Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

साल्मोनेला में स्वास्थ्य के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए डिजिटल पीसीआर-आधारित प्रतियोगी सूचकांक

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

जीवाणु फिटनेस का निर्धारण करने के लिए यह आणविक आधारित दृष्टिकोण अद्वितीय जीनोमिक डीएनए बारकोड का उपयोग कर सूक्ष्मजीवों का सटीक और सटीक पता लगाने की सुविधा देता है जो डिजिटल पीसीआर के माध्यम से परिमाणित होते हैं। प्रोटोकॉल साल्मोनेला उपभेदों के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक की गणना का वर्णन करता है; हालांकि, प्रौद्योगिकी आसानी से किसी भी आनुवंशिक रूप से मैले करने योग्य जीव के पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है.

Abstract

एक प्रतिस्पर्धी सूचकांक एक आम तरीका है जीवाणु फिटनेस और / इस दृष्टिकोण की उपयोगिता प्रदर्शन करने के लिए अपनी आसानी और एक जंगली प्रकार के जीव के लिए कई उपभेदों की फिटनेस मानकीकृत करने की क्षमता से उदाहरण है. तकनीक सीमित है, तथापि, उपलब्ध phenotypic मार्करों और उपभेदों कि एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है की संख्या से, दोहराने प्रयोगों की एक बड़ी संख्या के लिए की जरूरत पैदा. प्रयोगों की बड़ी संख्या के साथ समवर्ती, phenotypic मार्करों के आधार पर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए श्रम और सामग्री की लागत नगण्य नहीं हैं. सकारात्मक पहलुओं को बनाए रखते हुए इन नकारात्मक पहलुओं पर काबू पाने के लिए, हमने जीवाणु गुणसूत्रों पर आनुवंशिक मार्करों को इंजीनियरिंग के बाद सीधे सूक्ष्मजीवों की मात्रा निर्धारित करने के लिए आणविक-आधारित दृष्टिकोण विकसित किया है। अद्वितीय, 25 आधार जोड़ी डीएनए बारकोड जंगली प्रकार और साल्मोनेलाके उत्परिवर्ती उपभेदों के गुणसूत्र पर एक अहानिकर टिड्डी पर डाला गया था। इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोगों में पूल्ड उपभेदों से मिलकर inocula का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. प्रतियोगिता के बाद, प्रत्येक तनाव की निरपेक्ष संख्या डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित की गई थी और प्रत्येक तनाव के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक उन मूल्यों से गणना की गई. हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि Salmonella मात्रा निर्धारित करने के लिए इस दृष्टिकोण बेहद संवेदनशील है, सटीक, और दोनों अत्यधिक प्रचुर मात्रा में (उच्च फिटनेस) और दुर्लभ (कम फिटनेस) सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के लिए सटीक. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को आसानी से संशोधन करने में सक्षम गुणसूत्रों के साथ लगभग किसी भी जीव के लिए अनुकूल है, साथ ही विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन है कि सूक्ष्मजीवों की पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता है.

Introduction

रोगजनक जीवों की फिटनेस और उग्रता का आकलन माइक्रोबायोलॉजी अनुसंधान का एक मूलभूत पहलू है। यह उपभेदों के बीच या उत्परिवर्तित जीवों के बीच तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है, जो शोधकर्ताओं विशिष्ट परिस्थितियों के तहत कुछ जीन के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. परंपरागत रूप से, उग्र मूल्यांकन विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग कर संक्रमण के एक पशु मॉडल का इस्तेमाल करता है और संक्रमित जानवर के परिणाम को देख (जैसे संक्रामक खुराक50, घातक खुराक50, मौत के लिए समय, लक्षण गंभीरता, की कमी लक्षण, आदि). इस प्रक्रिया उग्रता के मूल्यवान विवरण प्रदान करता है, लेकिन यह क्रम में जंगली प्रकार से विविधताओं का पता लगाने के लिए परिणामों में काफी मतभेद पैदा करने के लिए उपभेदों की आवश्यकता है. इसके अलावा, परिणाम अर्द्ध मात्रात्मक हैं क्योंकि जबकि रोग प्रगति और लक्षण गंभीरता व्यक्तिपरक समय के साथ परिमाणित किया जा सकता है, जंगली प्रकार की तुलना में उग्रता की व्याख्या अधिक गुणात्मक है (यानी अधिक, कम, या समान रूप से उग्र). पशु infectivity परख प्रदर्शन करने के लिए एक आम विकल्प प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीआईए) उत्पन्न करने के लिए है, मूल्यों है कि सीधे फिटनेस या एक मिश्रित संक्रमण1में एक जंगली प्रकार समकक्ष करने के लिए एक तनाव की उग्रता की तुलना. इस तकनीक को एक जंगली प्रकार तनाव के लिए उग्रता मानकीकृत और क्षीणन की डिग्री को प्रतिबिंबित करने के लिए एक परिमाणात्मक मूल्य का निर्धारण द्वारा संक्रमण के एक पारंपरिक पशु मॉडल पर कई फायदे हैं. इस तकनीक को बैक्टीरिया में जीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो रद्द प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीओआई)2का निर्धारण करके किया जा सकता है। उत्परिवर्तित जीवों के एक समूह के लिए एक सीओआई की गणना शोधकर्ताओं को निर्धारित करने के लिए कि क्या दो जीन स्वतंत्र रूप से रोगजनन में योगदान या यदि वे एक ही उग्रता मार्ग में शामिल हैं और एक दूसरे पर निर्भर करने की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, सीआई की गणना करने के लिए बैक्टीरिया की गणना की आवश्यकता होती है जो जीवों के रोगजनन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। CIs और COIs भी शोधकर्ताओं avirulent उपभेदों कि नैदानिक रोग का कारण नहीं है, लेकिन अभी भी फिटनेस में मतभेद है का आकलन करने के लिए अनुमति देते हैं. इस तकनीक को पारंपरिक एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के उपयोग के लिए उपभेदों की पहचान द्वारा सीमित है, जिससे एक समय में केवल एक या दो के लिए इनपुट उपभेदों की संख्या सीमित. इस सीमा के कारण, प्रयोगात्मक समूहों और प्रतिकृति की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, जो श्रम और सामग्री की लागत को जोड़ने के अलावा, भी प्रयोगात्मक स्थितियों और गलत परिणामों में परिवर्तनशीलता के लिए अवसर बढ़ जाती है. (उग्रता, फिटनेस, और जीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए मिश्रित संक्रमण का उपयोग करने के लाभों और अनुप्रयोगों की पूरी तरह से समीक्षा के लिए, C.R. Beuzn और D.W. Holden 1) देखें

इस सीमा को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जैसे प्रवाह साइटोमेट्री3,4,5के माध्यम से मात्रा निर्धारित फ्लोरोसेंट-लेबल कोशिकाओं का उपयोग । इस तकनीक या तो का उपयोग कर कोशिकाओं की मात्रा 1) phenotypic मार्करों या 2 के लिए एंटीबॉडी लेबल अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन किया. लेबल किए गए एंटीबॉडी के उपयोग में 1,000 कोशिकाओं/एमएल का पता लगाने की सीमा होती है, और इसलिए3का विश्लेषण करने के लिए उच्च संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में शरीर क्रिया विज्ञान बदल जाता है और उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति6के परिणामस्वरूप फिटनेस परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं . दोनों तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने का पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट मार्करों की संख्या द्वारा सीमित कर रहे हैं. आण्विक परिमाणीकरण में प्रगति एक माइक्रोरेरे तकनीक के विकास के माध्यम से प्राप्त की गई थी , जिसने एक म्यूरीन मॉडल7में 1,000 से अधिक उपभेदों के प्रारंभिक मिश्रित संक्रमण से 120 उपभेदों में क्षीणन का पता लगाया था . इस तकनीक उत्परिवर्तित उपभेदों से आरएनए के एक microarray विश्लेषण का उपयोग किया, जो परिणाम में काफी परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व.  फिर भी, यह स्थापित किया है कि मिश्रित संक्रमण के बड़े पूल एक उपयोगी उपकरण हो सकता है और संवेदनशील पता लगाने की तकनीक का उपयोग करके, जीवाणु उग्रता में मतभेद की पहचान की जा सकती है. अगली पीढ़ी अनुक्रमण के विकास के साथ, Tn-सेक transposon उत्परिवर्तनों की उपयोगिता का विस्तार, बैक्टीरिया हैकि बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तित 8,9,10थे परिमाणित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि को सक्षम करने, 11| हाल ही में एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था जो ट्रांसपोसन की आवश्यकता को समाप्त करताहै और इसके बजाय डीएनए बारकोड का उपयोग जीनोमिक परिवर्तनों की और फिटनेस पर उनके प्रभाव को आसानी से पहचानने और ट्रैक करने के लिए करता है . यह तकनीक एक प्रमुख प्रगति है, लेकिन जीनोमिक बारकोड की प्रविष्टि अभी भी एक यादृच्छिक प्रक्रिया है. पिछले प्रयोगों की randomness पर काबू पाने के लिए, Yoon एट अल. बैक्टीरिया13के गुणसूत्रों पर सटीक स्थानों पर डाला अद्वितीय डीएनए बारकोड का उपयोग कर Salmonella उपभेदों के CIs की गणना करने के लिए एक विधि विकसित की है। अद्वितीय बारकोड उपभेदों प्रत्येक अद्वितीय बारकोड के लिए विशिष्ट SYBR हरे और प्राइमर के साथ एक QPCR आधारित विधि का उपयोग कर पाया गया. तकनीक QPCR द्वारा लगाए गए बाधाओं द्वारा सीमित किया गया था, प्राइमर क्षमता और कम संवेदनशीलता में मतभेद सहित, नेस्टेड-पीसीआर के लिए की आवश्यकता से पहले द्वारा सबूत QPCR. फिर भी, इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है कि लक्षित जीनोमिक संशोधनों का पता लगाने और कई जीवाणु उपभेदों के संभावित परिमाणात्मक पूल के लिए शोषण किया जा सकता है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम मिश्रित inocula के बड़े पूल के साथ जीवाणु प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक उपन्यास पद्धति का वर्णन एक अत्यधिक संवेदनशील डिजिटल पीसीआर तकनीक का उपयोग कर सटीक परिमाणीकरण के बाद. प्रोटोकॉल में गुणसूत्र के अहानिकर क्षेत्र पर सम्मिलित एक अद्वितीय डीएनए बारकोड के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल जीवाणु उपभेदों शामिल है। इस संशोधन उपभेदों जल्दी और सही पारंपरिक धारावाहिक कमजोर पड़ने के बजाय आधुनिक आणविक प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, प्रतिकृति चढ़ाना, और गिनती कॉलोनी बनाने इकाइयों है कि phenotypic मार्करों पर भरोसा करते हैं (यानी एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रतिरोध ). संशोधनों एक एकल पूल inoculum में कई उपभेदों के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, काफी हद तक प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की संभावना को कम करने क्योंकि सभी उपभेदों सटीक एक ही स्थिति को उजागर कर रहे हैं. इसके अलावा, जबकि इस तकनीक Salmonella enterica serovar Typhimurium में विकसित किया गया था, यह अत्यधिक किसी भी आनुवंशिक रूप से आघात करने योग्य जीव और लगभग किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन जहां सटीक जीवाणु गिनती की आवश्यकता है के लिए अनुकूलनीय है, एक नया प्रदान उपकरण पिछले तरीकों द्वारा लगाए गए बाधाओं के बिना सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में सटीकता और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. एक प्लासमिड पर अद्वितीय डीएनए बारकोड शामिल करें जिसमें एलीलिक एक्सचेंज के लिए आवश्यक घटक शामिल हैं

नोट: एक नया प्लाज्मिड, नाम pSKAP, एक उच्च प्रतिलिपि संख्या और मौजूदा pKD13 allelic विनिमय प्लाज्मिड की तुलना में वृद्धि हुई परिवर्तन दक्षता के साथ बनाया गया था. यह चरण 1-1-1-12 में वर्णित है (चित्र 1)। एलाइजा एक्सचेंज के लिए अद्वितीय डीएनए बारकोड और घटकों वाले अंतिम ीकृत प्लाज्मिड एक प्लाज्मिड भंडार (सामग्री तालिका) के माध्यम से उपलब्ध हैं ।

  1. एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करना, pKD1314 और pPCR स्क्रिप्ट कैम एसके+ रात भर से बैक्टीरिया संस्कृतियों से Luria-Bertani (LB) शोरबा के साथ पूरक 50g/ एस.के.+, क्रमशः) (सारणी 1)।
  2. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक प्रतिबंध एंजाइमों HindIII और BamHI का उपयोग कर दोनों प्लाज्मिड पर प्रतिबंध पाचन प्रदर्शन करते हैं।
  3. प्रतिबंध एंजाइमों निकालें और pPCR स्क्रिप्ट कैम एस के+ प्रतिक्रिया से डीएनए excised और 3,370 आधार जोड़ी (बीपी) प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी को शुद्ध निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए सफाई किट का उपयोग कर.
  4. एक 1% agarose जेल पर pKD13 प्रतिबंध पाचन से टुकड़े अलग एक electrophoresis कक्ष का उपयोग कर.
  5. नीले प्रकाश ट्रांसलियुमिनेटर का उपयोग करके बैंडों को विज़ुअलाइज़ करें और जेल से 1,333 बीपी का टुकड़ा निकाल दें (चित्र 1C) ।
    नोट: इस टुकड़े में गुणसूत्र एलाइजा प्रतिस्थापन के लिए आवश्यक एफआरटी-फ्लैंक्ड कानामाइसिन प्रतिरोध जीन होता है।
  6. एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर कदम 1.5 से excised डीएनए को शुद्ध करें।
  7. pSKAP बनाने के लिए, pKD13 से शुद्ध टुकड़ा ligate (चरण 1.6 से) pPCR स्क्रिप्ट कैम एसकेमें + (चरण 1.3 से) निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक T4 डीएनए ligase का उपयोग कर.
  8. निर्माता के प्रोटोकॉल (तालिका 1) के बाद ligated pSKAP प्लाज्मिड के साथ रासायनिक रूप से सक्षम DH5 ] कोशिकाओं को बदलना।
  9. एलबी आगर प्लेटों पर फैले ट्रांसफार्मरों को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 ग्राम/एमएल कानामाइसिन और इनक्यूबेट के साथ पूरक किया गया।
  10. प्लेट से एक कॉलोनी उठाओ और इसे एक नई एलबी आगर प्लेट पर लकीर 50 ग्राम/एमएल कानामाइसिन के साथ पूरक और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। इस प्लेट से एक कॉलोनी उठाओ और एलबी शोरबा टीका करने के लिए उपयोग 50 g/ निरंतर आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति इनक्यूबेट करें।
  11. रात भर जीवाणु संस्कृति से pSKAP शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज़्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करें।
  12. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार हिंद III और Bam HI का उपयोग कर चरण 1.11 से प्लाज्मिड का नैदानिक प्रतिबंध पाचन करें। कदम 1.4-1.5 में के रूप में एक 1% agarose जेल पर टुकड़े कल्पना.
    नोट: PSKAP कुल आकार 4,703 बीपी होना चाहिए. खंड चरण 1.12 के बाद 3,370 और 1,333 बीपी होना चाहिए।
  13. सम्मिलित साइट-निर्देशित मटजनन (एसडीएम) (तालिका 2 और एस 1) के लिए डिजाइन पीसीआर प्राइमर इस तरह से है कि pSKAP की स्थिति 725 पर एक अद्वितीय 25-आधारीय डीएनए अनुक्रम सम्मिलित करने के लिए ( चित्र2)।
    नोट: बारकोड डीएनए बस FRT-फ्लैंक बंद kanamycin प्रतिरोध जीन के बाहर प्लाज्मिड में डाला जाता है, तो बारकोड kanamycin प्रतिरोध कैसेट के बाद हटाने के दौरान खो नहीं है. यदि नए बारकोड दृश्यों को उत्पन्न कर रहा है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए ऑनलाइन टूल का उपयोग करें कि फ्लोरोसेंट-लेबल लक्ष्य-विशिष्ट PCR जांच (इसके बाद केवल "प्रोब्स" के रूप में संदर्भित) कुशलतापूर्वक नए अनुक्रम से बाध्य होगा. उन्हें बनाने के लिए आवश्यक प्राइमर के साथ-साथ, तिथि करने के लिए डिज़ाइन किए गए सम्मिलन अनुक्रम, टेबल्स 2 और S1में प्रदान किए जाते हैं।
  14. एक वाणिज्यिक उच्च निष्ठा डीएनए polymerase, वांछित प्राइमर जोड़े (तालिका 2), और pSKAP टेम्पलेट का उपयोग कर एसडीएम प्रतिक्रियाओं तैयार करें। थर्मोसाइकिलर को निम्नलिखित कार्य करने के लिए सेट करें: 1) 30 s, 2) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 15 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 3) दोहराने के चरण 2, 24 बार, 4) 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 5) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  15. पीसीआर के पूरा होने के बाद, प्रतिक्रिया करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम Dpn मैं जोड़कर pSKAP टेम्पलेट deplete. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: उत्पाद के आकार और शुद्धता को सत्यापित करने के लिए पीसीआर से उत्पादों को एक agarose जेल पर कल्पना की जानी चाहिए। एक नियंत्रण Dpn मैं पाचन unmodified pSKAP टेम्पलेट से मिलकर किया जा सकता है और बाद के चरणों में इस्तेमाल किया सुनिश्चित करने के लिए टेम्पलेट डीएनए पूरी तरह से पचा है.
  16. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार वाणिज्यिक रासायनिक रूप से सक्षम DH5 कोशिकाओं के 100 $L को बदलने के लिए चरण 1.15 से उत्पाद के 5 डिग्री एल का उपयोग करें।
  17. एलबी आगर प्लेटों पर फैले रूपांतरकों को रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 ग्राम/एमएल क्लोरएम्हेनिकॉल और इनक्यूबेट के साथ पूरक किया गया।
  18. रात भर प्लेटों से एक कॉलोनी (या कालोनियों) का चयन करें और व्यक्तिगत एलबी आगर प्लेटों पर लकीर का चयन करें जो 25 ग्राम/एमएल क्लोरैम्हेनिकॉल के साथ पूरक है और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रात भर प्लेटों से एक कॉलोनी का चयन करें और एलबी शोरबा के 5 एमएल टीका करने के लिए उपयोग 25 ग्राम / लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट संस्कृति (एस)।
  19. रात भर संस्कृति (ओं) से प्लाज्मिड को शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज़्मिड मिनीप्रेप किट का उपयोग करें।
  20. M13 Forward अनुक्रम प्राइमर (तालिका2) का उपयोग करते हुए संगर अनुक्रम शुद्ध प्लाज्मिड्स । उत्परिवर्तित क्षेत्र की तुलना मूल प्लाज्मिड से करें और एसडीएम सम्मिलित सटीकता के लिए आकलन करें।
  21. बारकोड प्रविष्टि और सटीकता की पुष्टि करने के बाद, प्रत्येक बारकोड और प्लाज्मिड एक नाम असाइन करें।
    नोट: आज तक उत्पन्न बारकोड को दो-अक्षर ों का पदनाम सौंपा गया है: ए.ए., एबी, एसी, ..., बीए, बी बी, बीसी, आदि। Barcoded plasmids pSKAP$AA, pSKAP]A, pSKAP]AC, ..., pSKAP]BA, pSKAP]BB, pSKAP]BC, आदि के रूप में निरूपित कर रहे हैं
  22. डीएनए बारकोड की वांछित संख्या उत्पन्न करने के लिए चरण 1.14-1.21 दोहराएँ।

2. एस के क्रोमोसोम पर डीएनए बारकोड परिचय. टाइफिमुरियम

नोट: एस पर डीएनए बारकोड की प्रविष्टि Typhimurium गुणसूत्र एक allelic विनिमय विधि Datsenko और Wanner14 कि एस में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है द्वारा वर्णित का उपयोग करके हासिल की है. टायफिमुरियम।

  1. एस पर टिड्डी का निर्धारण करें। Typhimurium जीनोम जिस पर डीएनए बारकोड डालने के लिए (चित्र 3) .
    नोट: गुणसूत्र के एक बड़े, अंतरजनित क्षेत्र का चयन करें। गैर-कोडिंग आरएनए का उत्पादन करने वाले क्षेत्रों से बचें। इस अध्ययन में अवशेषों के बीच डाल पी के डाउनस्ट्रीम का उपयोग किया 1,213,840 और 1,213,861 (जीनोम विधानसभा GCA से निर्धारित GCA]000022165.1). इस क्षेत्र में पहले आनुवंशिक रूप से जीनों के पारपूरकन में15के लिए हेरफेर किया गया है . वैकल्पिक रूप से, एक डीएनए बारकोड शुरू किया जा सकता है, जबकि एक साथ ब्याज की एक जीन को बाधित. ऐसा करने के लिए इस प्रोटोकॉल में कम से कम परिवर्तन की आवश्यकता होगी और उत्परिवर्ती निर्माण को कारगर बनाना होगा।
  2. डिजाइन पीसीआर प्राइमर अद्वितीय बारकोड और FRT-फ्लैंक्ड kanamycin प्रतिरोध जीन वांछित pSKAP बारकोड युक्त प्लाज्मिड से बढ़ाना करने के लिए कदम 1.21 (तालिका 2)। प्रत्येक प्राइमर (तालिका 2) के 5 के अंत में चरण 2.1 में चयनित क्षेत्रके लिए समजात हैं कि 40-न्यूक्लिओटाइड एक्सटेंशन जोड़ें।
  3. एक वाणिज्यिक उच्च निष्ठा polymerase, कदम 2.2 से प्राइमर, और टेम्पलेट के रूप में वांछित pSKAP बारकोड युक्त प्लाज्मिड का उपयोग प्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं। थर्मोसाइकिलर को निम्नलिखित कार्य करने के लिए सेट करें: 1) 30 s, 2) 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 3) 15 s के लिए 56 डिग्री सेल्सियस, 60 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, दोहराने के चरण 2-4 29 बार, 5) 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट, 6) 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  4. पीसीआर के पूरा होने के बाद, चरण 1.15 में वर्णित के रूप में DpnI का उपयोग कर टेम्पलेट डीएनए deplete. शुद्ध और निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए सफाई किट का उपयोग कर डीएनए ध्यान केंद्रित।
  5. एसमें म्यूटेंट बनाने के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का संदर्भ लें। Typhimurium पीसीआर उत्पादों से 14028s तनाव14,16,17,18.
    नोट: यह आवश्यक नहीं है कि कानामाइसिन प्रतिरोध जीन गुणसूत्र से निकाला जाता है। हालांकि, जीन का उच्छेदन जीवाणु गुणसूत्र के लिए न्यूनतम विघटनकारी है क्योंकि यह 129 बीपी निशान का परिणाम है जो संभावित डाउनस्ट्रीम जीन को फ्रेम में छोड़ देगा। यह अनुशंसा की जाती है कि कानामाइसिन प्रतिरोध जीन युक्त तनाव को बनाए रखा जाता है क्योंकि इसका उपयोग P22-मध्यस्थ ट्रांसडक्शन के माध्यम से उपभेदों के बीच बारकोड को स्थानांतरित करने के लिए किया जा सकता है।
  6. कदम दोहराएँ 2.3 - 2.5 उपयुक्त बारकोड के साथ वांछित उपभेदों बनाने के लिए.
    नोट: बारकोड जंगली प्रकार एस में पेश किया जा सकता है। Typhimurium है कि तब आगे आनुवंशिक हेरफेर के अधीन किया जा सकता है, या बारकोड उपभेदों है कि पहले आनुवंशिक रूप से बदल दिया गया है में पेश किया जा सकता है.

3. जीवाणु विकास की स्थिति और इन विट्रो प्रतियोगिता परख

  1. बैक्टीरिया स्टॉक से, लकीर वांछित एस| Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक LB agar प्लेटों पर एक अद्वितीय डीएनए बारकोड बंदरगाह. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट प्लेटें।
  2. प्रत्येक तनाव से एक एकल कॉलोनी का चयन करें और एलबी शोरबा के 5 एमएल टीका। लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 एच के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: रात भर की संस्कृति का उपयोग करना, कदम 3.5 करने के लिए प्रत्येक बारकोड तनाव से शुद्ध जीनोमिक डीएनए (gDNA) इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ें. यह अनुभाग 6 में अनुवर्ती मान्यता और नियंत्रण प्रयोगों के लिए आवश्यक है।
  3. प्रत्येक प्रतियोगिता परख के लिए, एक उचित आकार बाँझ ट्यूब में प्रत्येक रात संस्कृति के एक समान मात्रा हस्तांतरण. अच्छी तरह से कम से कम 5 s के लिए तेजी से भंवर द्वारा एक साथ उपभेदों मिश्रण.
    नोट: प्रत्येक रात भर संस्कृति की मात्रा हस्तांतरण करने के लिए प्रत्येक शर्त और दोहराने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, साथ ही इनपुट मात्रा निर्धारित करने के लिए gDNA अलग करने के लिए. हालांकि यह पूरी तरह से संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के लिए आवश्यक नहीं है क्योंकि इनपुट सूक्ष्मजीवों की पूर्ण संख्या डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जाएगा, प्रत्येक तनाव के लिए इनपुट बैक्टीरिया की संख्या लगभग बाधाओं से बचने के लिए बराबर होना चाहिए या प्रयोग के प्रारंभ में असमान प्रतिस्पर्धा। प्रतिनिधि प्रतियोगिता इस प्रोटोकॉल में assays 8 उपभेदों की वृद्धि दर एक साथ तुलना में. अतिरिक्त या कम उपभेदों व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक हो सकता है.
  4. मिश्रित इनोकुलम के 100 डिग्री सेल्सियस को 4.9 एमएल बाँझ एलबी शोरबा में स्थानांतरित करें। वांछित समय के लिए या एक वांछित ऑप्टिकल घनत्व के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा इनोकुलम की फसल 500 $L निकालें और सुपरनेंट को त्याग दें। कोशिकाओं के साथ अनुभाग 4 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
  6. वांछित समय बिंदुओं पर, 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर centrifugation द्वारा संस्कृति और फसल कोशिकाओं के 500 $L alicots निकालें. निकालें और supernatant त्यागें.
    नोट: यदि एकाधिक timepoints पर alicots इकट्ठा, -20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों फ्रीज या तुरंत प्रत्येक संग्रह के बाद 4.1 कदम के लिए आगे बढ़ना.

4. एस से इकट्ठा करने और परिमाणात्मक gDNA | Typhimurium (चरण 3.5 और 3.6 से)

  1. एक वाणिज्यिक gDNA शुद्धि किट का उपयोग कर कोशिकाओं से हार्वेस्ट gDNA. यदि उपलब्ध हो, तो वैकल्पिक आरएनए अवक्षय चरण निष्पादित करें।
    नोट: आरएनए कमी आवश्यक नहीं है; हालांकि, आरएनए की उपस्थिति कृत्रिम रूप से डीएनए एकाग्रता में वृद्धि होगी, बाद के चरणों में aberant गणना करने के लिए अग्रणी. यदि एक वाणिज्यिक gDNA शुद्धि किट का उपयोग कर, स्तंभ डीएनए के साथ अधिभारित नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें. नमूना बाद के चरणों में परिमाणात्मक है, तो कोई न्यूनतम डीएनए एकाग्रता की आवश्यकता है.
  2. प्रत्येक नमूने में डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें.
    नोट: डीएनए किसी भी विश्वसनीय विधि का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
  3. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करते हुए जीवाणु जीनोम आकार के आधार पर gDNA प्रतिलिपि संख्या की गणना करें जहां: ग् एनजी में डीएनए की मात्रा है और छ एक डबल-स्ट्रेंड डीएनए अणु (जीनोम आकार) की लंबाई है।
    Equation 1
    नोट: 660 g/mole 1 डीएनए बीपी के औसत द्रव्यमान के रूप में प्रयोग किया जाता है। जीव के न्यूक्लिओटाइड संघटन के आधार पर छोटी भिन्नताएं मौजूद हो सकती हैं। कई calculators गणना करने के लिए ऑनलाइन उपलब्ध हैं.

5. डिजाइन प्राइमर और dDigital पीसीआर के माध्यम से डीएनए बारकोड की मात्रात्मक जांच के लिए जांच

  1. एसके बारकोड क्षेत्र बढ़ाना करने के लिए प्राइमर डिजाइन करें। त्यम्मरियम गुणसूत्र पुटपी के नीचे की ओर (चित्र 3ै तथा सारणी 2)।
    नोट: प्राइमर और जांच डिजाइन कई ऑनलाइन कार्यक्रमों (सामग्री की तालिका) द्वारा सुविधा प्रदान की जा सकती है। यदि सभी बारकोड एक ही loci पर डाला जाता है, प्रवर्धन प्राइमर का एक एकल सेट सभी बारकोड के लिए सार्वभौमिक है।
  2. डिजाइन 6-कार्बोक्सीफ्लुओरेसिन (FAM)-आधारित और/या हेक्साक्लोरोफ्लोरेसिन (HEX) आधारित प्रत्येक बारकोड के लिए विशिष्ट जांच (तालिका2 और S1)।
    नोट: इस प्रयोग में प्रयुक्त छोटी-छोटी पाठक मल्टीप्लेक्स अभिक्रिया में एक साथ FAM- और HEX-आधारित जांच दोनों का पता लगाने में सक्षम है। एचईएक्स का उपयोग करने के लिए FAM और 1/2 का उपयोग करने के लिए जांच के 1/ यह एक आवश्यक कदम नहीं है, लेकिन अगर लागू अभिकर्मक उपयोग और प्रयोगात्मक लागत कम हो जाएगा.
  3. 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर घोला जा सकता है युक्त 1) प्रत्येक आगे और रिवर्स प्रवर्धन प्राइमर के 20 एमएम, 2) एक भी FAM जांच के 10 mM, और 3) एक ही एचईएक्स जांच के 10 m (यदि मल्टीप्लेक्सिंग).

6. प्रत्येक जीनोमिक बारकोड डिजिटल पीसीआर का उपयोग करने के लिए प्रत्येक Pprimer-प्रोब सेट की संवेदनशीलता और विशिष्टता को मान्य करें

नोट: इस प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में आठ अद्वितीय जांच के साथ आठ अद्वितीय बारकोड मान्य का उपयोग करता है. उपयोग किए गए बारकोड की संख्या को विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइनों को समायोजित करने के लिए बढ़ाया या कम किया जा सकता है।

  1. एक के अलावा हर बारकोड शामिल है कि gDNA का एक पूल बनाएँ. एक शेष बारकोड युक्त gDNA के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन करने के लिए diluent के रूप में इस पूल का प्रयोग करें (नमूना कमजोर पड़ने योजना चित्र 4में प्रदान की जाती है )।
    नोट: एक diluent के रूप में जमा gDNA का उपयोग संवेदनशीलता का पता लगाने जबकि एक सुसंगत पृष्ठभूमि सुनिश्चित करता है. चरण 4.3 में निर्धारित प्रतिलिपि संख्याओं का उपयोग करके, gDNA को अनुशंसित डिजिटल PCR श्रेणी (1-100,000 प्रति 20 डिग्री सेल्सियस अभिक्रिया) के भीतर प्रतिलिपि संख्या को पतला कर देता है. ध्यान रखें कि श्रेणी प्रत्येक अद्वितीय लक्ष्य (बारकोड) के लिए सेट की गई है, न कि कुल gDNA.
  2. जांच आधारित रसायन विज्ञान के लिए डिजाइन एक डिजिटल पीसीआर supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डुप्लिकेट में डिजिटल पीसीआर के लिए प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। टेम्पलेट डीएनए के रूप में चरण 6.1 से मिश्रण का उपयोग करें. चरण 5.3 से 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग करें जिसमें चरण 6.1 में पतला बारकोड के लिए जांच शामिल है।
  3. जांच आधारित रसायन विज्ञान के लिए डिजाइन एक डिजिटल पीसीआर supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डिजिटल पीसीआर के लिए नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को दोहराने तैयार करें। प्रत्येक जाँच मिश्रण के लिए नियंत्रण प्रतिक्रियाओं में 1) कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTCs), 2) ऋणात्मक नियंत्रण, और 3) धनात्मक नियंत्रण शामिल नहीं होने चाहिए.
    नोट: प्रतिकृति नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की न्यूनतम संख्या दो है. इस उदाहरण प्रोटोकॉल चार NTCs, छह नकारात्मक नियंत्रण, और प्रत्येक बारकोड के लिए छह धनात्मक नियंत्रण का उपयोग करता है। नकारात्मक नियंत्रण परीक्षण किया जा रहा जांच करने के लिए इसी बारकोड को छोड़कर प्रत्येक बारकोड के साथ gDNA शामिल होना चाहिए. यह प्रत्येक जांच की विशिष्टता को मान्य करेगा।
  4. प्रत्येक बारकोड किए गए gDNA नमूने के लिए डिजिटल PCR प्रतिक्रियाएँ बनाने के लिए चरण 6-1-6.3 दोहराएँ. चित्र 5में एक नमूना प्लेट व्यवस्था प्रस्तुत की गई है।
    नोट: यह और बाद के कदम एक विशिष्ट डिजिटल पीसीआर मंच है कि बूंदों और प्रवाह आधारित प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल के आधार पर वर्णित हैं. चिप आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करने वाले वैकल्पिक डिजिटल पीसीआर प्लेटफॉर्म को आसानी से इस प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। चरण 6.4 सभी प्राइमर सेट को मान्य करने के लिए एक से अधिक 96-वेल प्लेट की आवश्यकता हो सकती है। QPCR के विपरीत, अलग प्लेटें डिजिटल पीसीआर द्वारा विश्लेषण आसानी से प्लेटों के बीच मानकीकृत संदर्भ कुओं के लिए आवश्यकता के बिना तुलना की जा सकती है.
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बूंद जनरेटर का उपयोग कर प्रत्येक प्रतिक्रिया हालत के लिए बूंदों उत्पन्न करते हैं।
  6. नई बनाई गई बूंदों को उपयुक्त 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। 5-50 डिग्री मल्टीचैनल पिपेट पर 200 डिग्री एल पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    नोट: जब pipeting बूंदों, पिपेट धीरे धीरे और आसानी से! डिजिटल पीसीआर उपकरण निर्माता एक विशेष निर्माता (जैसे, रैनिन) से केवल पिपेट और पिपेट युक्तियों का उपयोग करने की सिफारिश करता है। इन pipette युक्तियाँ कोई सूक्ष्म प्लास्टिक के टुकड़े है कि बूंदों को नष्ट कर सकते हैं या छोटी बूंद पाठक के microfluidics नुकसान के साथ एक चिकनी खोलने है. सुझावों के कई ब्रांडों की जांच की और विनिर्माण गुणवत्ता के एक स्पेक्ट्रम है मनाया गया. समतुल्य परिणाम pipette टिप विकल्प का उपयोग कर प्राप्त किया गया है; हालांकि, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए जब निर्माता की सिफारिशों से अलग.
  7. सभी बूंदों उत्पन्न और स्थानांतरित कर दिया गया है के बाद, एक पन्नी प्लेट सील के साथ थाली सील।
  8. निम्नलिखित साइकिल की स्थिति को निष्पादित करने के लिए निर्माता-अनुशंसित थर्मोसाइकिलर का उपयोग करें: 1) 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 2) 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट रैंप दर; 3) 2 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, रैंप दर 1 डिग्री सेल्सियस पर सेट; 4) दोहराने के कदम 2 और 3 49 बार; 5) 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 6) 24 ज तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    नोट: एक छोटी बूंद प्रतिक्रिया में थर्मल हस्तांतरण मानक पीसीआर के रूप में ही नहीं है। प्रतिक्रिया की स्थिति में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।
  9. जबकि thermocycling प्रदर्शन किया जा रहा है, इस तरह के नमूना नाम के रूप में प्लेट सेटअप जानकारी के साथ डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर कार्यक्रम, प्रयोग प्रकार (निरपेक्ष परिमाणीकरण), supermix इस्तेमाल किया, लक्ष्य 1 नाम (FAM बारकोड नाम), लक्ष्य 1 प्रकार (NTC, सकारात्मक नियंत्रण, ऋणात्मक नियंत्रण, या अज्ञात), लक्ष्य 2 नाम (HEX बारकोड नाम), लक्ष्य 2 प्रकार (रिक्त, धनात्मक नियंत्रण, ऋणात्मक नियंत्रण, या अज्ञात). अंतिम प्लेट सेटअप जानकारी चित्र 5में दिखाई गई है।
  10. thermocycling पूरा होने के बाद, छोटी बूंद पाठक के लिए पूरा प्रतिक्रियाओं हस्तांतरण और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पढ़ने की प्रक्रिया शुरू करते हैं।

7. एक प्रतियोगी सूचकांक प्रयोग में बैक्टीरिया की संख्या की मात्रा

  1. पतला gDNA अलग और ऊपर वर्णित के रूप में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए खंड 4 से मात्रा निर्धारित.
  2. उपयुक्त supermix का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डिजिटल पीसीआर के लिए प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। टेम्पलेट के रूप में चरण 7.1 से डीएनए का उपयोग करें. प्रयोग में मौजूद संभावित बारकोड के लिए जांच (या दोनों FAM और हेक्स का पता लगाने अगर जांच) शामिल है कि एक 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का प्रयोग करें।
  3. सभी प्रयोगात्मक डिजाइन में उपयोग बारकोड का पता लगाया जा सकता है जब तक विभिन्न 20x प्राइमर-प्रोब मास्टर घोला जा सकता है का उपयोग कर चरण 7.2 में अतिरिक्त डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार।
  4. 6.3 में वर्णित प्रत्येक शर्त के लिए नियंत्रण शामिल करें. यह 1) कोई टेम्पलेट नियंत्रण (NTCs), 2) नकारात्मक नियंत्रण, और 3) धनात्मक नियंत्रण शामिल हैं।
  5. 6.5-6.10 चरणों में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ जारी रखें।

8. डिजिटल पीसीआर डेटा का विश्लेषण और निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या की गणना

  1. जब सभी कुएँ पढ़ ली गई हों और चलाएँ पूर्ण हो, तो डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके .Qlp डेटा फ़ाइल खोलें.
    नोट: यहाँ वर्णित फ़ाइल प्रकार और डेटा विश्लेषण कार्यविधियाँ एक डिजिटल PCR निर्माता के लिए विशिष्ट हैं. वैकल्पिक डिजिटल PCR प्लेटफॉर्म्स का उपयोग करते हैं, तो फ़ाइल प्रकार और डेटा विश्लेषण कार्यविधियाँ उपयोग किए गए प्लेटफ़ॉर्म के लिए विशिष्ट होंगे और निर्माता की अनुशंसा किए गए विनिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए।
  2. एक ही प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग है कि सभी कुओं का चयन करें।
  3. ड्रॉपलेट टैब पर, प्रत्येक अच्छी तरह से (दोनों सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों) में विश्लेषित बूंदों की संख्या की जांच करें। 10,000 से कम कुल बूंदों है कि किसी भी अच्छी तरह से विश्लेषण से निकालें।
  4. 1D आयाम टैब पर ले जाएँ और सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के आयाम की जांच. सुनिश्चित करें कि वे दो अलग आबादी शामिल हैं.
  5. सॉफ्टवेयर के भीतर, दहलीज सुविधा का उपयोग करने के लिए प्रत्येक जांच है कि उपयोग किया गया था के लिए सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों के बीच एक कटऑफ बनाने के लिए (चित्र6).
    नोट: चरण 5.3 से एक ही प्राइमर-प्रोब मास्टर मिश्रण का उपयोग करने वाले सभी कुओं में एक ही सीमा होनी चाहिए।
  6. एक बार उपयुक्त सीमा सभी कुओं के लिए लागू किया गया है, सॉफ्टवेयर प्रत्येक प्रतिक्रिया में डीएनए प्रतियां की संख्या की गणना करेगा. आगे विश्लेषण की सुविधा के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात करें।
    नोट: डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए एक Poison वितरण करने के लिए फ़िट हैं जो धनात्मक और ऋणात्मक बूंदों की संख्या का उपयोग करता है।
  7. चरण 8.6 से मानों का उपयोग करना, नमूने में प्रत्येक अद्वितीय जीनोमिक बारकोड की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना करें। ऋणात्मक नियंत्रण अभिक्रियाओं से माध्य मिथ्या धनात्मक दर निर्धारित की जाए तथा इस मान को प्रायोगिक अभिक्रियाओं में प्राप्त मानों से घटाइए। प्रत्येक प्रयोग (तालिका3) की स्थापना करते समय किए गए कमजोर पड़ने के आधार पर आवश्यकतानुसार मानों को गुणा करें।

9. डिजिटल पीसीआर से सीआई या सीओआई की गणना करके किसी जीव के सापेक्ष स्वास्थ्य का निर्धारण करना-आधारित बारकोड्ड ट्रेनों का परिमाणीकरण

  1. निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग कर एक बारकोड्ड तनाव के सीआई की गणना जहां: एकआउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, WTआउटपुट एक ही बारकोड किए गए जंगली-प्रकार बैक्टीरिया का निरपेक्ष परिमाणीकरण है timepoint, एकइनपुट बारकोड्ड तनाव के इनपुट inoculum की पूर्ण परिमाणीकरण है, WTइनपुट बारकोड्ड जंगली प्रकार बैक्टीरिया के इनपुट inoculum की पूर्ण परिमाणीकरण है, एक्सआउटपुट पर सभी उपभेदों का संकलन है एक ही timepoint, एक्सइनपुट सभी बारकोड्ड उपभेदों के कुल इनपुट inoculum का योग है.

Equation 2
Equation 3
नोट: लाभ, नुकसान, और प्रत्येक सूत्र का सबसे उपयुक्त उपयोग के लिए चर्चा देखें।

  1. सभी समय बिंदु पर प्रत्येक बारकोड किए गए तनाव के लिए चरण 9.1 दोहराएँ.
  2. यदि लागू हो, तो निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके सीओआई की गणना करें जहां:एक आउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर उत्परिवर्तित जीन ए के साथ एक बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, एबीआउटपुट एक बारकोडकिए तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन ए और बी के साथ एक ही समय बिंदु पर, एकइनपुट उत्परिवर्तित जीन एके साथ बारकोड्ड तनाव के इनपुट इनोकुलम का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, एबीइनपुट इनपुट इनोकुलम का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन ए और बीके साथ बारकोड्ड तनाव का , बीआउटपुट एक दिए गए समय बिंदु पर उत्परिवर्तित जीन बी के साथ बारकोड्ड तनाव का निरपेक्ष परिमाणीकरण है, और बीइनपुट इनपुट का निरपेक्ष परिमाणीकरण है उत्परिवर्तित जीन बीके साथ बारकोड्ड तनाव का संरोप

Equation 4
और/या
Equation 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस पद्धति का उपयोग करने की आवश्यकता है कि उचित नियंत्रण प्रतिक्रियाओं संवेदनशीलता और लक्ष्य डीएनए की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक जांच की विशिष्टता को मान्य करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इस प्रतिनिधि प्रयोग में, हम पहचान के लिए आठ इसी जांच के साथ आठ अद्वितीय डीएनए बारकोड मान्य. सभी आठ जांचों में एनटीसी और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं (तालिका3) दोनों में झूठी सकारात्मकता की दर कम थी , यहां तक कि अत्यधिक समान डीएनए दृश्यों के बीच भी उनकी विशिष्टता पर प्रकाश डाला गया था। प्रत्येक शर्त की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए, एक अद्वितीय बारकोड युक्त gDNA सात शेष बारकोड दृश्यों में से प्रत्येक युक्त gDNA की एक निरंतर पृष्ठभूमि में क्रमिक पतला किया गया था। ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण के साथ, डिजिटल पीसीआर लगभग 2,000,000 समान डीएनए दृश्यों की पृष्ठभूमि में gDNA की 2 प्रतियां के रूप में कुछ भेद सकता है (तालिका 3)।

संवेदनशीलता और प्रत्येक जांच और डीएनए बारकोड अनुक्रम की विशिष्टता का निर्धारण करने के अलावा, सत्यापन अध्ययन में प्रदर्शन कमजोर पड़ने हमें जिसके परिणामस्वरूप डेटा से एक नकली प्रतिस्पर्धी सूचकांक की गणना करने की अनुमति दी. हालांकि इस प्रयोग के लिए कोई सही इनपुट या आउटपुट नहीं था, डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है जैसे कि एक प्रतियोगिता प्रयोग किया गया है। ऐसा करने के लिए, हम एक आउटपुट के रूप में सीरियल कमजोर पड़ने में प्रत्येक मिश्रण पर विचार (एकआउटपुट) पतला बारकोड के लिए, जबकि कुल उत्पादन (Xआउटपुट), इनपुट (एकइनपुट), और कुल इनपुट (Xइनपुट) प्रत्येक तनाव से गणना की है सभी बारकोड शामिल किए गए हैं, जहां सकारात्मक नियंत्रण में परिमाणीकरण। प्रत्येक मिश्रण के लिए कमजोर पड़ने के कारक का उपयोग करते हुए सैद्धांतिक सीआई निर्धारित किया गया था और तालिका 3में बताया गया है। प्रत्येक बारकोड के लिए किया गया था कि कमजोर पड़ने श्रृंखला में से प्रत्येक में, औसत नकली CI प्रत्येक डुप्लिकेट कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए मानक विचलन के साथ रिपोर्ट किया गया है. सभी मामलों में, नकली सीआई कि गणना की गई सैद्धांतिक सीआई के समान है. परिकलित CIs के बहुमत से कम से कम 25% सैद्धांतिक सीआईए से विचलित. कम सैद्धांतिक CIs के मामलों में, परिकलित मान का विचलन 2-गुना से ऊपर था। उदाहरण के लिए, यह 0.000625 की एक सैद्धांतिक CI से 0.001220 की एक परिकलित CI के लिए कोई परिवर्तन का प्रतिनिधित्व किया। इन डेटा पर प्रकाश डाला है कि वर्णित विधि दोनों अत्यधिक सटीक और अत्यधिक सटीक है. उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, सटीकता, और परिशुद्धता के संयोजन मज़बूती से अन्यथा किसी का ध्यान नहीं जा सकते हैं कि फिटनेस में मतभेद का पता लगाने के लिए इस प्रणाली को सक्षम.

जीनोमिक बारकोड का सही पता लगाया जा सकता है और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि मान्य करने के बाद, हम इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोगों में प्रदर्शन किया (तालिका 4)। पहले प्रतियोगिता प्रयोग आठ जंगली प्रकार एसका उपयोग किया. Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक एक अद्वितीय डीएनए बारकोड निहित. हर तनाव रात भर बड़ा हो गया था, और आठ संस्कृतियों के बराबर मात्रा में एक साथ मिलाया गया. इस मिश्रित इनोकुलम का 100 डिग्री सेल्सियस बाँझ एलबी शोरबा के 4.9 एमएल टीका लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और परिणामस्वरूप संस्कृति लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। प्रत्येक तनाव की सटीक इनपुट की गणना करने के लिए इनोकुलम से gDNA काटा गया था। 600 एनएम (ओडी600) पर अवशोषण को मापने के द्वारा संस्कृति के विकास की निगरानी की गई थी। OD600 में $ 0.5 (लघुगणकीय चरण), एक नमूना प्रत्येक संस्कृति से एकत्र किया गया था और gDNA काटा गया था. शेष संस्कृति को लगातार आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस कर दिया गया था जब तक 8 घंटे के बाद टीका जब एक अंतिम नमूना एकत्र किया गया था और gDNA काटा (स्थिर). परिणाम जमा संक्रमण के लिए संशोधित CI सूत्र का उपयोग कर गणना की गई. जैसा कि अपेक्षित था, सभी जंगली-प्रकार के उपभेदों में सीआई मान लगभग 1 (सारणी 4) के बराबर थे। इसी प्रकार की प्रतियोगिता का प्रयोग आठ उत्परिवर्ती एस. Typhimurium उपभेदों कि प्रत्येक एक एकल के अलावा अद्वितीय बारकोड था, डबल, या ट्रिपल-transketolase कमी18. जैसा कि पहले दिखाया गया है, सभी उपभेदों LB शोरबा में इसी तरह बढ़ी, केवल एक मामूली अंतराल ट्रिपल-transketolase कमी तनाव में मनाया के साथ. हालांकि, जब प्रत्येक तनाव के विकास सीआई का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया गया था, एक बहुत अधिक गहरा दोष transketolase कमी तनाव के लिए मनाया गया था (सीआई शॉ एट अल में विकास घटता की तुलना में किया गया था.18). इसके अलावा, इस प्रयोग ने हमें केवल गुणात्मक वृद्धि पैटर्न का वर्णन करने के बजाय प्रत्येक तनाव की वृद्धि विशेषताओं के लिए एक परिमाणात्मक मूल्य आवंटित करने की अनुमति दी। प्रत्येक तनाव के लिए CIs दोनों पारंपरिक सूत्र जहां प्रत्येक तनाव केवल जंगली प्रकार और संशोधित सूत्र जहां सभी इनपुट उपभेदों पर विचार किया गया था की तुलना में किया गया का उपयोग कर गणना की गई. जबकि परिवर्तन छोटे थे, ट्रिपल-transketolase कमी तनाव के सीआई कृत्रिम रूप से पारंपरिक सूत्र में कम था क्योंकि यह अन्य छह प्रतिस्पर्धा उपभेदों है कि सभी के पास प्रदर्शित के लिए खाता नहीं है-जंगली प्रकार फिटनेस.

उपभेदों जीनोटाइप स्रोत या संदर्भ
एस टायफिमुरियम एटीसीसी 14028s जंगली प्ररूप एटीसीसी
टीटी22236 LT2 साल्मोनेला ले जाने pTP2223 (27)
डीएच 5 ] F- [ 80लाख] M15 ] (लाख[YA-argF) U169 recA1 अंतA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 ]- thi-1 gyrA96 relA1 (28)
जेएएस18077 putP::ए.ए.:एफआरटी यह अध्ययन
जेएएस18080 putP::AD::FRT यह अध्ययन
जेएएस18083 putP::एजी::FRT यह अध्ययन
जेएएस18088 putP::AL::एफआरटी यह अध्ययन
जेएएस18091 putP::एओ::FRT यह अध्ययन
जेएएस18096 putP::एटी::FRT यह अध्ययन
जेएएस18099 putP::AW::FRT यह अध्ययन
जेएएस18100 putP::AX::FRT यह अध्ययन
जेएएस18122 $tktA::FRT putP::AD::FRT यह अध्ययन
जेएएस18130 $tktB::FRT putP::AL::FRT यह अध्ययन
जेएएस18138 $tktC::FRT putP::AT::FRT यह अध्ययन
जेएएस18125 ]tktA::FRT ]tktB::FRT putP::AG::FRT यह अध्ययन
जेएएस18133 $tktA::FRT ]tktC::FRT putP::AO::FRT यह अध्ययन
जेएएस18141 $tktB::FRT ]tktC::FRT putP::AW::FRT यह अध्ययन
जेएएस18142 ]tktA::FRT ]tktB::FRT ]tktC::FRT putP::AX::FRT यह अध्ययन
Plasmids
pKD13 ब्ला FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K (14)
पीपीसीआर स्क्रिप्ट कैम एसके + ColE1 ori; सीएमआर स्ट्रैटजीन/
पीटीपी2223 Plac लाम शर्त एक्सो टीईटीआर (16)
पीसीपी 20 ब्ला बिल्ली cI857 पीआरflp pSC101 oriTS (29)
पी एस केएपी ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी यह अध्ययन
पी एस केएपीजेडएए ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ए.ए. यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.डी. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ई. यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.जी. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; एजी यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.एल. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; अल यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.ओ. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; एओ यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.टी. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; पर यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.डब्ल्यू. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; ए डब्ल्यू यह अध्ययन
पी.एस.के.पी.ए.सी. ColE1 ori; सीएमआर; ब्ला एफआरटी एएचपी एफआरटी; कुल्हाड़ी यह अध्ययन

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त तनाव और प्लाज्मिड।

नाम अनुक्रम (5' - 3')1,2,3
pSKAP एसडीएम ए.ए. - एफ AGAAGTCCTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGATGGAGC
pSKAP एसडीएम ए.ए. - आर ACTCAAGCACCAGGAGACTCT CTCAAGACGGtAATGCTG
पी.एस.के.पी. एसडीएम ई.- एफ. AAGAGCACGGTGAGTAGTAGG CGATTGTGATGGAGC
पी.एस.के.पी. एसडीएम ई. - आर. सीसीटीसीटीसीसीसीटीसीसीटीटीटी CTCAAGACGGtAATGCTG
pSKAP एसडीएम एजी - एफ AGTAGTGTCCTGAGGAGCATGTGA CGATTGTGATGGAGC
pSKAP एसडीएम एजी - आर टीसीसीएटीजीसीसीएजीएसीएक्ट CTCAAGACGGtAATGCTG
पी.एस.के.पी. एसडीएम अल - एफ ACCACACTAGCTAGCT CTCAAGACGGtAATGCTG
पी.एस.के.पी. एसडीएम अल - आर AGAGCTAGTGCCTTCGATGTGTGGGGt CGATTGTGATGGAGC
पी.एस.के.पी.एस.पी.एस.ए.एस.पी.एस.ओ. एफ. जी.टी.सी.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.सी.ए.टी. CTCAAGACGGtAATGCTG
पी.एस.के.पी.एस.पी.एस.एस.ए.एस.पी.एस.ओ. AGTATCACTGAGGTGGTTGGGGGAC CGATTGTGATGGAGC
पी.एस.के.पी. एसडीएम एटी - एफ ACCAGTCCGTGACATGGCTAGAC CGATTGTGATGGAGC
पी.एस.के.पी. एसडीएम एटी - आर जी.टी.सी.टी.सी.टी.टी.टी.टी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी.सी. CTCAAGACGGtAATGCTG
पी.एस.के.पी. एसडीएम एडब्ल्यू - एफ ACGACTGATGATGTGTGTGACG CGATTGTGATGGAGC
पी.एस.के.पी. एसडीएम एडब्ल्यू - आर CGTCACATCCACATCAGTCGT CTCAAGACGGtAATGCTG
pSKAP एसडीएम कुल्हाड़ी - एफ ACTATCGTGGGtACGACCGTG CGATTGTGATGGAGC
pSKAP एसडीएम कुल्हाड़ी - आर कैगसीटीजीजीटीटीसीकागाटैग CTCAAGACGGtAATGCTG
M13 - एफ GTAAACGACGGCA
पी.टी.पी. पुनर्संयोजन - F तगगटगगगगगगगटतत्त्वताता
टीजीसीएजीएसीसीटीसीसी
पी.टी.पी. पुनर्संयोजन - R TACTGCGGGTATGCTGAAACATCACATTG
सीसीटीव्हीच्या जागा
क्यूपीसीआर बारकोड क्षेत्र बढ़ाना - F1 TGCAGCATTACACCTTG
क्यूपीसीआर बारकोड क्षेत्र बढ़ाना - R2 TAGGAACTTCGAAGC
बारकोड ए.ए. जांच - FAM 6-FAM/AGAAGTC/जेन/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
बारकोड ई. जांच - FAM 6-FAM/AAGAGCACG/जेन/GTGAGGTTAGTAGGC/IBFQ
बारकोड एजी जांच - FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/जेन/CTGGAGCATGTGAC/IBFQ
बारकोड अल जांच - FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/जेन/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ
बारकोड एओ जांच - हेक्स HEX/AGTATCACT/जेन/GAGTGTGGGTGGGACC/IBFQ
जांच में बारकोड - हेक्स HEX/ACCAGTGTC/जेन/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
बारकोड AW जांच - हेक्स HEX/ACGACTGAG/जेन/TGATGTGTGACGC/IBFQ
बारकोड कुल्हाड़ी जांच - हेक्स HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACCGGC/IBFQ
1 रेखांकित न्यूक्लिओटाइड एसडीएम के बाद pSKAP पर डाला जाता है कि प्रत्येक डीएनए बारकोड के लिए पूरक दृश्यों से संकेत मिलता है।
२ द्वि-रेखांकित न्यूक्लिओटाइड एसपर एक पूरक क्षेत्र का संकेत देते हैं . टायफिमरियम गुणसूत्र का उपयोग एलाइजा प्रतिस्थापन के लिए किया जाता है।
3 प्राइमटाइम क्यूपीसीआर जांच एक 5' फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल संकरीकरण ओलिगो हैं, या तो 6-carboxyfluorescein (6-FAM) या हेक्साक्लोरोफ्लोरेसिन (HEX), एक आंतरिक क्वेश्चर (जेन), और 3' क्वान्सर आयोवा ब्लैक® FQ (IBFQ).

तालिका 2: इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्राइमर और जांच.

परिमाणीकरण (कॉपी/
विवरण Aa विज्ञापन एजी अल Ao पर ऐडवर्ड्स Ax
एनटीसी एन/ए 0.000 0.000 3.510 एन/ए 0.000 0.000 0.000
एनटीसी 3.600 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
एनटीसी 3.510 0.000 1.280 1.180 2.340 0.000 0.000 0.000
एनटीसी 2.290 0.000 0.000 १.२०० १.१.१० 1.160 0.000 0.000
मतलब 3.133 0.000 0.320 1.473 1.163 0.290 0.000 0.000
नकारात्मक 5.130 1.156 0.000 1.124 3.745 १.२९१ 7.354 7.142
नकारात्मक 5.270 0.000 0.000 1.087 1.666 1.643 7.746 2.269
नकारात्मक 2.660 0.000 1.361 1.451 8.974 0.000 एन/ए 0.000
नकारात्मक 6.090 0.000 0.000 2.251 0.000 2.531 8.700 3.495
नकारात्मक 1.740 0.000 1.086 2.130 4-171 0.000 7.113 5.522
नकारात्मक 6.220 3.581 0.000 4.022 1.175 1.341 एन/ए 5.950
मतलब 4.518 0.789 0.408 २.०११ 3.288 1.133 7.728 4.063
सकारात्मक 22281.540 42673.039 46442.242 45359.180 47885.625 15708.027 45325.906 20810.559
सकारात्मक 23989.676 44625.523 47356.438 45790.660 47456.973 15096.601 47929.840 22455.234
सकारात्मक 17846.824 38980.133 45633.809 44174.820 33875.039 15156.063 42536.270 21467.840
सकारात्मक 21047.588 40140.848 41672.648 46028.496 47426.527 16718.000 46978.664 19876.473
सकारात्मक 20218.238 44660.602 41718.707 45799.375 46495.602 14590.264 54741.023 22011.938
सकारात्मक 18531.740 41620.801 एन/ए 48082.313 35645.199 15341.382 48950.992 21117.559
मतलब 20652.601 42116.824 44564.769 45872.474 43130.827 15435.056 47743.783 21289.934
रिक्त घटाव 20648.083 42116.035 44564.361 45870.463 43127.539 15433.923 47736.054 21285.871
Undiluted एक 23024.961 44448.875 58897.510 51120.948 55450.191 18155.305 62844.068 27567.828
Undiluted बी 18278.174 35252.586 54409.510 66022.396 43101.148 15732.609 60761.328 26581.979
1/50 ए 521.670 755.035 1066.898 1287.187 1053.339 181.324 1278.336 580.961
1/50 बी 435.326 634.215 1168.087 1383.537 991.040 165.443 1180.445 596.461
1/100 ए 228.028 598.848 603.911 631.116 507.956 258.405 665.647 331.590
1/100 बी 256.330 585.834 583.325 670.875 459.325 289.207 638.916 307.948
1/200 ए 121.283 305.293 258.247 346.965 234.774 114.163 169.055 172.553
1/200 बी 114.638 313.040 253.685 297.216 191.637 179.895 280.989 147.297
1/400 ए 42.829 141.343 127.337 163.605 एन/ए 71.241 157.697 85.976
1/400 बी 59.544 180.543 162.080 162.108 115.508 104.682 151.141 87.804
1/800 ए 34.304 67.934 65.939 83.857 66.134 31.784 82.722 45.616
1/800 बी 20.390 80.222 81.453 85.325 53.102 38.034 55.460 29.660
1/1600 ए 15.405 44.505 47.672 39.613 33.027 18.006 37.655 20.988
1/1600 बी 22.091 48.828 46.781 37.388 30.245 30.138 34.553 19.795
1/3200 ए 12.333 22.104 16.850 18.403 11.460 10.535 21.245 9.218
1/3200 बी 6.796 32.555 15.742 26.249 15.111 9.908 23.393 10.175
रिक्त घटाव
Undiluted एक 23020.443 44448.086 58897.103 51118.937 55446.903 18154.172 62836.339 27563.765
Undiluted बी 18273.655 35251.797 54409.103 66020.385 43097.860 15731.477 60753.600 26577.916
1/50 ए 517.152 754.246 1066.490 1285.176 1050.051 180.192 1270.607 576.898
1/50 बी 430.808 633.426 1167.679 1381.526 987.751 164.311 1172.717 592.398
1/100 ए 223.509 598.059 603.503 629.105 504.668 257.272 657.918 327.527
1/100 बी 251.812 585.044 582.918 668.864 456.036 288.074 631.187 303.885
1/200 ए 116.765 304.503 257.840 344.954 231.486 113.030 161.327 168.490
1/200 बी 110.120 312.251 253.277 295.205 188.348 178.762 273.261 143.234
1/400 ए 38.310 140.554 126.929 161.594 एन/ए 70.108 149.968 81.913
1/400 बी 55.026 179.753 161.672 160.097 112.219 103.549 143.413 83.741
1/800 ए 29.786 67.145 65.531 81.847 62.846 30.651 74.994 41.553
1/800 बी 15.872 79.433 81.045 83.314 49.813 36.901 47.732 25.596
1/1600 ए 10.886 43.716 47.264 37.602 29.739 16.874 29.927 16.925
1/1600 बी 17.573 48.039 46.373 35.377 26.957 29.005 26.825 15.732
1/3200 ए 7.815 21.314 16.442 16.392 8.172 9.402 13.517 5.155
1/3200 बी 2.278 31.765 15.334 24.238 11.822 8.776 15.664 6.112
नकली सीआई
Undiluted एक 1.114895 1.055372 1.321619 1.114419 1.285650 1.176251 1.316329 1.294932
Undiluted बी 0.885005 0.837016 १.२२०९११ 1.439279 0.999312 1.019279 1.272698 1.248618
1/50 ए 0.025046 0.017909 0.023931 0.028018 0.024348 0.011675 0.026617 0.027102
1/50 बी 0.020864 0.015040 0.026202 0.030118 0.022903 0.010646 0.024567 0.027831
1/100 ए 0.010825 0.014200 0.013542 0.013715 0.011702 0.016669 0.013782 0.015387
1/100 बी 0.012195 0.013891 0.013080 0.014582 0.010574 0.018665 0.013222 0.014276
1/200 ए 0.005655 0.007230 0.005786 0.007520 0.005367 0.007323 0.003380 0.007916
1/200 बी 0.005333 0.007414 0.005683 0.006436 0.004367 0.011582 0.005724 0.006729
1/400 ए 0.001855 0.003337 0.002848 0.003523 एन/ए 0.004542 0.003142 0.003848
1/400 बी 0.002665 0.004268 0.003628 0.003490 0.002602 0.006709 0.003004 0.003934
1/800 ए 0.001443 0.001594 0.001470 0.001784 0.001457 0.001986 0.001571 0.001952
1/800 बी 0.000769 0.001886 0.001819 0.001816 0.001155 0.002391 0.001000 0.001203
1/1,600 ए 0.000527 0.001038 0.001061 0.000820 0.000690 0.001093 0.000627 0.000795
1/1,600 बी 0.000851 0.001141 0.001041 0.000771 0.000625 0.001879 0.000562 0.000739
1/3,200 ए 0.000378 0.000506 0.000369 0.000357 0.000189 0.000609 0.000283 0.000242
1/3,200 बी 0.000110 0.000754 0.000344 0.000528 0.000274 0.000569 0.000328 0.000287
औसत सीआई (सैद्धांतिक)
अविचलित (1) 0.999950 0.946194 1.271265 1.276849 1.142481 1.097765 1.294514 1.271775
1/50 (0.02) 0.022955 0.016474 0.025067 0.029068 0.023625 0.011161 0.025592 0.027466
1/100 (0.01) 0.011510 0.014046 0.013311 0.014148 0.011138 0.017667 0.013502 0.014832
1/00 (0.005) 0.005494 0.007322 0.005735 0.006978 0.004867 0.009453 0.004552 0.007322
1/400 (0.0025) 0.002260 0.003803 0.003238 0.003507 0.00260* 0.005626 0.003073 0.003891
1/800 (0.00125) 0.001106 0.001740 0.001645 0.001800 0.001306 0.002188 0.001285 0.001577
1/1,600 (0.000625) 0.000689 0.001089 0.001051 0.000795 0.000657 0.001486 0.000594 0.000767
1/3,200 (0.000313) 0.000244 0.000630 0.000357 0.000443 0.000232 0.000589 0.000306 0.000265
मानक विचलन
Undiluted 0.11494 0.10918 0.05035 0.16243 0.14317 0.07849 0.02182 0.02316
1/50 0.00209 0.00143 0.00114 0.00105 0.00072 0.00051 0.00103 0.00036
1/100 0.00069 0.00015 0.00023 0.00043 0.00056 0.00100 0.00028 0.00056
1/200 0.00016 0.00009 0.00005 0.00054 0.00050 0.00213 0.00117 0.00059
1/400 0.00040 0.00047 0.00039 0.00002 0* 0.00108 0.00007 0.00004
1/800 0.00034 0.00015 0.00017 0.00002 0.00015 0.00020 0.00029 0.00037
1/1,600 0.00016 0.00005 0.00001 0.00002 0.00003 0.00039 0.00003 0.00003
1/3,200 0.00013 0.00012 0.00001 0.00009 0.00004 0.00002 0.00002 0.00002
* एक ही प्रयोग से परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है.

तालिका 3: निरपेक्ष परिमाणीकरण और नकली सीआई गणना।

हालत प्रतियोगी सूचकांक1
प्रयोग 1
डब्ल्यूटीए.ए. डब्ल्यूटीई. डब्ल्यूटीएजी डब्ल्यूटीअल डब्ल्यूटीएओ डब्ल्यूटीएटी डब्ल्यूटीएडब्ल्यू डब्ल्यूटीएएक्स
लघुगणकीय 0.927 ] 0.033 0.992 ] 0.031 १.०९०९२२२ 0.921 ] 0.02 १.०९०९२२a 0.03 १.०९१ ] 0.057 १.०९०२२२२ 0.929 $ 0.005
स्थिर १.१] 0.021 १.०९१] 0.053 १.०९०९२२a 0.065 0.948 ] 0.02 0.98 ] 0.02 0.873 ] 0.044 0.97 ] 0.056 १.०२१ ] 0.007
प्रयोग 2
सीआई (पारंपरिक) डब्ल्यूटीए.ए. $AAD $BAL $CAT $ABएजी $ACAO $BCAW $एबीसीकुल्हाड़ी
लघुगणकीय 1 ] 0 0.802 ] 0.084 0.957 ] 0.02 0.989 ] 0.073 0.581 ] 0.153 0.86 ] 0.053 0.995 ] 0.011 0.695 ] 0.061
स्थिर 1 ] 0 0.97 ] 0.063 १.०९०९२a 0.058 0.99 $ 0.036 1.625 ] 0.589 0.835 ] 0.051 0.912 ] 0.047 0.477 ] 0.049
सीआई (पूल्ड इनोकुलम)
लघुगणकीय १.१.१९९ ] 0.039 0.864 ] 0.074 १.०९०९२२ १.१ ] 0.068 0.633 ] 0.152 0.938 ] 0.056 १.१.१११ ] 0.043 0.746 ] 0.06
स्थिर १.०९०९२२a 0.039 १.०९०९२२a 0.049 १.१.१९९९ ] 0.093 १.०९०९२२a 0.01 1.735 ] 0.613 0.876 ] 0.035 0.97 ] 0.045 0.49 ] 0.047
1 मान तीन या चार प्रतिकृति प्रयोगों के लिए CI - मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

तालिका 4: एसके बीच इन विट्रो प्रतियोगिता में प्रतिनिधि परिणाम| Typhimurium उपभेदों.

तालिका S1. उनके पता लगाने के लिए अतिरिक्त बारकोड दृश्यों और इसी फ्लोरोसेंट जांच बनाने के लिए वैकल्पिक प्राइमर. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्र 1. pSKAP का उत्पादन. (ए) शुद्ध pKD13 हिंडIII और BamHI के साथ प्रतिबंध पाचन के अधीन किया गया था. (बी, सी) एक FRT-फ्लैंककिए हुए कानामी प्रतिरोध जीन युक्त ब्याज के 1,333 बीपी टुकड़ा शुद्ध किया गया था. (डी) पीपीसीआर स्क्रिप्ट कैम एसके + को भी हिंडIII और बम्ही के साथ पचाया गया था और पीकेडी13 (बी ) के टुकड़े को उत्पन्न करने के लिए (ई) pSKAP तैयार किया गया था । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सम्मिलित साइट निर्देशित mutagenesis pSKAP करने के लिए. (क) पीसीआर का उपयोग करते हुए स्थिति 725 पर 25 बीपी डीएनए बारकोड का समावेश किया गया था। उस स्थान के लिए विशिष्ट अग्रेषित और रिवर्स प्राइमर को पूरक 25-न्यूक्लिओटाइड 5' एक्सटेंशन के साथ डिजाइन किया गया था (प्राइमर में लोअरकेस "ए") के रूप में निर्दिष्ट किया गया था। (बी) एसडीएम के परिणामस्वरूप एक सामान्य pSKAP]Barcode प्लाज्मिड डाला डीएनए बारकोड पर प्रकाश डाला नारंगी के स्थान के साथ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: PPके Chromosomal पुनर्व्यवस्थित नीचे | (ए) जेड-रेड मध्यस्थता पुनर्संयोजन के बाद, चुनिंदा कानामाइसिन प्रतिरोध जीन (अंधेरे बैंगनी) एफआरटी साइटों (ग्रे) द्वारा flanked टिसी संकेत (क्रोमोसोमल पुनर्संयोजन साइट, लाल) के बीच गुणसूत्र पर डाला जाता है। अद्वितीय डीएनए बारकोड (नारंगी) बस FRT साइट के बाहर डाला जाता है. (बी) कानामाइसिन प्रतिरोध जीन को एफआरटी-मध्यस्थ चीरा द्वारा हटा दिया जाता है, जिससे गुणसूत्र (कुल सम्मिलित डीएनए, नीला) पर सम्मिलित डीएनए का एक अवशेष छोड़ दिया जाता है जिसमें डीएनए बारकोड और एक एफआरटी निशान होता है। (ग) सम्मिलित किए गए डीएनए के आस-पास संशोधित गुणसूत्र डीएनए अनुक्रम डिजिटल पीसीआर के लिए प्रयुक्त प्रवर्धन प्राइमिंग साइटों (हल्के बैंगनी) के साथ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: फ्लोरोसेंट जांच संवेदनशीलता और विशिष्टता को मान्य करने के लिए विकास योजना। (ए) सात बारकोड्ड उपभेदों से शुद्ध gDNA को एक साथ बराबर मात्रा में मिलाया जाता है ताकि लोप किए गए बारकोड किए गए gDNA (ऊपर दिए गए उदाहरण में AX) को कम करने के लिए diluent बनाया जा सके. (बी) पहले वर्णित तैयार diluent का उपयोग कर के लोपित बारकोड gDNA (ऊपर उदाहरण में AX) के एक सीरियल कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। अच्छी तरह से अगले ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक ट्यूब की सामग्री मिश्रण. चित्र 4 BioRender के साथ बनाया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: संवेदनशीलता और प्राइमर-प्रोब सेट की विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए प्लेट लेआउट 1 और 2 सेट करता है। डिजिटल PCR प्रयोग में NTCs, धनात्मक नियंत्रण, नकारात्मक नियंत्रण और प्रत्येक परीक्षण किए गए बारकोड के लिए कमजोर पड़ने की योजनाएँ शामिल होती हैं. प्राइमर-प्रोब सेट 3 और 4 को मान्य करने के लिए प्लेट उपयुक्त बारकोड ्ड gDNA का उपयोग करके एक ही पैटर्न में रखी गई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पतला ए.ए.-बारकोड gDNA के प्रतिनिधि डिजिटल पीसीआर परिणाम। ए.ए. बारकोड युक्त gDNA अन्य सभी बारकोडgd gDNA की पृष्ठभूमि में पतला किया गया था जैसा कि चित्र 4में वर्णित है . चैनल 1 ए.ए. बारकोड (शीर्ष पैनलों) के लिए FAM जांच का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि चैनल 2 एओ बारकोड (नीचे पैनलों) के लिए हेक्स जांच का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक जांच के परिणाम दोनों व्यक्तिगत छोटी बूंद फ्लोरोसेंट आयाम (बाएं पैनलों) और चयनित कुओं (दाएं पैनल) में सभी बूंदों की फ्लोरोसेंट तीव्रता की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व एक हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. प्रत्येक स्थिति के लिए, सकारात्मक (उच्च फ्लोरोसेंट) और नकारात्मक (कम फ्लोरोसेंट) बूंदों दो अलग आबादी फार्म चाहिए. ए.ए. के मामले में है कि पतला था, और सबसे बूंदों नकारात्मक थे, हिस्टोग्राम (ऊपर सही पैनल) केवल एक ही आबादी को दर्शाती प्रतीत होता है. इसका कारण यह है कि सकारात्मक बूंदों काफी नकारात्मक बूंदों से outnumbered हैं; हालांकि, दो अलग आबादी अभी भी बाएँ पैनलों में छोटी बूंद फ्लोरोसेंट आयाम की जांच करके दिखाई दे रहे हैं.  सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों को परिभाषित करने के लिए थ्रेशोल्ड सुविधा का उपयोग करके आबादी को अलग किया जाना चाहिए (गुलाबी रेखा द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया).। थ्रेसहोल्ड मूल्यों का इस्तेमाल किया गया था कि जांच के आधार पर अलग अलग होंगे, लेकिन सभी कुओं कि एक ही जांच मिश्रण का उपयोग समान दहलीज होना चाहिए. ए.ए. बारकोड gDNA पतला किया गया था के रूप में, सकारात्मक (उच्च फ्लोरोसेंट) बूंदों में कमी है, जबकि सकारात्मक एओ बूंदों की संख्या पृष्ठभूमि में स्थिर रहता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सूक्ष्मजीवों की सही मात्रा निर्धारित करने की क्षमता सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए सर्वोपरि महत्व की है, और एक प्रारंभिक मिश्रित आबादी से अद्वितीय उपभेदों की गणना करने की क्षमता में फिटनेस और उग्र लक्षण का आकलन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण साबित हुआ है बैक्टीरिया. हालांकि, इसे पूरा करने की तकनीक आणविक जीव विज्ञान में आधुनिक विकास के साथ गति में प्रगति नहीं की है. एस सहित कई बैक्टीरिया के गुणसूत्रों को आसानी से संशोधित करने के लिए प्रौद्योगिकी। Typhimurium, लगभग दो दशकों के लिए उपलब्ध किया गया है14,अभी तक इस क्षमता शायद ही कभी अद्वितीय डीएनए दृश्यों के साथ आणविक टैगिंग उपभेदों के लिए उपयोग किया गया है. इन आणविक पहचानकर्ताओं का पता लगाने और परिमाणित करने के लिए सबसे अधिक अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी के साथ मिलकर, जीवाणु गुणसूत्र पर डाला अद्वितीय, न्यूनतम-विघ्नकारी डीएनए बारकोड के आधार पर आसानी से पहचाने जाने योग्य उपभेदों बनाने की क्षमता का शोषण करके ( यानी डिजिटल पीसीआर), हम एक प्रणाली है कि उत्तम संवेदनशीलता प्रदान करता है बनाया है, विशिष्टता, सटीकता, और आसानी से बैक्टीरिया की एक विविध आबादी के भीतर व्यक्तिगत उपभेदों परिमाणित करने के लिए परिशुद्धता.

ऊपर वर्णित के रूप में CIs और COIs की गणना करने के लिए सही जीवाणु गुणसूत्रों के लिए उपयुक्त संशोधन करने की क्षमता पर निर्भर करता है. सभी संशोधनों कोई यादृच्छिक उत्परिवर्तन हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए Sanger अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए. एक उच्च निष्ठा polymerase का उपयोग इन त्रुटियों को कम करेगा, लेकिन किसी भी ऐसे उत्परिवर्तन है कि हो सकता है तनाव का पता लगाने की क्षमता ख़राब होगा, जो इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू है. हालांकि हम प्रदर्शन किया है कि डिजिटल पीसीआर लगभग 2 लाख की पृष्ठभूमि में दो gDNA प्रतियां के रूप में कुछ के रूप में पता लगा सकते हैं, इस सीमा के बाहर उपभेदों उनके सटीक परिमाणीकरण के लिए अतिरिक्त कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, डीएनए बारकोड दृश्यों उच्च गुणवत्ता जांच दृश्यों के उपयोग की सुविधा के लिए डिजाइन किया जाना चाहिए. जांच दृश्यों स्वयं के लिए प्रवृत्तियों के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए, फार्म hairpins, या अप्रभावी अपने लक्ष्य को बाँध. गुणवत्ता दृश्यों और जांच का उपयोग करने के महत्व minimalized नहीं किया जा सकता है, एक तथ्य यह है कि सावधान सत्यापन प्रयोगों है कि प्रत्येक जांच के साथ किया जाना चाहिए द्वारा सबूत है. इष्टतम डीएनए बारकोड बनाने के प्रयास इष्टतम डिजिटल पीसीआर परिमाणीकरण परिणाम पैदा करेगा।

जबकि ध्यान से डिजाइन आणविक टैग गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, परिणामों की व्याख्या इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू है. सीआई को उत्परिवर्ती विकृति और निर्गत में जंगली प्रकार के तनाव के बीच के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है जो इनपुट1,19,20में दो उपभेदों के अनुपात से विभाजित होता है। यह पारंपरिक सीआई अनुभाग 9 में प्रस्तुत उपयोगी है जब मिश्रित संक्रमण जंगली प्रकार बनाम केवल एक तनाव के होते हैं. हालांकि, मीडिया या जानवरों को टीका लगाने के लिए उपभेदों के बड़े पूल का उपयोग करते समय, उपभेदों न केवल जंगली प्रकार के खिलाफ प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं, लेकिन यह भी inoculum में मौजूद हर दूसरे तनाव के खिलाफ. पिछले अध्ययनों में , जो अनेक संक्रमित उपभेदों का प्रयोग करके प्रतिस्पर्धा प्रयोग करते थे , अपनी गणनाओं7,13में इसे ध्यान में रखने में असफल रहे हैं . मिश्रित संक्रमण की इस सुविधा के लिए खाते में, हम जमा संक्रमण के लिए संशोधित किया गया है कि CIs की गणना करने के लिए एक सूत्र पेश किया है। यह संभावना नहीं है कि सभी उपभेदों प्रतियोगिता के एक ही स्तर प्रदान करेगा एक जंगली प्रकार तनाव होगा. हालांकि, क्योंकि ज्यादातर जीवाणु जीन उग्रता पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है, प्रतिस्पर्धी सूचकांक प्रयोग में इस्तेमाल उपभेदों की संख्या बढ़ जाती है के रूप में, संभावना है कि समग्र उग्रता जंगली प्रकार तनाव बढ़ जाती है की ओर जाते हैं. यह जरूरी नहीं कि ज्ञात उग्रता दोषों के साथ कई उपभेदों के पूल का उपयोग कर कुछ प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए मामला नहीं हो सकता है। हालांकि, यह संशोधित समीकरण में के लिए जिम्मेदार है क्योंकि परिणाम में कम प्रचुर मात्रा में उपभेदों (कम फिट) एक्सउत्पादनपर एक छोटे प्रभाव पड़ेगा. विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, ऐसे मामले हो सकते हैं जिनमें एक या अन्य सूत्र को प्राथमिकता दी जाती है। ज्यादातर मामलों में पूल्ड संक्रमण से जुड़े, तथापि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि एक मिश्रित संक्रमण में, सभी उपभेदों एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा, न सिर्फ जंगली प्रकार के खिलाफ. परिणामों का विश्लेषण करते समय, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक सूत्र के पीछे तर्क अच्छी तरह से तनाव फिटनेस का सबसे सटीक व्याख्या करने के लिए समझ में आता है. परिणामों की रिपोर्ट करते समय, डेटा का विश्लेषण करने के तरीके का सटीक रूप से खुलासा करना समान रूप से महत्वपूर्ण है.

प्रोटोकॉल की धारा 9 में सीओआई का उपयोग करके जीन इंटरैक्शन निर्धारित करने में मदद करने के लिए सूत्र भी शामिल हैं। इस विश्लेषण के साथ, भविष्यवाणी निर्धारित करने के लिए कि क्या दो उग्र जीन स्वतंत्र रूप से या एक साथ काम किया जा सकता है. सीओआई को इनपुट1में दो उपभेदों के अनुपात से विभाजित आउटपुट में डबल उत्परिवर्ती के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है। सूत्र जीन अवरोधों के phenotypic जोड़िवता का पता लगाने के लिए बनाया गया है. यदि जीन उग्रता को बढ़ाने के लिए स्वतंत्र रूप से कार्य करते हैं, तो दोनों जीनों के विघटन के कारण अकेले किसी भी जीन के एकल व्यवधान की तुलना में फिटनेस में अधिक कमी होनी चाहिए। यदि जीन एक साथ कार्य उग्रता को बढ़ाने के लिए (जैसे जीन एक मार्ग में दो एंजाइमों एन्कोडिंग के रूप में), या तो जीन के विघटन दोनों जीन को बाधित के रूप में उग्रता पर एक ही प्रभाव होना चाहिए. फेनोटाइपिक एडजहांिक की पहचान करना उन मामलों में कठिन हो सकता है जहां एकल जीन के कारण क्षीणन का स्तर या तो बहुत अधिक या बहुत कम होता है। फिर भी, एक ही पशु प्रणाली के भीतर उपभेदों की प्रत्यक्ष तुलना कम परिवर्तनशीलता और जीन के बीच कार्यात्मक संबंध ों का एक अधिक विश्वसनीय खाता प्रदान करता है, और इस गणना एक बड़ा मिश्रित आबादी के भीतर दो उपभेदों से किया जा सकता है.

परिणामों की व्याख्या के लिए एक अंतिम महत्वपूर्ण पहलू जनसंख्या गतिशीलता के प्रभाव पर विचार करने के लिए है. कई उपभेदों है कि कुछ मिश्रित संक्रमण में, एक एकल तनाव यादृच्छिक जनसंख्या बहाव की वजह से या तो अधिक प्रभावी या कम फिट के रूप में उभर सकता है. जब अवरोध की घटनाएं घटित होती हैं तो इस परिघटना को परिलक्षित किया जा सकता है। यह इनपुट उपभेदों की एक बहुत बड़ी संख्या का उपयोग करने से कारण हो सकता है, inoculum में कुल बैक्टीरिया की एक बहुत छोटी संख्या, या दोनों का एक संयोजन. एक और हस्तक्षेप पहलू है कि मिश्रित संक्रमण से उठता है ट्रांस पूरकन की संभावना है. यह तब होता है जब एक फिट तनाव, जैसे जंगली प्रकार, कृत्रिम रूप से एक कम फिट तनाव की उग्रता को बढ़ाता है। इस का एक काल्पनिक उदाहरण के लिए एक एस की फिटनेस की तुलना होगी. Typhimurium रोगजननता द्वीप 2 (SPI2)-knockout तनाव सह एक जंगली प्रकार तनाव के साथ संक्रमित. SPI2 सक्षमबनाता है एस | Typhimurium मेजबान cytosol कि एक मैक्रोफेज के भीतर phagosome संशोधित में प्रभावक स्रावित द्वारा intracellularly जीवित रहने के लिए. इस प्रणाली के विघटन एसबनाता है. टाइफिमुरियम इंट्रासेल्यूलर हत्या के लिए अतिसंवेदनशील। हालांकि, क्योंकि मैक्रोफेज एक बार में दो या दो से अधिक बैक्टीरिया को घेरने में सक्षम हैं, इसलिए SPI2-नॉकआउट फिटनेस में काफी वृद्धि हो सकती है यदि यह एक जंगली प्रकार के एसके रूप में एक ही मैक्रोफेज में रह रहा है।  Typhimurium कि मेजबान cytosol में effectors स्रावित कर रहा है. यादृच्छिक जनसंख्या गतिशीलता और ट्रांस पूरकन की संभावना किसी भी प्रतियोगिता प्रयोग की एक सीमा है. यदि ट्रांस पूरकन में संदिग्ध है, phenotypes अन्य पूरक तरीकों का उपयोग कर फिटनेस का आकलन करने की पुष्टि की जानी चाहिए. यादृच्छिक जनसंख्या गतिशीलता पर काबू पाने के लिए, प्रतिकृति प्रयोगों की संख्या में वृद्धि परिणामों में outliers की पहचान करने की संभावना बढ़ जाती है. सौभाग्य से, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल यह आसान समान प्रतिकृति प्रयोगों की एक बड़ी संख्या है क्योंकि प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या काफी कम है बनाता है.

ऊपर वर्णित सीआई तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व लगभग किसी भी जीव और किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन है कि सूक्ष्मजीवों की सटीक परिमाणीकरण की आवश्यकता के लिए अनुकूलित करने की क्षमता है। यह करता है, तथापि, गुणसूत्र पर एक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम को शामिल करने के लिए एक जीव के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है. तकनीक की अनुकूलनशीलता के लिए प्रजातियों को आनुवंशिक रूप से आघात करने की आवश्यकता होती है और जीनोम को संशोधित करने के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल की पीढ़ी पर निर्भर करेगा (चरण 1 और 2)। टेबल्स 2 और S1 में सूचीबद्ध डीएनए बारकोड अधिकांश बैक्टीरिया के लिए पर्याप्त होना चाहिए; हालांकि, सभी मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों के रूप में, यह एक साधारण BLAST विश्लेषण द्वारा प्राइमर और जांच के बंद लक्ष्य बाध्यकारी के लिए न्यूनतम क्षमता सुनिश्चित करने के लिए जीवाणु जीनोम का विश्लेषण करने के लिए प्रासंगिक है। इस अध्ययन में इस्तेमाल डीएनए बारकोड दृश्यों कुछ मामलों में केवल 3-4 ठिकानों से अलग, जांच है कि गैर विशिष्ट बाध्यकारी के लिए क्षमता को कम करता है की अति सुंदर विशिष्टता पर प्रकाश डाला. फ्लोरोसेंट जांच की विशिष्टता के बावजूद, सभी नए बारकोड दृश्यों उचित रूप से चरण 6 में वर्णित के रूप में संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए मान्य किया जाना चाहिए। बारकोड्ड उपभेदों बनाने के बाद, यह ऊपर वर्णित के रूप में इन विट्रो प्रतियोगिता assays में अलावा प्रयोगों के कई प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है. उपभेदों चूहों या अन्य पशु मॉडल प्रणालियों में vivo प्रतियोगिता assays में के लिए उपयुक्त हैं. केवल कम से कम संशोधनों पशु अंगों और ऊतकों से gDNA निकालने के लिए आवश्यक हैं, और इन संशोधनों को अच्छी तरह से ऐसे प्रयोजनों के लिए किट के निर्माताओं द्वारा वर्णित हैं. इसके अलावा, विवो प्रतियोगिता में के लिए मिश्रित संक्रमण के बड़े पूल सफलतापूर्वक पहले7का उपयोग किया गया है, एक भी प्रयोग के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने की क्षमता की पेशकश, जो न केवल उन प्रयोगों की लागत कम हो जाती है लेकिन यह भी पशु से पशु परिवर्तनशीलता के लिए क्षमता कम हो जाती है. इसी तरह, बारकोड्ड उपभेदों अन्य इन विट्रो परख में इस्तेमाल किया जा सकता है कि विभिन्न उपचार की स्थिति के लिए उपभेदों की संवेदनशीलता की जांच (जैसे एंटीबायोटिक दवाओं, एसिड संवेदनशीलता, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन या नाइट्रोजन प्रजातियों, आदि द्वारा हत्या). इन प्रयोगों के लिए, विकास अवरोध का आकलन चरण 3.4 में विकास माध्यम के लिए वांछित रासायनिक जोड़कर और वर्णित के रूप में आगे बढ़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. जीवाणु मौत का आकलन करने के लिए, उपभेदों का एक बड़ा पूल मिलाया जा सकता है, और ऊपर वर्णित के रूप में इनपुट मात्रा निर्धारित. वांछित उपचार के लिए जोखिम के बाद, लाइव कोशिकाओं चुनिंदा जीवंतता पीसीआर के साथ डिजिटल पीसीआर परिमाणीकरण प्रक्रिया युग्मन द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए21,22,23 , 24 , 25 , 26. ऐसे प्रयोगों के लिए थ्रूपुट में नाटकीय रूप से वृद्धि होगी क्योंकि प्रत्येक विकृति के लिए कमजोर पड़ने और प्रतिकृति प्लेटों को अधिक सुव्यवस्थित आण्विक तकनीकों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। अंत में, हालांकि विकासवादी जीव विज्ञान और जनसंख्या आनुवंशिकी का विश्लेषण इस कागज के दायरे से परे है, barcoded जीवों ऐसे अध्ययनों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय हैं.  अंत में, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरिया है कि अत्यधिक कई विविध प्रजातियों में और प्रयोगों के कई प्रकार में इसके उपयोग के लिए अनुकूलनीय है परिमाणीकरण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक विकसित करने के लिए किया गया था.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान जॉर्ज एफ Haddix राष्ट्रपति संकाय अनुसंधान कोष और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के जनरल मेडिकल साइंस संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या GM103427 के तहत समर्थित किया गया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Tags

जेनेटिक्स अंक 147 प्रतियोगी सूचकांक उग्रता कारक फिटनेस जीवाणु परिमाणीकरण ddPCR डिजिटल पीसीआर प्रतिस्पर्धी सूचकांक साल्मोनेला,डीएनए बारकोड आणविक परिमाणीकरण जीन बातचीत रद्द कर दिया
<em>साल्मोनेला</em> में स्वास्थ्य के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए डिजिटल पीसीआर-आधारित प्रतियोगी सूचकांक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital… More

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter