное физикохимическое/биологическое описание полимерных наночастиц, предназначенных для эффективной доставки СиРНА, в частности, к не печеночной ткани, такой как опухоли. Наночастицы СиРНА подготавлиются электростатической комплексообразованием СиРНА и полиолмера поли (этилен гликоль-б-[2-(диметиламин) этилметакриловой-Co-Butyl метакрилат]) (ПЭГ-дБ) для формирования polyion комплексов ( полиплексы), где СиРНА изолированный внутри полиплекса ядра и ПЭГ образует гидрофильные, нейтрально заряженных короны. Кроме того, блок DB становится мембранно-литической, как пузырьки эндолизомального пути окислить (< рН 6,8), вызывая эндосомальный побег и цитозололическую доставку СиРНА. Описаны методы для характеристики физикохимических характеристик наночастиц СиРНА, таких как размер, поверхностная зарядка, морфология частиц и нагрузка на СиРНА. Биоактивность наночастиц СиРНА измеряется с помощью люциферазы в качестве типового гена в быстром и высокой пропускной способности глушителей анализа гена. Проекты, которые проходят эти первоначальные тесты (например, полиплексы на основе ПЭГ-БД), считаются подходящими для перевода на доклинические исследования животных, оценивающих доставку СиРНА в опухоли или другие места патологии.
Потому что сирнас ингибирует перевод белков из мРНК последовательностей, они теоретически могут быть использованы для наркотиков всех известных патологий1,2,3,4,5. Тем не менее, использование СиРНА в медицине ограничено всесторонне бедным Фармакокинетический профиль молекул СиРНА6,7. При введении внутривенно, сирнас быстро очищается через почки и/или деградирует нуклеазы8,9. Из-за большого размера и отрицательного заряда, СиРНА не может войти в клетки или избежать эндолизомального пути для доступа к РНК-индуцированной комплекс глушителей (RISC), который находится в цитозоль10,11,12, 13-ое. Таким образом, были предприняты активные усилия по разработке и внедрению стратегий доставки СиРНА14. Эти усилия в значительной степени сосредоточены на развитии липидных и полимеров на основе наночастиц, которые пакет СиРНА, защитить его от очистки и деградации в естественных условиях, и инициировать поглощение клеток и эндосомальных бежать через ионируемых, катионических аминов групп. Многие доклинические успехи были зарегистрированы и в последнее время, первый клинический успех был сообщены для нано, основанных на печени, на основе Рсрнк доставки для лечения наследственных транстимотина-опосредованного (Хаттр) амилоидоз15.
Есть много вызывающих рак генов, которые в настоящее время “undruggable” по традиционной фармакологии (например, малые молекулы наркотиков), мотивируя дизайн полимерных наночастиц СиРНА (Si-НПВ) для лечения рака16. Тем не менее, есть отдельный набор параметров дизайна, которые должны быть рассмотрены для не-печеночной СиРНА доставки. Система доставки должна оградить катионический заряд полиплекса, который вызывает агглютинации в рамках системного обращения17,18,19. Для доставки опухоли, в частности, Si-НП стабильности имеет важное значение для наделять длительный тираж и, следовательно, увеличение накопления в рамках опухоли с помощью расширенной проницаемости и удержания (ОРЭД) эффект20,21. Кроме того, контроль над размером Si-НП имеет важное значение, так как только наночастицы примерно 20-200 Нм диаметром в размер плечо ЭПР22, и меньше Si-ЯИЭ (~ 20-50 Нм диаметром) экспонат Улучшение проникновения опухоли более крупных размеров наночастиц и микрочастицы23.
Для решения этих дополнительных проектных ограничений на системную поставку опухоли в СиРНА после внутривенного введения, нейтрально заряженных, рН-отзывчивый Si-НПВ были разработаны (рис. 1)24. Эти Si-НПВ являются PEGylated, или совсем недавно, Zвиттерионионированной25, для нейтральной поверхности заряда и устойчивость к протеиновой адсорбции и опсонизации в обращении. Поскольку они не могут полагаться исключительно на катионический характер диска внутриклеточного доставки, чрезвычайно эффективным эндосомальных побег является обязательным условием для достижения мощного глушителей генов. Соответственно, ядро этих Si-НПВ состоит из высокоэндолитического ядра, которое инертно при внеклеточной рН (7,4), но которое срабатывает в коммутатор-подобный способ в подкисленные условия эндолизомального пути [pH 6,8 (ранние эндосомы)-5,0 ( лизосомы)]. Наконец, смесь катионного и гидрофобного содержания в ядре Si-ЯИЭ обеспечивают как электростатические, так и стабилизационные силы Ван-дер-Ваальса, улучшая устойчивость Si-НПВ в крови по сравнению с просто катионическим системами.
Интеграция многих функций в относительно простую конструкцию возможна с помощью обратимой цепочки переноса фрагментации (плот), контролируемой полимеризации, для производства полимеров со сложной архитектурой и точным составом. Для производства Si-ЯИЭ с нейтральным поверхностным зарядом, рН-отзывчивостью и стабильностью НП, плот используется для синтеза поли (этиленгликоль-б-[2-(диметиламин) Этилметакрилат-ко-бутил метакрилат)) (ПЭГ-дБ; Рис. 1A). ПЭГ-дБ является электростатически комплексированных с СиРНА, формирование Si-ЯИЭ с ПЭГ Корона и DB/СиРНА ядра (рис. 1b). ПЭГ образует инертный, нейтрально заряженный гидрофильный слой в Си-НП Корона. Блок DB состоит из 50:50 молярного соотношения 2-(диметиламин) этилметакрилта (DMAEMA) и бутиля метакрилат (БМА). Катионические DMAEMA электростатически комплексы отрицательно заряженные СиРНА. БМА самоассоциированные в рамках НП ядро взаимодействия ван дер Ваальса, повышение стабильности НП. Вместе, DMAEMA и БМА передавать рН-зависимых липидного билайер-lytic поведение БД полимерных блоков. При внеклеточной рН, блок DB поглощенных к Си-НП ядро и инертен для липидных билайеры. В кислотных условиях, таких, как в пределах эндосомального пути, иоментизируемая DMAEMA в блоке DB облегчает эффект протонной губки, где эндосомная буферизация приводит к осмотическим отеку и разрыву26. Дополнительно, гидрофобные МДА, в пределах блока DB активно интегрируются в и Lyse липидные билайеры, в результате мощного эндосомолиза. Таким образом, СиРНА комплексируется с ПЭГ-БД для формирования Si-НПВ, которые нейтрально заряженных и очень стабильной при внеклеточной рН, но которые нарушают липидные билайеры на кислотных рН, обеспечивая цитозололические доставки полезной нагрузки СиРНА.
Здесь описаны экспериментальные процедуры по производству Si-НПВ от ПЭГ-БД. Представлены и обсуждаются методы, характеризующие Физикохимические параметры и биоактивность Si-НПВ. Чтобы быстро оценить биоактивность Si-НП, Люцифераза используется в качестве типового гена для исследований нокдауна. Светлячок люциферазы является белок, ответственный за “свечение” светлячков27. Соответственно, клетки млекопитающих, трансфецированных в гене люцифязы Светлячок производят светящихся “свечение”, которые могут быть захвачены с помощью лютометр для количественной оценки уровней люциферазы выражения. Здесь мы используем люциферазу для оценки биологической активности Si-НПВ, предоставляя СиРНА против люциферазы и количественного соответствующего сокращения биолюминесценции в Люцифферасе-экспрессируя клетки по сравнению с клетками, которые получают зашифрованный СиРНА.
Описанные здесь Si-НПВ формируются электростатической ассоциацией анионических СиРНА и катионических полимеров в полионные комплексы (полиплексы). Электростатическое комплексирование СиРНА и катионический DB полимеров ПЭГ-DB способствует смешиванию при низком РН (4,0). При pH 4,0, DMAEMA очень…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят доктора Крейга Дюваля и Ребекку Кук за доступ к данным и лабораторным ресурсам для проведения этих исследований. Авторы благодарят институт по наноразмерным наукам и разработкам (VINSE) Вандербильта для доступа к инструментам DLS и ТЕА (EPS 1004083). Авторы благодарят Национальный научный фонд за поддержку программы стипендий для выпускников исследовательских программ (ННФ # 1445197). Авторы благодарят национальные институты здравоохранения за финансовую поддержку (низ R01 EB019409). Авторы благодарят программу медицинского исследования Министерства обороны США, направленную на финансовую поддержку (ДМО OR130302).
0.45 mm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
FBS | Gibco | 26140079 | |
loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGCAAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACUGAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUUAUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUACGCGUA*T* *DNA bases |
square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |