Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593
Automatic Translation
1, 1
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

Summary

Vi beskriver en metode til brug af multiparametrflow cytometri til at detektere mitokondrie reaktive oxygenarter (ROS) i murine sund hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller (Hspc'er) og leukæmiceller fra en musemodel af akut myeloid leukæmi (AML) drevet af MLL-AF9.

Abstract

Vi præsenterer en flow cytometrisk tilgang til analyse af mitokondrie ROS i forskellige levende knoglemarv (BM)-afledte stamceller og progenitorcelle populationer fra raske mus samt mus med AML drevet af MLL-AF9. Specifikt beskriver vi en to-trins celle farvningsproces, hvor raske eller leukæmi-BM-celler først farves med et fluorogent farvestof, der detekterer mitokondrie-super oxider, efterfulgt af farvning med fluorochrome-forbundne monoklonale antistoffer, der anvendes at skelne mellem forskellige sunde og maligne hæmatopoietiske stamceller populationer. Vi tilbyder også en strategi for at erhverve og analysere prøverne ved flow cytometri. Hele protokollen kan gennemføres i en tidsramme så kort som 3-4 h. Vi fremhæver også de vigtigste variabler til at overveje, samt de fordele og begrænsninger af overvågning ros produktion i mitokondrie rum af levende hæmatopoietiske og leukæmi stamme og progenitorsubpopulationer ved hjælp af fluorogene farvestoffer ved flow flowcytometri . Desuden præsenterer vi data, som mitokondrie ros overflod varierer blandt forskellige sunde HSPC sub-populationer og leukæmi forfædre og diskutere mulige anvendelser af denne teknik i Hæmatologisk forskning.

Introduction

Reaktive Oxygenarter (ROS) er meget reaktive molekyler afledt af Molekylær ilt. Den mest veldefinerede cellulære placering af ROS produktion er mitokondrierne, hvor elektroner, der passerer gennem elektrontransportkæden (ETC) under oxidativ fosforylering (OXPHOS) absorberes af Molekylær ilt fører til dannelsen af en specifik type af ROS kaldet superoxider1. Gennem handlinger af en række enzymer, kaldet superoxiddismutases eller sod'er, omdannes super oxider til hydrogenperoxider, som efterfølgende neutraliseres i vand af enzymer som katalase eller glutathion peroxidaser (GPX). Forstyrrelser i ROS-reguleringsmekanismer kan føre til den overskydende produktion af ROS, der ofte omtales som oxidativt stress, som har skadelige og potentielt dødbringende cellulære konsekvenser, såsom makromolekyle skade (dvs. DNA, protein, fedtstoffer). Desuden er oxidativ stress relateret til flere patologier, såsom diabetes, inflammatoriske sygdomme, aldring og tumorer2,3,4. For at opretholde redox homøostase og forebygge oxidativ stress, celler besidder en række ROS-regulerende mekanismer5.

Fysiologiske niveauer af visse ROS er nødvendige for ordentlig embryonale og voksne hæmatopoiese6. Men overskydende ROS er forbundet med DNA-skader, cellulær differentiering og udmattelse af den hæmatopoietiske stilk og progenitorceller pool. Der er også tegn på, at ændringer i redox biologi kan variere mellem leukæmi og raske celler. For eksempel, ros niveauer tendens til at være højere i akut myeloid leukæmi (AML) celler i forhold til deres sunde modparter og andre undersøgelser har antydet, at leukæmi stamceller opretholde en lav Steady-State niveau af ros for overlevelse7,8. Vigtigere, strategier for terapeutisk kapitalisering på disse redox forskelle har vist løfte i flere menneskelige kræft indstillinger9,10. Derfor kan analyser, der giver mulighed for at vurdere ROS-niveauer i musemodeller, forbedre vores forståelse af, hvordan disse arter bidrager til cellulær fysiologi og sygdoms patogenese samt potentielt udgøre en platform til vurdering af effektiviteten af nye redox-målrettede anti-cancer terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de dyreforsøg, der er beskrevet i denne protokol, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) hos Fox Chase Cancer Center.

Bemærk: Protokol arbejdsgangen er inddelt i 4 dele som vist i figur 1 , og de påkrævede reagenser er anført i tabellen over materialer.

1. isolering af knoglemarv (BM)

Bemærk: MLL-AF9 leukæmi mus blev genereret som beskrevet tidligere11.

  1. Inddrive mono-nukleare knoglemarvsceller, som beskrevet tidligere12,13,14,15, fra vilde type C57. Bl6 mus (som udtrykker CD 45.2 congenic markør) samt fra C57. Bl6-SJL mus (som udtrykker CD 45.1 congenic markør), der er blevet transplanteret med MLL-AF9-udtrykker leukæmiceller (CD 45.2+).
    Bemærk: BM kan inddrives fra mus enten ved at knuse12,13 eller ved at skylle knogler14,15. For de eksperimenter, der præsenteres her, blev BM genvundet fra både raske og leukæmi mus via Flushing.

2. mitokondrie ROS Fluorogent farvestof farvning

  1. Når mono-nukleare knoglemarvsceller er blevet genvundet fra raske og/eller leukæmi mus, plette en alikvot af celler med Trypan blå og tælle ved hjælp af en hemocytometer til at bestemme startantallet af samlede BM celler.
  2. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Aspirér supernatanten og resuspension af pellet i F-PBS (PBS suppleret med 2% føtal kvægserum og en 1% penicillin/streptomycin cocktail) til en koncentration på 2 x 106 celler/ml.
  3. Alikvot 200 μL cellesuspension pr. rør til 9 enkelt farve kontrolrør mærket som følger:
    No Stain, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (kun for raske Hspc'er), CD 45.2-APC (kun for leukæmiceller), CD34-FITC, mitokondrie ROS farvestof og levende/døde celle pletter.
    Bemærk: Valgfri En positiv kontrol for induktion af mitokondrie ROS kan tilberedes ved at behandle 2 x 105 celler i 200 μl med 20 ΜM af menadion Natriumbisulfit (MSB) i 1 time ved 37 °c i en 5% Co2 inkubator. En anden kontrol til at vende MSB-medieret induktion af mitokondrie ROS kan fremstilles ved at behandle 2 x 105 celler i 200 μl med 20 ΜM MSB plus 100 μM N-acetyl-L-Cystein (NAC) for 1 h ved 37 °c i en 5% Co2 inkubator.
  4. Alikvot de resterende celler i et rør (eksperimentelt rør) og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
  5. Resuspender cellerne i F-PBS med en levende/dødt celle plet i henhold til producentens anvisninger. Inkuber på is i 30 min. Sørg for at tilføje levende/døde pletter til den enkelt-farve kontrol røret.
  6. Tilsæt 1,0 mL rumtemperatur (RT) F-PBS til både enkelt-farve og eksperimentelle rør farvet med levende/dødt farvestof. Centrifuge 5 min ved 300 x g ved rt.
  7. Resuspension 50 μg mitokondrie ROS farvestof i 13 μL dimethylsulfoxid (DMSO) for at opnå en 5 mM stamopløsning.
  8. Mitokondrie ROS-farvestof fortyndes til en endelig koncentration på 5 μM i RT F-PBS med eller uden verapamil (50 μM).
  9. Aspirer fra vask af levende/døde celle pletter. Tilsæt 200 μL mitokondrie ROS Dye Stain indeholdende verapamil til hver eksperimentel tube samt mitokondrie ROS farvestof enkelt farve kontrol rør.
  10. Vortex til at blande og inkubere i 10 min ved 37 °C i mørke.
  11. Tilsæt 1,0 mL RT F-PBS til mitokondrie ROS-farvede enkelt farve kontrol og eksperimentelle rør. Centrifuge 5 min ved 300 x g ved rt.
  12. Aspirer af supernatanten, og vask cellerne med yderligere 1,0 mL RT F-PBS. Centrifuge 5 min ved 300 x g ved rt.

3. Lineage antistof farvning

  1. Forbered de antistof-cocktails, der er anført i tabel 1.
    Bemærk: Disse antistoffer cocktails er blevet optimeret tidligere14,15,16.
  2. Supernatanten aspirerer fra den endelige mitokondrie ROS farvestof vask af forsøgs rørene indeholdende sund BM og tilsæt 200 μL antistof cocktail #1 til hvert rør. Vortex til at blande. Også forberede den enkelt-farve kontrol rør. Inkuber i 60 min på is i mørket.
  3. Supernatanten fra den endelige mitokondrie ROS Dye Wash af de eksperimentelle rør, der indeholder leukæmi BM og tilsæt 200 μL af antistof cocktail #2 til hvert rør. Vortex til at blande. Inkuber i 60 min på is i mørket.
  4. Vask med 1,0 mL kold F-PBS og centrifuge 5 min ved 300 x g ved rt.
  5. Resuspender cellerne i 500 μL kold F-PBS, og Filtrer cellerne i et flow flowcytometer-rør med et 40 μm-filter for at udelukke aggregater.

4. erhvervelse og analyse af strømnings cytometri

Bemærk: Flere hæmatopoietiske stamceller og progenitorundersæt er sjældne, såsom langvarige hæmatopoietiske stamcelle. Således bør ideelt 3-5 million hændelser indsamles for hvert eksperimentelt rør under flow flowcytometri erhvervelse for tilstrækkelig analyse af mitokondrie ros i de forskellige HSPC subsets.

  1. Brug No-Stain Control tube til at indstille Forward (FSC-A) og side (SSC-A) scatter plots baseret på størrelsen og kompleksiteten af celle populationen analyseret.
  2. Brug kontrolrørene uden pletter og enkelt farve for at kompensere for flow cytometer.
  3. Udport fremmede rester fra frem-og side scatter plot (figur 2A, B, første panel fra venstre).
  4. Gate out form ved hjælp af en dobbelt diskriminator såsom Forward diskriminator (figur 2a, B, andet panel fra venstre).
  5. Følg gating strategi foreslået i figur 2a,B til at vælge levende celler, Lineage lave celler og de forskellige HSPC og leukæmi subsets.
  6. For hver population af interesse, analysere median fluorescens intensitet (MFI) af TRPE-kanalen (x-aksen) i et histogram plot for at evaluere forskelle i mitokondrie ROS signal (figur 3a-C, venstre paneler). Niveauer af mitokondrie ROS kan evalueres på enkelt celleniveau ved at sammenligne mitokondrie ROS farvning versus specifikke Lineage markører i en scatter plot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Præsenteret er en metode til at analysere ROS i mitokondrier af flere sunde og MLL-AF9-udtrykker leukæmi stamceller populationer. Figur 1 viser en skematisk visning af protokollen workflow, som består af 4 store trin: 1) BM isolation fra mus; 2) farvning BM celler med et fluorogent farvestof, der genkender mitokondrie ROS, især super oxider; 3) overflade markør antistof farvning til afgrænse forskellige raske og leukæmi hæmatopoietiske populationer; og 4) flow cytometri erhvervelse og analyse.

Figur 2 A, B skildrer en repræsentativ gating strategi for at analysere forskellige hæmatopoietiske stilk og stamceller populationer i sund og leukæmi BM. En FSC/SSC plot anvendes til at eliminere snavs og et FSC-område (FSC-A) versus FSC-højde (FSC-H) plot bruges til at udelukke form og aggregater. Et panel af Lineage overflade markører (tabel 1 og trin 3,1) kombineres for at udelukke en række modne hæmatopoietiske populationer såsom lymfocytter, erythrocytter, granulocytter og monocytter/makrofager (dvs. afstamning lav eller Linlav). Lineage cocktail indeholder også et CD48 antistof, og derfor er alle undersæt af Lineage lave celler også CD48-. SCA-1 og c-kit celleoverflade ekspression anvendes til at skelne mellem en heterogen blanding af de såkaldte CD48- lsks (LinLow, SCA-1+, c-kit+, CD48-) fra myeloid progenitorer (LinLow, SCA-1- , c-kit+, CD48-). For yderligere at skelne mellem forskellige HSPC subsets, slam markør, CD150 samt CD34 er også tilføjet17,18,19,20,21. Figur 2 B skildrer også en repræsentativ gating strategi for ckit High-udtrykker leukæmi forfædre (LinLow, c-kitHigh; SCA-1-), som er beriget til leukæmi initierende celler (LICs)11 samt leukæmiceller, der udtrykker mellem-lav ekspression af ckit (ckitint-lav).

En sammenligning af mitokondrie ROS farvning mellem raske CD48- LSK og myeloid progenitorer viser, at myeloid progenitorer vise betydeligt højere niveauer af mitokondrie ros farvning (figur 3A). Desuden, ckithøj leukæmi forfædre vise betydeligt højere niveauer af mitokondrie ros farvning i forhold til CD48- LSK, myeloid forfædre eller ckitint-lav leukæmiceller (figur 3A). cKitint-lav leukæmiceller også vist betydeligt højere mitokondrie ros farvning i forhold til CD48- LSK celler, men ikke til myeloid afkom (figur 3A). LSKs yderligere sub-divideret med CD150 udtryk viste, at mitokondrie ROS farvning ikke signifikant varierer i CD48- LSK celler sub-DIVIDERET med CD150 høj (CD150høj), mellemliggende (CD150int) eller No (CD150neg) udtryk (figur 3B). Men, Steady-State mitokondrie ROS farvning af cKithøj eller ckitint-lav leukæmiceller blev fundet at være betydeligt højere end CD48-Lsks-CD150høj,-CD150int eller-CD150neg celler ( Figur 3B). LSK-celler, der udtrykker lave til ingen niveauer af CD34 er beriget til langsigtede rekonstituerende hæmatopoietiske stamceller, især CD48-LSK celler, som er CD34- og CD150høj20,21. Imidlertid afslørede subdividere CD48- LSK celler med CD150 og CD34 udtryk ingen signifikante forskelle i mitokondrie ros-farvning blandt disse seks HSPC-delsæt (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk gengivelse af protokol arbejdets forløb. Trin 1) BM isolation fra raske og MLL-AF9 leukæmi mus; Trin 2) cellulære farvning ved hjælp af en mitokondrie ROS farvestof (mROS); Trin 3) cellulær farvning med fluorokrom-forbundne monoklonale antistoffer til at diskriminere hæmatopoietiske stamceller og progenitorcellerne (Hspc'er) i raske og leukæmi-mus; Trin 4) flow cytometri erhvervelse og analyse af mitokondrie ROS i flere HSPC populationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Flow cytometri gating strategier for sunde og MLL-AF9-udtrykker knoglemarv celler. (A) BM-celler isoleret fra raske mus blev plettet med et levende/dødt farvestof (qdot), mitokondrie ros Dye (trpe). BM fra raske mus blev efterfølgende plettet med antistoffer, som anerkender Lineage markører plus CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) ud overlevende/døde celle og mitokondrie ros PLETTER, BM fra leukæmi mus blev også farvet med antistoffer anerkende Lineage MARKØRER plus CD48 (CY5-PE), c-Kit (CY7-APC), Sca1 (pacblue) og CD 45.2 (APC), som anvendes til at diskriminere mellem MLL-AF9 leukæmiceller fra raske modtager BM celler (CD 45.1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Mitokondrie ros niveauer i sund og MLL-AF9 knoglemarv. Venstre paneler er repræsentative histogrammer af mitokondrie ROS niveauer af de angivne populationer og de respektive højre paneler repræsenterer bar graf analyser af MFI af mitokondrie ROS for de angivne populationer (n = 4). (A) sammenligning af MITOKONDRIE ros niveauer i sund CD48- LSK, MYELOID stamceller samt MLL-AF9 LinLow c-kithøj og MLL-AF9 Linlav c-kitint-lav celle. (B) sammenligning af mitokondrie ros niveauer i sunde CD48- LSK celler baseret på deres CD150 udtryk versus MLL-AF9 LinLow c-kithøj og MLL-AF9 LinLow c-kitint-lave celler. (C) sammenligning af MITOKONDRIE ros niveauer i sunde CD48- LSK celler baseret på deres CD150 og CD34 udtryk. (* p ≤ 0,05; * * p < 0,01 * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Ændringer i mitokondrie ros niveauer ved hjælp af Pro-og anti-oxidant forbindelser. Histogrammer af mitokondrie ROS niveauer i raske og MLL-AF9-udtrykker BM celler behandlet med 20 μM af menadion natriumbisulfit (MSB) for 1 h ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator (positiv kontrol) eller med 20 μm af MSB i kombination med 100 μM N-acetyl-L-Cystein (NAC) for 1 t ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Optimering af mitokondrie ros og Lineage-genkendelse af antistof pletter. (A) sammenligning af MITOKONDRIE ros (mros) niveauer i MLL-AF9 udtrykker leukæmiceller ved hjælp af 1 eller 5 μM for enten 10 eller 30 min. (rød = køretøj; Blå = MSB 20 μM; Grøn = NAC 100 μM; Orange = MSB 20 μM + NAC 100 μM). B) sammenligning af MFI-CD34 kanalen (FITC) i raske lsks, som er farvet i 20, 60 eller 90 min med antistof-cocktail #1 (n = 4, * p ≤ 0,05; * * p < 0,01). C) sammenligning af antistoffer ved farvning før eller efter inkubationen i 30 min ved 37 °c i en 5% Co2 -kuruator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Kendelse af mitokondrie ros og Lineage markør antistof farvning. A) dot-parceller af de angivne Hspc'er, der er fremstillet ved anvendelse af forskellige farvnings ordrer. B) mitokondrielle ros-niveauer, der er evalueret i de LSK-og myeloide progenitors-rum, som er blevet anvendt i forskellig rækkefølge (rød = antistof farvning i 1 time ved 4 °c efterfulgt af mitokondrie ros i 10 min. ved 37 °c; Blå = mitokondrie ROS farvning i 10 min ved 37 °C efterfulgt af antistof farvning 1H ved 4 °C). C) kvantificering af MFI ' er af mitokondrie ros (mros) farvning ved hjælp af forskellige ordrer af farvning i de angivne populationer (n = 4, * p ≤ 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Virkningen af verapamil behandling på mitokondrie ros farvestof farvning i sund og MLL-AF9-udtrykker BM celler. A) prik områderne for de angivne HSPC-populationer i prøver behandlet med eller uden 50 ΜM verapamil i 10 min ved 37 °c i en 5% Co2 -inkubator. B) histogrammer af mitokondrie ros og mitoMASS grøn farvestof farvning i de INDIKEREDE HSPC populationer i tilstedeværelse (blå) eller fravær (rød) af 50 ΜM verapamil. (C-E) Kvantificering af mitokondrielle ROS-niveauer i de indikerede raske (C & D) og leukæmi (E) cellepopulationer i BM-prøver behandlet med eller uden 50 μM verapamil under mitokondrie ROS-farvning (n = 4, * p ≤ 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: antistof-cocktails. Liste over antistof-cocktails tilberedt i trin 3,1. at identificere forskellige hæmatopoietiske sub-populationer inden for sund og leukæmi knoglemarv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fluorogene farvestoffer, der er udviklet til påvisning af ROS, evalueres ofte i faste celler ved mikroskopi eller i levende celler ved flow cytometri22. Flow cytometrisk evaluering af mitokondrie ROS i BM-celler ved hjælp af mitokondrie ROS fluorogene farvestoffer har to store fordele: 1) det er en hurtig og enkel teknik, der er egnet til levende celle analyse og 2) det giver mulighed for at skelne og analysere sjældne populationer på enkelt celleniveau i BM ved hjælp af overflade markør farvning. Den trin-for-trin-protokol, der præsenteres her, er blevet udviklet for at studere ex vivo redox-status af hæmatopoietisk stilk og stamceller fra både raske mus samt en musemodel af AML drevet af MLL-AF9 ved hjælp af flow cytometri. Der er flere vigtige tekniske variabler, der skal tages i betragtning under gennemførelsen af denne protokol.

For det første, brugen af Pro-og anti-oxidant kontrol giver brugeren mulighed for at etablere en baseline for stigninger i mitokondrie ROS farvning samt specificiteten af pletten. For den protokol, der præsenteres her, den Pro-oxidant MSB blev udnyttet som en positiv kontrol for en detekterbar induktion af mitokondrie ROS farvning i både raske og leukæmi BM celler (figur 4). Den anti-oxidant NAC kan bruges som en ekstra kontrol, da det i høj grad vender mitokondrie ros farvning induceret af MSB (figur 4).

For det andet anbefales det, at mitokondrie ROS fluorogen farvestof, der anvendes i dette studie, bruges i en koncentration på 5 μM i 10 min. Fabrikanten foreslår dog også, at koncentrationen og tidspunktet for farvning kan variere mellem celletyper. I denne undersøgelse blev mitokondrie ROS farvning sammenlignet ved både 1 μM og 5 μM for enten 10 eller 30 min. Analysen viste, at en koncentration på 5 μM for enten 10 til 30 min er tilstrækkelig til at detektere MSB-medierede ændringer i mitokondrie ROS samt dem vendt ved NAC behandling (figur 5a). Da der ikke var nogen kvantitativ forskel mellem 10 og 30 min, blev der valgt en farvnings tidspunkt på 10 minutter til denne undersøgelse for at minimere analysens længde.

For det tredje, CD34 antistof inkubationstiderne varierer i litteraturen fra 20 til 90 min23,24. For at optimere den protokol, der præsenteres her, blev murine knoglemarvsceller inkuberet med antistof cocktail #1 (trin 3,1) for 20, 60 eller 90 min. Som vist i figur 5b, signifikant stærkere CD34 farvning blev observeret på celler farves for 60 eller 90 min sammenlignet med 20 min plet. Der blev dog ikke observeret en signifikant forskel i CD34 farvning mellem antistof inkubationstider på 60 og 90 min (figur 5b), og derfor anbefales en 60 min antistof bejdsning til den præsenterede protokol.

Fjerde, i den præsenterede protokol, både raske og leukæmiceller er først plettet med mitokondrie ros fluorogen farvestof, vasket og derefter farvet med fluorochrome-forbundet Lineage antistoffer. Selv om der ikke blev gennemført en direkte vurdering af kombinationen af mitokondrie ROS-pletten med Lineage-antistoffer i dette studie, blev en vurdering af fluorokrom-bundet Lineage-antistof-farvning underlagt mitokondrielle ROS-farvnings betingelser for 10, 20 og 30 min. ved 37 °C. Denne analyse afslørede, at 30 min inkubation ved 37 °C i væsentlig grad ændrer overflade markør farvning i Lineage (figur 5c). Desuden blev mitokondrie ROS farvning evalueret af First, farvning sunde BM celler med fluorchrome-linkede Lineage antistoffer efterfulgt af farvning med mitokondrie ROS fluorogen farvestof samt vice versa rækkefølge af operationer. Farvning celler først med Lineage antistoffer efterfulgt af mitokondrie ROS farvning resulterede i lavere mitokondrie ROS signaler i forhold til vice versa farvning protokol (figur 6a, B)-herunder betydelige forskelle for CD48- LSK CD150høj, CD48- LSK CD150int CD34 og myeloid stamcellepopulationer (figur 6c).

For det femte viser nylige undersøgelser, at forskellige murine raske HSPC-populationer besidder forskellige evner til at effluks flere mitokondrielle farvnings fluorogene sonder, såsom dem, der anvendes til at vurdere mitokondriel masse (i det følgende benævnt "mitomass Green") eller potentiel25,26. Derfor blev virkningen af effluks-pumpe hæmmeren verapamil på farvning af raske og leukæmi progenitorer med mitokondrie ros fluorogen farvestof også vurderet. Samtidig farvning af Hspc'er med mitokondrie ROS ikke ændre Lineage markør antistof farvning (figur 7a), men, verapamil gjorde betydeligt forbedre mitokondrie ros farvning signaler i en række sunde og leukæmi progenitorpopulationer (figur 7b, C). Især omfanget af forbedrede mitokondrie ros farvning af verapamil var ikke så stor som den, der ses med mitomass grønne fluorogen farvestof (figur 7b).

Sjette, i den protokol, der præsenteres her, BM celler blev genvundet ved at fjerne knogle spidser (epiphyse) efterfulgt af rødmen af knoglerne. Epifyser indeholder imidlertid hæmatopoietiske celler, der potentielt kan gå tabt ved knogle skylning. Som et alternativ kan BM-celler udvindes ved at mashing Bones med en mørtel og Pestle som tidligere beskrevet12,13.

Den protokol, der præsenteres her, giver et fundament for brugen af fluorogene farvestoffer til at måle intracellulær redox biologi i levende celler udvundet af levende organismer. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at intet enkelt fluorogent farvestof kan antages at være endeligt specifikt, og der bør derfor gennemføres yderligere undersøgelser med alternative metoder for at verificere eventuelle fund. Desuden, resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at leukæmi cellepopulationer beriget for LICs (dvs., Linlav ckithøj) vise højere niveauer af MITOKONDRIE ros end raske myeloid progenitorer eller andre HSPC populationer. Men, Linlav ckithøj leukæmi cellepopulation evalueret her har vist sig at være heterogene og kan yderligere sub-divideret med andre Lineage markører11,27. Endvidere, nylige undersøgelser viser, at LICs besidder en distinkt metabolisk fænotype28. Derfor vil fremtidige undersøgelser, der vurderer mitokondrie ROS parallelt med metaboliske assays eller sonder samt yderligere Lineage markør antistoffer være informative.

Denne enkle protokol giver mulighed for måling af mitokondrie ROS niveauer i levende hæmatopoietiske celler og kan danne grundlag for at studere redox biologi af sunde og syge stamceller og progenitorcellerne samt til vurdering af effektiviteten af redox-målrettede terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Fox Chase Cancer Center bestyrelse (DDM), American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) og Department of Defense (Award #: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Tags

Kræftforskning AML HSCs ROS super oxider mitochondrier flow flowcytometer
Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M.… More

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter