Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Digital PCR-basert konkurransedyktig indeks for høy-produksjon analyse av Anvendelighet inne Salmonella

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59630
Automatic Translation
1, 1
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

Summary

Dette molekylær-baserte tilnærmingen for å bestemme bakteriell fitness muliggjør presis og nøyaktig påvisning av mikroorganismer ved hjelp av unike genomisk DNA strekkoder som er kvantifisert via Digital PCR. Protokollen beskriver beregning av konkurransedyktige indeksen for Salmonella stammer; teknologien er imidlertid lett å tilpasse til protokoller som krever absolutt kvantifisering av genetisk formbare organisme.

Abstract

En konkurransedyktig indeks er en vanlig metode som brukes til å vurdere bakteriell fitness og/eller virulens. Nytten av denne tilnærmingen er et forbilde på dens letthet å utføre og dens evne til å standardisere egnethet av mange stammer til en vill-type organisme. Teknikken er begrenset, men av tilgjengelige fenotypiske markører og antall stammer som kan vurderes samtidig, noe som skaper behovet for et stort antall replikere eksperimenter. Samtidig med et stort antall eksperimenter, er arbeids-og materialkostnadene for kvantifisere bakterier basert på fenotypiske markører ikke ubetydelige. For å overvinne disse negative aspektene samtidig som de positive aspektene er beholdt, har vi utviklet en molekylær BAS ert tilnærming til direkte tall som kan kvantifisere mikroorganismer etter tekniske genetiske markører på bakteriell kromosomer. Unik, 25 base pair DNA strekkoder ble satt inn på en ufarlige geometrisk på kromosom av vill-type og mutant stammer av Salmonella. I vitro ble det utført konkurranse eksperimenter med inocula bestående av sammenslåtte stammer. Etter konkurransen ble de absolutte tallene for hver stamme kvantifisert ved hjelp av digital PCR, og de konkurrerende indeksene for hver stamme ble beregnet ut fra disse verdiene. Våre data tyder på at denne tilnærmingen til kvantifisere Salmonella er ekstremt følsom, nøyaktig og presis for å oppdage både svært rikelig (høy kondisjon) og sjeldne (lav fitness) mikroorganismer. I tillegg er denne teknikken lett tilpasses til nesten enhver organisme med kromosomer i stand til modifisering, samt til ulike eksperimentelle design som krever absolutt kvantifisering av mikroorganismer.

Introduction

Vurdering av fitness og virulens av patogene organismer er en grunnleggende del av mikrobiologi forskning. Det gjør at sammenligninger kan gjøres mellom stammer eller mellom muterte organismer, som gjør det mulig for forskere å fastslå viktigheten av visse gener under bestemte forhold. Tradisjonelt, virulens vurderingen utnytter en dyr modell av infeksjon benytter annerledes bakteriell belastninger og observerer utfallet av det infisert dyr (e.g. infeksjon dose50, dødelig dose50, tid å død, tegn alvorlighetsgrad, mangel på symptomer, etc.). Denne prosedyren gir verdifulle beskrivelser av virulens, men det krever belastninger for å forårsake betydelige forskjeller i utfall for å oppdage variasjoner fra vill-type. Videre resultatene er semi-kvantitative fordi mens sykdomsprogresjon og symptom alvorlighetsgrad kan subjektivt kvantifisert over tid, tolkning av virulens forhold til vill-type er mer kvalitativ (dvs. mer, mindre eller like kraftig). Et vanlig alternativ til å utføre dyre infectivity analyser er å generere konkurransedyktige indekser (CIs), verdier som direkte sammenligner fitness eller virulens av en belastning til en vill-type motstykke i en blandet infeksjon1. Denne teknikken har mange fordeler fremfor en tradisjonell dyremodell av smitte ved standardisering virulens til en vill-type belastning og bestemme en målbar verdi for å reflektere graden av demping. Denne teknikken kan også tilpasses til å analysere gen interaksjoner i bakterier ved å bestemme en kansellert ut konkurransedyktig indeks (COI)2. Ved å beregne en COI for en gruppe muterte organismer, kan forskerne avgjøre om to gener uavhengig bidrar til patogenesen, eller om de er involvert i samme virulens vei og er avhengig av hverandre. I tillegg beregner en CI krever opplisting av bakterier som kan gi verdifull innsikt i patogenesen av organismer. CIs og COIs også at forskere til esler avirulent stammer som ikke forårsaker klinisk sykdom, men fortsatt har forskjeller i fitness. Denne teknikken er begrenset ved bruk av tradisjonelle antibiotikaresistens markører for å identifisere stammer, og dermed begrense antall input stammer til bare én eller to om gangen. På grunn av denne begrensningen kreves det et stort antall eksperimentelle grupper og replikerer, som i tillegg til å legge til arbeids-og materialkostnader, også øker mulighetene for variasjon i eksperimentelle forhold og unøyaktige resultater. (For en grundig gjennomgang av fordelene og anvendelser av å bruke blandede infeksjoner å studere virulens, fitness, og gen interaksjoner, se C.R. Beuzón og D.W. Holden 1)

Forsøk har blitt gjort for å overvinne denne begrensningen, slik som bruk av fluorescensmerkete celler kvantifisert via Flow flowcytometri3,4,5. Denne teknikken kvantifiserer celler som bruker enten 1) merket antistoffer mot fenotypiske markører eller 2) endogenously produserte fluorescerende proteiner. Bruken av merket antistoffer har en grense for påvisning av 1 000 celler/mL, og krever derfor et høyt antall celler for å analysere3. Celler uttrykker fluorescerende proteiner har en endret fysiologi og er mottakelige for egnethet endringer som følge av høy protein uttrykk6. Begge metodene er begrenset av antall fluorescerende markører oppdages ved hjelp av Flow flowcytometri. En fremgang i molekylær kvantifisering ble oppnådd gjennom utvikling av en Microarray teknikk som oppdaget demping i 120 stammer fra en innledende blandet infeksjon på over 1 000 stammer i en murine modell7. Denne teknikken benyttet en Microarray analyse av RNA fra muterte stammer, noe som fører til betydelig variasjon i utfallet.  Likevel etablerte det at store bassenger av blandede infeksjoner kan være et nyttig redskap, og at ved å benytte sensitive gjenkjennings teknikker, kan forskjeller i bakteriell virulens identifiseres. Med utviklingen av neste generasjons sekvensering, TN-SEQ utvidet nytten av Transposon mutasjoner, slik at en kraftig metode for kvantifisere bakterier som var tilfeldig mutert8,9,10, 11i. En alternativ protokollen ble nylig utviklet som eliminerer behovet for Transposons og i stedet bruker DNA strekkoder for lettere å identifisere og spore genomisk endringer og deres innvirkning på fitness12. Denne teknologien er en stor forfremmelse, men innsetting av genomisk strekkoder er fortsatt en tilfeldig prosess. For å overvinne tilfeldighet tidligere eksperimenter, Yoon et al. utviklet en metode for å beregne CIs av Salmonella stammer ved hjelp av unike DNA strekkoder satt inn på presise steder på kromosomer av bakterier13. Unike Barcoded stammer ble oppdaget ved hjelp av en qPCR-basert metode med SYBR grønn og primere spesifikke for hver unike strekkode. Teknikken var begrenset av begrensninger pålagt av qPCR, inkludert forskjeller i primer effektivitet og lav følsomhet, dokumentert av behovet for nestede-PCR før qPCR. Likevel viste denne tilnærmingen at målrettede genomisk modifikasjoner kan utnyttes for å oppdage og potensielt kvantifisere bassenger av flere bakterielle stammer.

I protokollen nedenfor beskriver vi en ny metodikk for å utføre bakterielle konkurranse eksperimenter med store bassenger med blandede inocula etterfulgt av nøyaktige kvantifisering ved hjelp av en svært følsom Digital PCR-teknikk. Protokollen innebærer genetisk merking bakteriell stammer med en unik DNA strekkode satt inn på en harmløs region av kromosom. Denne endringen gjør at stammer å være raskt og nøyaktig kvantifisert ved hjelp av moderne molekylær teknologi i stedet for tradisjonelle serielle fortynninger, kopi plating, og telling koloni forming enheter som er avhengige av fenotypiske markører (dvs. antibiotikaresistens ). Endringene tillater samtidig vurdering av mange stammer i en enkelt samlet inokulum, noe som reduserer muligheten for eksperimentell variasjon fordi alle stammer utsettes for nøyaktig de samme forholdene. Videre, mens denne teknikken ble utviklet i Salmonella enterica serovar tyfimurium, er det svært tilpasningsdyktig til genetisk formbare organisme og nesten alle eksperimentelle design der nøyaktig bakteriell teller er nødvendig, noe som gir en ny verktøy for å øke nøyaktigheten og gjennomstrømning i mikrobiologi laboratorier uten begrensninger pålagt av tidligere metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. innlemme unike DNA strekkoder på en plasmider som inneholder de nødvendige komponentene for allel Exchange

Merk: En ny plasmider, benevnt pSKAP, med en høy avskrift antallet og forhøyet transformasjon effektiv sammenlignet med det eksisterende pKD13 allel bytte plasmider var skapt. Dette er beskrevet i trinn 1.1-1.12 (figur 1). Den endelige plasmider inneholder unike DNA strekkoder og komponenter for allel utveksling er tilgjengelig gjennom en plasmider depotet (tabell av materialer).

  1. Ved hjelp av en kommersiell plasmider miniprep Kit, rense pKD1314 og PPCR script cam SK+ fra overnight bakterielle kulturer dyrket i LURIA-Bertani (LB) buljong supplert med 50 μg/ml kanamycin eller 25 μg/ml kloramfenikol (for PKD13 og pPCR script cam SK +, henholdsvis) (tabell 1).
  2. Utfør restriksjon digestions på begge plasmider ved hjelp av kommersielle Begrensnings enzymer HindIII og BamHI i henhold til produsentens spesifikasjoner.
  3. Fjern restriksjoner enzymer og excised DNA fra pPCR script cam SK+ reaksjon og rense 3 370-base pair (BP) plasmider ryggrad ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig DNA CleanUp Kit i henhold til produsentens spesifikasjoner.
  4. Skill fragmenter fra pKD13 restriksjon fordøyelsen på en 1% agarose gel ved hjelp av en elektroforese kammer.
  5. Visualiser bånd ved hjelp av et blått lys transilluminator og avgiftsdirektoratet den 1 333 BP fragment fra gel (figur 1C).
    Merk: Dette fragmentet inneholder FRT-flankert kanamycin motstand genet som kreves for kromosom allel erstatning.
  6. Rens excised DNA fra trinn 1,5 ved hjelp av et kommersielt gelé avsugs sett.
  7. Hvis du vil opprette pSKAP, ombinde du renset fragmentet fra pKD13 (fra trinn 1,6) til pPCR script cam SK+ (fra trinn 1,3) ved hjelp av en kommersiell T4 DNA-ligase i henhold til produsentens spesifikasjoner.
  8. Transformer kjemisk kompetente DH5α-celler med ligaturer pSKAP-plasmider etter produsentens protokoll (tabell 1).
  9. Spre transformants på LB agar plater supplert med 50 μg/mL kanamycin og ruge ved 37 ° c over natten.
  10. Plukk en koloni fra platen og strek den på en ny LB agar plate supplert med 50 μg/mL kanamycin og ruge ved 37 ° c over natten. Plukk en koloni fra denne platen og bruke til å vaksinere LB buljong supplert med 50 μg/mL kanamycin. Ruge kulturen over natten ved 37 ° c med konstant omrøring.
  11. Bruk en kommersiell plasmider miniprep kit å rense pSKAP fra overnight bakteriell kultur.
  12. Utfør en diagnostisk begrensning fordøyelse av plasmider fra trinn 1,11 ved hjelp av hind III og Bam HI i henhold til produsentens spesifikasjoner. Visualiser fragmenter på en 1% agarose gel som i trinn 1.4-1.5.
    Merk: Den pSKAP totale størrelsen bør være 4 703 BP. fragmenter etter trinn 1,12 bør være 3 370 og 1 333 BP.
  13. Design PCR-primere for insertional mutagenese (SDM) (tabell 2 og S1) på en slik måte at det settes inn en unik 25-basepair DNA-sekvens i posisjon 725 av PSKAP (figur 2).
    Merk: Strekkode DNA er satt inn i plasmider like utenfor FRT-flankert kanamycin motstand genet, slik at strekkoden ikke er tapt under påfølgende fjerning av kanamycin motstand kassetten. Hvis du genererer nye strekkode sekvenser, bruker du nettbaserte verktøy for å sikre at de fluorescensmerkete mål spesifikke PCR-sonder (heretter referert til som "sonder") effektivt binder seg til den nye sekvensen. Innsetting sekvenser som er utformet til-dato, sammen med den nødvendige grunning for å lage dem, er gitt i tabell 2 og S1.
  14. Forbered SDM-reaksjoner ved hjelp av et kommersielt høyverdig DNA-polymerase, de ønskede primer parene (tabell 2) og pSKAP-malen. Still inn thermocycler til å utføre følgende: 1) 98 ° c i 30 s, 2) 98 ° c i 10 s, 56 ° c i 15 s, 72 ° c i 2 min, 3) Gjenta trinn 2, 24 ganger, 4) 72 ° c i 5 min, 5) Hold ved 4 ° c.
  15. Etter fullføring av PCR, tømme pSKAP mal ved å legge begrensningen enzymet DPN jeg til reaksjonen. Ruge ved 37 ° c i 20 min.
    Merk: Produkter fra PCR bør visualisere på en agarose gel for å verifisere størrelsen og renheten på produktet. En kontroll DPN jeg fordøyelsen består av uendret pSKAP malen kan utføres og brukes i etterfølgende trinn for å sikre mal DNA er fullstendig fordøyd.
  16. Bruk 5 μL av produktet fra trinn 1,15 til å transformere 100 μL av kommersielle kjemisk kompetente DH5α-celler i henhold til produsentens anbefalinger.
  17. Spre transformants på LB agar plater supplert med 25 μg/mL kloramfenikol og ruge ved 37 ° c over natten.
  18. Velg en koloni (eller kolonier) fra overnatter plater og strek på individuelle LB agar plater supplert med 25 μg/mL kloramfenikol og ruge ved 37 ° c over natten. Velg en koloni fra overnatter plater og bruk til vaksinere 5 mL LB buljong supplert med 25 μg/mL kloramfenikol. Ruge kultur (er) over natten ved 37 ° c med konstant omrøring.
  19. Bruk en kommersiell plasmider miniprep kit å rense plasmider fra natten kultur (r).
  20. Sanger sekvens renset plasmider ved hjelp av M13 Forward sekvensering primer (tabell 2). Sammenlign mutert område til den opprinnelige plasmider og vurdere for SDM insertional nøyaktighet.
  21. Når du har bekreftet strekkode innsetting og-nøyaktighet, tilordner du hver strekkode og plasmider et navn.
    Merk: Strekkoder generert hittil har blitt tildelt en to-brev betegnelse: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, etc. Barcoded plasmider er betegnet som pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc.
  22. Gjenta trinn 1.14-1.21 for å generere ønsket antall DNA strekkoder.

2. innføre DNA strekkode på kromosom av S. Tyfimurium

Merk: Innsetting av DNA strekkoder på S. Tyfimurium-kromosom oppnås ved å bruke en allel utvekslings metode beskrevet av Datsenko og Wanner14 som har blitt modifisert for bruk i S. Tyfimurium.

  1. Bestem geometrisk på S. Tyfimurium for å sette inn DNA-strekkode (Figur 3).
    Merk: Velg en stor, intergenisk region av kromosom. Unngå områder som lager ikke-koding RNA. Denne studien benyttet et knute resultat nedstrøms for å sette P mellom rester 1 213 840 og 1 213 861 (bestemmes fra Genova forsamlingen GCA_ 000022165.1). Denne regionen har tidligere vært genetisk manipulert i trans komplementering av gener15. Alternativt kan en DNA strekkode innføres samtidig forstyrre et gen av interesse. Dette vil kreve minimale endringer i denne protokollen og effektivisere mutant skapelse.
  2. Design PCR-primere for å forsterke den unike strekkoden og FRT-flankert kanamycin motstand genet fra ønsket pSKAP strekkode-inneholdende plasmider fra trinn 1,21 (tabell 2). Legg 40-nukleotid utvidelser som er homologe til regionen valgt i trinn 2,1 til 5 ' slutten av hver primer (tabell 2).
  3. Utfør forsterkningen ved hjelp av en kommersiell Hi-Fi-polymerase, den primere fra trinn 2,2, og den ønskede pSKAP strekkode-inneholdende plasmider som mal. Sett thermocycler til å utføre følgende: 1) 98 ° c i 30 s, 2) 98 ° c i 10 s, 3) 56 ° c for 15 s, 4) 72 ° c for 60 s, Gjenta trinn 2-4 29 ganger, 5) 72 ° c i 5 min, 6) Hold ved 4 ° c.
  4. Etter at PCR er ferdig, tømmes mal DNA ved hjelp av DpnI som beskrevet i trinn 1,15. Rense og konsentrere DNA ved hjelp av en kommersiell DNA opprydding Kit i henhold til produsentens spesifikasjoner.
  5. Referer til den tidligere publiserte protokollen for å generere mutanter i S. Tyfimurium stamme 14028s fra PCR-produkter14,16,17,18.
    Merk: Det er ikke avgjørende at det kanamycin motstands genet excised fra kromosom. Imidlertid er fjerning av genet minimalt forstyrrende for bakteriell kromosom som det resulterer i en 129 BP arr som ville forlate potensielle nedstrøms gener i-ramme. Det anbefales at belastningen som inneholder kanamycin motstand genet beholdes som den kan brukes til å flytte strekkoder mellom stammer via P22-mediert Transduction.
  6. Gjenta trinn 2,3 – 2,5 for å opprette de ønskede stammene med de riktige strekkodene.
    Merk: Strekkoder kan innføres i vill-type S. Tyfimurium som deretter kan utsettes for ytterligere genetisk manipulering, eller strekkoder kan innføres i stammer som tidligere er genetisk endret.

3. bakterielle vekstvilkår og in vitro konkurranse analyser

  1. Fra bakterie lager, strek ønsket S. Tyfimurium stammer som hver havn en unik DNA strekkode på LB agar plater. Ruge plater over natten ved 37 ° c.
  2. Velg en enkelt koloni fra hver stamme og vaksinere 5 mL LB buljong. Ruge for 20 timer ved 37 ° c med konstant omrøring.
    Merk: Bruk natten kulturen, gå videre til trinn 3,5 for å samle ren genomisk DNA (gDNA) fra hver Barcoded belastning. Dette er nødvendig for senere validering og kontroll eksperimenter i avsnitt 6.
  3. For hver konkurranse analysen, overføre et lik volum av hver overnatting kultur i en hensiktsmessig størrelse steril tube. Bland sammen stammer ved virvlingen kraftig i minst 5 s.
    Merk: Volumet av hver overnatting kultur for å overføre bør være tilstrekkelig for hver tilstand og replikere, samt for å isolere gDNA å kvantifisere input. Selv om det ikke er helt nødvendig å måle optisk tetthet av kulturer fordi det absolutte antallet input mikroorganismer vil bli kvantifisert ved hjelp av digital PCR, antall input bakterier for hver stamme bør være tilnærmet lik for å unngå flaskehalser eller ulik konkurranse tidlig i eksperimentet. Representative konkurranse analyser i denne protokollen sammenlignet vekstrater på 8 stammer samtidig. Ekstra eller færre belastninger kan være nødvendig for individuell eksperimentell design.
  4. Overføring 100 μL av blandet inokulum til 4,9 mL steril LB buljong. Ruge ved 37 ° c for ønsket tid eller til ønsket optisk tetthet.
  5. Harvest 500 μL av inokulum ved sentrifugering ved > 12000 x g i 1 min. Fjern og kast supernatanten. Fortsett umiddelbart til § 4 med cellene.
  6. Ved ønsket tidspunkt, Fjern 500 μL alikvoter av kultur og høste celler ved sentrifugering ved > 12000 x g i 1 min. Fjern og kast supernatanten.
    Merk: Hvis du samler alikvoter ved flere tidspunkter, må du fryse pellets ved-20 ° c eller umiddelbart gå videre til trinn 4,1 etter hver samling.

4. innhenting og kvantifisere gDNA fra S. Tyfimurium (fra trinn 3,5 og 3,6)

  1. Harvest gDNA fra celler ved hjelp av en kommersiell gDNA rensing kit. Utfør det valgfrie RNA-trinnet hvis det er tilgjengelig.
    Merk: RNA-tømming er ikke nødvendig. tilstedeværelsen av RNA vil imidlertid kunstig øke DNA-konsentrasjonen, noe som fører til avvikende beregninger i påfølgende trinn. Hvis du bruker en kommersiell gDNA rensing kit, følger produsentens anbefalinger for å sikre at kolonnen ikke er overbelastet med DNA. Det er ingen minste DNA-konsentrasjon som kreves hvis prøven er målbar i etterfølgende trinn.
  2. Bruk en spektrofotometer til å kvantifisere DNA i hver prøve.
    Merk: DNA kan kvantifisert ved hjelp av en hvilken som helst pålitelig metode.
  3. Beregn gDNA kopi nummer basert på bakteriell Genova størrelse ved hjelp av følgende ligning der: X er mengden av DNA i ng og N er lengden på en dobbel-strandet DNA molekyl (i Genova størrelse).
    Equation 1
    Merk: 660 g/Mole brukes som gjennomsnittlig masse av 1 DNA BP. små variasjoner kan eksistere avhengig av kroppens nukleotid sammensetning. Mange kalkulatorer er tilgjengelige på nettet for å utføre beregningen.

5. design primere og sonder for kvantitativ påvisning av DNA strekkoder via dDigital PCR

  1. Design primere for å forsterke den Barcoded regionen av S. Tyfimurium kromosom nedstrøms av putP (figur 3c og tabell 2).
    Merk: Primer og sonde design kan bli lettere av mange online programmer (tabell av materialer). Hvis strekkoder settes inn på samme Loci, er et enkelt sett med forsterknings primere universelt for alle strekkoder.
  2. Design 6-carboxyfluorescein (FAM)-baserte og/eller hexachlorofluorescein (HEX)-baserte sonder som er spesifikke for hver strekkode (tabell 2 og S1).
    Merk: Dråpe leseren som brukes i dette eksperimentet er i stand til å oppdage både FAM-og HEX-baserte sonder samtidig i en multiplex reaksjon. Design 1/2 av sonder for å utnytte FAM og 1/2 til å bruke HEX. Dette er ikke et nødvendig trinn, men vil redusere reagens bruken og eksperimentelle kostnader hvis de implementeres.
  3. Gjør 20x primer-sonde Master mikser som inneholder 1) 20 mM av hver forover og revers forsterkning primer, 2) 10 mM av en enkelt FAM sonde, og 3) 10 mM av en enkelt HEX sonde (hvis multipleksing).

6. Valider følsomheten og spesifisitet av hver Pprimer-probe set for hver genomisk strekkode ved hjelp av digital PCR

Merk: Denne protokollen brukervalidering av åtte unike strekkoder med åtte unike sonder som et eksempel. Antallet strekkoder utnyttet kan økes eller reduseres for å imøtekomme ulike eksperimentelle design.

  1. Opprett en pool av gDNA som inneholder hver strekkode unntatt én. Bruk dette utvalget som fortynningsmiddel for å utføre en fortynning serie med gDNA som inneholder den enkle gjenværende strekkoden (prøve fortynning ordningen er gitt i Figur 4).
    Merk: Bruk av grupperte gDNA som fortynningsmiddel sikrer en konsistent bakgrunn mens konstatere følsomhet. Ved å bruke kopi numrene som er fastsatt i trinn 4,3, kan du fortynne gDNA til et kopierings nummer innenfor det anbefalte digitale PCR-området (1-100000 eksemplarer per 20 μL-reaksjon). Husk at området er angitt for hvert unike mål (strekkode), ikke den totale gDNA.
  2. Klargjør reaksjoner for digital PCR i duplikat i henhold til produsentens anbefalinger for bruk av en digital PCR-Supermix utformet for sonde-basert kjemi. Bruk blandinger fra trinn 6,1 som mal-DNA. Bruk den 20x innebygde Master blandingen fra trinn 5,3 som inneholder proben for den fortynnede strekkoden i trinn 6,1.
  3. Klargjør replikere kontroll reaksjoner for digital PCR i henhold til produsentens anbefalinger for bruk av en digital PCR-Supermix som er utformet for sonde-basert kjemi. Kontroll reaksjoner for hver sonde Mix må bestå av 1) ingen mal kontroller (NTCs), 2) negative kontroller og 3) positive kontroller.
    Merk: Det minste antallet replikere kontroll reaksjoner er to. Denne eksempel protokollen bruker fire NTCs, seks negative kontroller og seks positive kontroller for hver strekkode. Negative kontroller bør inneholde gDNA med hver strekkode unntatt strekkoden som tilsvarer sonden som testes. Dette vil validere spesifisitet av hver sonde.
  4. Gjenta trinn 6.1-6.3 for å opprette digitale PCR-reaksjoner for hver Barcoded gDNA-prøve. En Prøveplate ordning er presentert i figur 5.
    Merk: Dette og påfølgende trinn er beskrevet basert på en bestemt Digital PCR-plattform som bruker slippverktøy og flyt BAS ert teknologi. Alternative digitale PCR-plattformer som bruker chip-basert teknologi kan enkelt erstattes med små modifikasjoner på denne protokollen. Trinn 6,4 kan kreve mer enn 1 96-brønn plate for å validere alle primer sett. I motsetning til qPCR, kan separate plater analysert av digital PCR lett sammenlignes uten behov for standardiserte referanse brønner mellom platene.
  5. Generer dråper for hver reaksjons betingelse ved hjelp av en dråpe generator i henhold til produsentens instruksjoner.
  6. Overfør nylig opprettede dråper til riktig 96-brønn plate. Bruk 200 av μL pipette-spisser på en 5-50 μL flerkanals pipette.
    Merk: Når pipettering dråper, pipette langsomt og jevnt! Den digitale PCR-produsenten anbefaler at du bare bruker Pipetter og pipette fra en bestemt produsent (f.eks. Ranin). Disse pipette tipsene har en jevn åpning uten mikroskopiske plast fragmenter som kan ødelegge dråper eller skade materialer av dråpe leseren. Mange merker av tips ble undersøkt og observert å ha et spekter av produksjon kvalitet. Ekvivalente resultater er oppnådd ved bruk av alternativer for pipette. forsiktighet bør imidlertid brukes ved avvikende fra produsentens anbefalinger.
  7. Etter at alle dråpene er generert og overført, forsegle platen med en folie plate sealer.
  8. Bruk produsentens anbefalte thermocycler for å utføre følgende sykkelforhold: 1) 94 ° c i 10 min; 2) 94 ° c i 1 min, rampe hastighet satt til 1 ° c/s; 3) 55 ° c i 2 min, rampe hastighet satt til 1 ° c/s; 4) Gjenta trinn 2 og 3 49 ganger; 5) 98 ° c i 10 min; 6) Hold ved 4 ° c opp til 24 timer.
    Merk: Termisk overføring i en dråpe reaksjon er ikke det samme som standard PCR. Reaksjonsforhold kan kreve modifisering.
  9. Mens thermocycling utføres, programmere dataanalyse programvare med plate oppsettinformasjon som eksempel navn, eksperiment type (absolutt kvantifisering), Supermix brukt, Target 1 navn (FAM strekkode navn), mål 1 type (NTC, positiv kontroll, negativ kontroll eller ukjent), mål 2-navn (HEX-strekkode-navn), mål 2-type (blank, positiv kontroll, negativ kontroll eller ukjent). Den endelige plate oppsetts informasjonen vises i figur 5.
  10. Når thermocycling er fullført, overfører du de fullførte reaksjonene til dråpe leseren og starter leseprosessen i henhold til produsentens instruksjoner.

7. kvantifisere antall bakterier i et konkurransedyktig index Experiment

  1. Fortynne gDNA isolert og kvantifisert fra avsnitt 4 til en hensiktsmessig konsentrasjon som beskrevet ovenfor.
  2. Klargjør reaksjoner for digital PCR i henhold til produsentens anbefalinger for bruk av riktig Supermix. Bruk DNA fra trinn 7,1 som mal. Bruk en 20x primer-sonde Master Mix som inneholder sonden (eller sonder hvis oppdager både FAM og HEX) for mulige strekkoder til stede i eksperimentet.
  3. Klargjør flere digitale PCR-reaksjoner i trinn 7,2 ved hjelp av forskjellige 20x Master mikser til alle strekkoder som brukes i den eksperimentelle designen kan oppdages.
  4. Ta med kontroller for hver betingelse som beskrevet i 6,3. Dette inkluderer 1) ingen mal kontroller (NTCs), 2) negative kontroller og 3) positive kontroller.
  5. Fortsett med protokollen som beskrevet i trinn 6.5-6.10.

8. analyser digitale PCR-data og Beregn absolutte kopi numre

  1. Når alle brønnene er lest og kjøringen er fullført, åpner du. qlp-datafilen ved hjelp av dataanalyse programvaren.
    Merk: Filtypene og dataanalyse prosedyrene som beskrives her, er spesifikke for én Digital PCR-produsent. Hvis du bruker alternative digitale PCR-plattformer, vil filtyper og dataanalyse prosedyrer være spesifikke for plattformen som brukes, og bør utføres i henhold til produsentens anbefalte spesifikasjoner.
  2. Velg alle brønner som bruker samme primer-sonde Master mix.
  3. I kategorien dråper undersøker du antall dråper som er analysert i hver brønn (både positive og negative dråper). Ekskluder fra analyse noen brønn som har færre enn 10 000 totalt dråper.
  4. Gå til kategorien 1d amplitude og Undersøk amplituder av positive og negative dråper. Sørg for at de utgjør to forskjellige populasjoner.
  5. I programvaren bruker du terskelverdi-funksjonen til å lage en grense mellom positive og negative dråper for hver sonde som ble utnyttet (figur 6).
    Merk: Alle brønner som bruker samme primer-sonde Master Mix fra trinn 5,3 bør ha samme terskler.
  6. Når egnede terskler er brukt på alle brønner, vil programvaren beregne antall DNA-kopier i hver reaksjon. Eksporter data til et regneark for å forenkle videre analyse.
    Merk: Dataanalyse programmet bruker antall positive og negative dråper som passer til en Poisson-fordeling for å bestemme kopierings nummeret.
  7. Ved hjelp av verdiene fra trinn 8,6, beregner du det første kopierings nummeret for hver unike genomisk strekkode i utvalget. Bestem gjennomsnittlig falsk positiv sats fra negative kontroll reaksjoner og trekk fra denne verdien fra verdiene innhentet i eksperimentelle reaksjoner. Multipliser verdier etter behov basert på fortynninger som ble utført ved definering av hvert eksperiment (tabell 3).

9. Bestem relativ egnethet av en organisme ved å beregne CI eller COI fra digital PCR-baserte kvantifisering av Barcoded stammer

  1. Beregn CI av en Barcoded belastning ved hjelp av følgende formler der: enutgang er den absolutte kvantifisering til Barcoded belastningen ved en gitt TIMEPOINT, WToutput er den absolutte kvantifisering av Barcoded ville-type bakterier på samme timepoint, AInput er den absolutte kvantifisering av input inokulum av Barcoded belastning, er WTInput den absolutte kvantifisering av input inokulum av Barcoded vill-type bakterier, Xoutput er summering av alle stammer på samme timepoint, XInput er summering av den totale input inokulum av alle Barcoded stammer.

Equation 2
Equation 3
Merk: Se diskusjonen for fordeler, ulemper og den mest hensiktsmessige bruken av hver formel.

  1. Gjenta trinn 9,1 for hver Barcoded belastning ved alle tidspunkter.
  2. Hvis det er aktuelt, beregner du COI ved hjelp av følgende formler der: enutgang er den absolutte kvantifisering av en Barcoded stamme med mutert gen A ved en gitt Timepoint, er ABoutput den absolutte kvantifisering av en Barcoded belastning med muterte gener a og B på samme timepoint er eninngang den absolutte kvantifisering av inngangs inokulum til Barcoded stamme med mutert gen a, ABInput er den absolutte kvantifisering av input inokulum av Barcoded stamme med muterte gener A og b, boutput er den absolutte kvantifisering av en Barcoded stamme med mutert gen B ved en gitt timepoint, og B-inngang er den absolutte kvantifisering av input inokulum av Barcoded stamme med mutert gen B.

Equation 4
OG/ELLER
Equation 5

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruken av denne metodikken krever at hensiktsmessige kontroll reaksjoner utføres for å validere følsomheten og spesifisitet for hver sonde som brukes til å identifisere mål-DNA. I dette representative eksperimentet validerte vi åtte unike DNA strekkoder med de åtte korresponderende sonder for identifisering. Alle åtte sonder hadde en lav sats på falske positiver i både NTC og negative kontroll reaksjoner (tabell 3), fremhever deres spesifisitet selv blant svært like DNA-sekvenser. For å vurdere følsomheten til hver betingelse, gDNA inneholder en unik strekkode ble serielt fortynnet i en konstant bakgrunn av gDNA som inneholder hver av de syv gjenværende strekkode sekvenser. Med tilnærmingen skissert ovenfor, digital PCR kunne skille så få som 2 eksemplarer av gDNA i en bakgrunn av nesten 2 000 000 lignende DNA-sekvenser (tabell 3).

I tillegg til å bestemme følsomhet og spesifisitet av hver sonde og DNA strekkode sekvens, fortynninger utført i godkjenningen studien tillot oss å beregne en simulert konkurransedyktig indeks fra den resulterende data. Selv om det ikke var noen ekte inn data eller utdata for dette eksperimentet, kan dataene analyseres som om et konkurranse eksperiment er utført. For å gjøre dette, vurderer vi hver blanding i seriell fortynning som en utgang (Aoutput) for den fortynnede strekkoden, mens den totale output (x-utgang), inngang (AInput), og den totale input (x-Input) av hver stamme er beregnet fra kvantifisering i de positive kontrollene der alle strekkoder er inkludert. Ved bruk av fortynningsfaktoren for hver blanding ble den teoretiske CI-en bestemt og rapportert i tabell 3. I hver av fortynning serien som ble utført for hver strekkode, gjennomsnittlig simulert CI rapporteres sammen med standardavvik for hver duplikat fortynning serien. I alle tilfeller, den simulerte CI som ble beregnet er lik den teoretiske CI. Flertallet av beregnet CIs avviker fra den teoretiske CIs med mindre enn 25%. I tilfeller av lavere teoretisk CIs, avviket for den beregnede verdien var i overkant av 2-fold. For eksempel representerte dette en endring fra en teoretisk CI på 0,000625 til en kalkulert CI på 0,001220. Disse dataene fremhever at den beskrevne metoden er både svært nøyaktig og svært presis. Kombinasjonen av høy følsomhet, spesifisitet, nøyaktighet og presisjon gjør dette systemet i stand til å oppdage forskjeller i kondisjon på en pålitelig måte som ellers kan gå ubemerket hen.

Etter å ha validert at genomisk strekkoder kunne identifiseres nøyaktig og kvantifisert, utførte vi in vitro konkurranse eksperimenter (Tabell 4). Den første konkurransen eksperimentet benyttet åtte Wild-type S. Tyfimurium stammer som hver inneholdt en unik DNA strekkode. Hver stamme ble dyrket over natten, og de åtte kulturene ble blandet sammen i like mengder. 100 μL av denne blandede inokulum ble brukt til å vaksinere 4,9 mL steril LB buljong og den resulterende kulturen ble inkubert ved 37 ° c med konstant agitasjon. gDNA ble høstet fra inokulum for å beregne nøyaktig input av hver belastning. Veksten av kulturen ble overvåket ved å måle absorbansen ved 600 NM (OD600). På OD600 = 0,5 (logaritmisk fase), en prøve ble samlet inn fra hver kultur og gDNA ble høstet. Den resterende kulturen ble returnert til 37 ° c med konstant omrøring til 8 timer etter inoculation da en endelig prøve ble samlet inn og gDNA høstet (stasjonær). Resultatene ble beregnet ved hjelp av CI formel endret for grupperte infeksjoner. Som forventet hadde alle ville-type stammer CI verdier nesten lik 1 (Tabell 4). En lignende konkurranse eksperiment ble utført ved hjelp av åtte mutant S. Tyfimurium stammer som hver hadde unike strekkoder i tillegg til en enkelt-, dobbel-eller trippel-transketolase mangel18. Som vist tidligere, stammer alle vokste tilsvarende i LB buljong, med bare en liten forsinkelse observert i trippel-transketolase-mangelfull belastning. Men når veksten av hver stamme ble vurdert ved å analysere CI, ble det observert en mye dypere feil for transketolase-mangelfull belastning (CI ble sammenlignet med vekst kurver i Shaw et al.18). Videre, dette eksperimentet tillot oss å tildele en målbar verdi til hver stamme vekst egenskaper i stedet for bare kvalitativt beskrive vekst mønstre. CIs for hver stamme ble beregnet ved hjelp av både den tradisjonelle formelen der hver belastning bare var sammenlignet med vill-type og den modifiserte formelen der alle innspill stammer ble vurdert. Mens endringene var små, CI av trippel-transketolase-mangelfull belastning var kunstig lav i den tradisjonelle formelen fordi den ikke står for de andre seks konkurrerende stammer som alle utstilt nesten-vill-type fitness.

Stammer Genotype Kilde eller referanse
S. tyfimurium ATCC 14028s vill-type ATCC
TT22236 LT2 Salmonella bærer pTP2223 27
DH5α F- φ 80LacZΔM15 Δ (LacZYA-ARGF) U169 RECa1 sluttena1 HSDR17 (rk-, mk+) Phoen SupE44 λ- Thi-1 GyrA96 rela1 28
JAS18077 putP::AA:: frt Denne studien
JAS18080 putP::Ad:: frt Denne studien
JAS18083 putP::AG:: frt Denne studien
JAS18088 putP::Al:: frt Denne studien
JAS18091 putP::Ao:: frt Denne studien
JAS18096 putP::for:: frt Denne studien
JAS18099 putP::AW:: frt Denne studien
JAS18100 putP::AX:: frt Denne studien
JAS18122 ΔtktA:: frt PutP::Ad:: frt Denne studien
JAS18130 ΔtktB:: frt PutP::Al:: frt Denne studien
JAS18138 ΔtktC:: frt PutP::at:: frt Denne studien
JAS18125 ΔtktA:: frt ΔTktB:: frt putP::AG:: frt Denne studien
JAS18133 ΔtktA:: frt ΔTktC:: frt putP::Ao:: frt Denne studien
JAS18141 ΔtktB:: frt ΔTktC:: frt putP::AW:: frt Denne studien
JAS18142 ΔtktA:: frt ΔTktB:: frt ΔtktC:: frt putP::AX:: frt Denne studien
Plasmider
pKD13 Bla FRT Ahp frt ps1 PS4 oriR6K 14
pPCR script cam SK + ColE1 Ori; CmR Stratagene/Aligent
pTP2223 Plac lam innsats EXO tetR 16
pCP20 Bla Cat cI857 PRFLP pSC101 oriTS 29
pSKAP ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt Denne studien
pSKAP_AA ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; AA Denne studien
pSKAP_AD ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; Annonse Denne studien
pSKAP_AG ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; AG Denne studien
pSKAP_AL ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; Al Denne studien
pSKAP_AO ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; Ao Denne studien
pSKAP_AT ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; Til Denne studien
pSKAP_AW ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; AW Denne studien
pSKAP_AX ColE1 Ori; CmR; Bla FRT Ahp frt; Øks Denne studien

Tabell 1: stammer og plasmider som brukes i denne studien.

navn Sekvens (5 '-3 ')1, 2, 3
pSKAP SDM AA-F AGAAGTCTCCTGCTGGTGCTTGAGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AA-R ACTCAAGCACCAGCAGGAGACTTCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM annonse-F AAGAGCACGGTGAGGTGATAGTAGG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AD-R CCTACTATCACCTCACCGTGCTCTT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AG-F AGTAGTGTCCTGGAGGAGCATGTGA CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AG-R TCACATGCTCCTCCAGGACACTACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL-F ACCACACATCGAAGGCACTAGCTCT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AL-R AGAGCTAGTGCCTTCGATGTGTGGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AO-F GTCCACAACCACACTCAGTGATACT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AO-R AGTATCACTGAGTGTGGTTGTGGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM ved-F ACCAGTGTCCGTGACATGGCTAGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM på-R GTCTAGCCATGTCACGGACACTGGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AW-F ACGACTGAGTGATGTGGATGTGACG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AW-R CGTCACATCCACATCACTCAGTCGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
pSKAP SDM AX-F ACTATCGTGGTGTAACGACAGGCTG CGATTGTGTAGGCTGGAGC
pSKAP SDM AX-R CAGCCTGTCGTTACACCACGATAGT CTCAAGACGTGTAATGCTG
M13-F GTAAAACGACGGCCAG
putP Rekombinasjon-F TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA
TGCAGCATTACACGTC
putP Rekombinasjon-R TACTGCGGGTATTAATGCTGAAAACATCCATAACCCATTG
CCTGCAGTTCGAAGTTCC
qPCR Barcode område forsterke-F1 TGCAGCATTACACGTCTTG
qPCR Barcode område forsterke-R2 TAGGAACTTCGAAGCAGC
Strekkode AA probe-FAM 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ
Strekkode-annonse probe-FAM 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ
Strekkode AG probe-FAM 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ
Strekkode AL probe-FAM 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ
Strekkode AO probe-HEX HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ
Strekkode på probe-HEX HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ
Strekkode AW probe-HEX HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ
Strekkode AX probe-HEX HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ
1 den andre Understreket nukleotider indikerer utfyllende sekvenser for hver DNA-strekkode som settes inn på pSKAP etter SDM.
2 andre priser Dobbel understreket nukleotider indikerer en komplementær region på S. Tyfimurium kromosom brukt for allel utskifting.
3 andre priser QPCR sonder er hybridisering oligos merket med en 5 ' fluorescerende fargestoff, enten 6-carboxyfluorescein (6-FAM) eller hexachlorofluorescein (HEX), en intern tørste (ZEN), og 3 ' quencer Iowa Black® FQ (IBFQ).

Tabell 2: primere og sonder som brukes i denne studien.

Kvantifisering (Kopier/20μL reaksjon)
Beskrivelse Aa Annonse Ag Al Ao På Aw Ax
Ntc N/a 0,000 0,000 3,510 N/a 0,000 0,000 0,000
Ntc 3,600 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
Ntc 3,510 0,000 1,280 1,180 2,340 0,000 0,000 0,000
Ntc 2,290 0,000 0,000 1,200 1,150 1,160 0,000 0,000
Mener 3,133 0,000 0,320 1,473 1,163 0,290 0,000 0,000
Negative 5,130 1,156 0,000 1,124 3,745 1,281 7,354 7,142
Negative 5,270 0,000 0,000 1,087 1,666 1,643 7,746 2,269
Negative 2,660 0,000 1,361 1,451 8,974 0,000 N/a 0,000
Negative 6,090 0,000 0,000 2,251 0,000 2,531 8,700 3,495
Negative 1,740 0,000 1,086 2,130 4,171 0,000 7,113 5,522
Negative 6,220 3,581 0,000 4,022 1,175 1,341 N/a 5,950
Mener 4,518 0,789 0,408 2,011 3,288 1,133 7,728 4,063
Positive 22281,540 42673,039 46442,242 45359,180 47885,625 15708,027 45325,906 20810,559
Positive 23989,676 44625,523 47356,438 45790,660 47456,973 15096,601 47929,840 22455,234
Positive 17846,824 38980,133 45633,809 44174,820 33875,039 15156,063 42536,270 21467,840
Positive 21047,588 40140,848 41672,648 46028,496 47426,527 16718,000 46978,664 19876,473
Positive 20218,238 44660,602 41718,707 45799,375 46495,602 14590,264 54741,023 22011,938
Positive 18531,740 41620,801 N/a 48082,313 35645,199 15341,382 48950,992 21117,559
Mener 20652,601 42116,824 44564,769 45872,474 43130,827 15435,056 47743,783 21289,934
Blank subtraksjon 20648,083 42116,035 44564,361 45870,463 43127,539 15433,923 47736,054 21285,871
Ufortynnet A 23024,961 44448,875 58897,510 51120,948 55450,191 18155,305 62844,068 27567,828
Ufortynnet B 18278,174 35252,586 54409,510 66022,396 43101,148 15732,609 60761,328 26581,979
1/50 en 521,670 755,035 1066,898 1287,187 1053,339 181,324 1278,336 580,961
1/50 Feriehus 435,326 634,215 1168,087 1383,537 991,040 165,443 1180,445 596,461
1/100 en 228,028 598,848 603,911 631,116 507,956 258,405 665,647 331,590
1/100 Feriehus 256,330 585,834 583,325 670,875 459,325 289,207 638,916 307,948
1/200 en 121,283 305,293 258,247 346,965 234,774 114,163 169,055 172,553
1/200 Feriehus 114,638 313,040 253,685 297,216 191,637 179,895 280,989 147,297
1/400 en 42,829 141,343 127,337 163,605 N/a 71,241 157,697 85,976
1/400 Feriehus 59,544 180,543 162,080 162,108 115,508 104,682 151,141 87,804
1/800 en 34,304 67,934 65,939 83,857 66,134 31,784 82,722 45,616
1/800 Feriehus 20,390 80,222 81,453 85,325 53,102 38,034 55,460 29,660
1/1600 en 15,405 44,505 47,672 39,613 33,027 18,006 37,655 20,988
1/1600 Feriehus 22,091 48,828 46,781 37,388 30,245 30,138 34,553 19,795
1/3200 en 12,333 22,104 16,850 18,403 11,460 10,535 21,245 9,218
1/3200 Feriehus 6,796 32,555 15,742 26,249 15,111 9,908 23,393 10,175
Blank subtraksjon
Ufortynnet A 23020,443 44448,086 58897,103 51118,937 55446,903 18154,172 62836,339 27563,765
Ufortynnet B 18273,655 35251,797 54409,103 66020,385 43097,860 15731,477 60753,600 26577,916
1/50 en 517,152 754,246 1066,490 1285,176 1050,051 180,192 1270,607 576,898
1/50 Feriehus 430,808 633,426 1167,679 1381,526 987,751 164,311 1172,717 592,398
1/100 en 223,509 598,059 603,503 629,105 504,668 257,272 657,918 327,527
1/100 Feriehus 251,812 585,044 582,918 668,864 456,036 288,074 631,187 303,885
1/200 en 116,765 304,503 257,840 344,954 231,486 113,030 161,327 168,490
1/200 Feriehus 110,120 312,251 253,277 295,205 188,348 178,762 273,261 143,234
1/400 en 38,310 140,554 126,929 161,594 N/a 70,108 149,968 81,913
1/400 Feriehus 55,026 179,753 161,672 160,097 112,219 103,549 143,413 83,741
1/800 en 29,786 67,145 65,531 81,847 62,846 30,651 74,994 41,553
1/800 Feriehus 15,872 79,433 81,045 83,314 49,813 36,901 47,732 25,596
1/1600 en 10,886 43,716 47,264 37,602 29,739 16,874 29,927 16,925
1/1600 Feriehus 17,573 48,039 46,373 35,377 26,957 29,005 26,825 15,732
1/3200 en 7,815 21,314 16,442 16,392 8,172 9,402 13,517 5,155
1/3200 Feriehus 2,278 31,765 15,334 24,238 11,822 8,776 15,664 6,112
Simulert CI
Ufortynnet A 1,114895 1,055372 1,321619 1,114419 1,285650 1,176251 1,316329 1,294932
Ufortynnet B 0,885005 0,837016 1,220911 1,439279 0,999312 1,019279 1,272698 1,248618
1/50 en 0,025046 0,017909 0,023931 0,028018 0,024348 0,011675 0,026617 0,027102
1/50 Feriehus 0,020864 0,015040 0,026202 0,030118 0,022903 0,010646 0,024567 0,027831
1/100 en 0,010825 0,014200 0,013542 0,013715 0,011702 0,016669 0,013782 0,015387
1/100 Feriehus 0,012195 0,013891 0,013080 0,014582 0,010574 0,018665 0,013222 0,014276
1/200 en 0,005655 0,007230 0,005786 0,007520 0,005367 0,007323 0,003380 0,007916
1/200 Feriehus 0,005333 0,007414 0,005683 0,006436 0,004367 0,011582 0,005724 0,006729
1/400 en 0,001855 0,003337 0,002848 0,003523 N/a 0,004542 0,003142 0,003848
1/400 Feriehus 0,002665 0,004268 0,003628 0,003490 0,002602 0,006709 0,003004 0,003934
1/800 en 0,001443 0,001594 0,001470 0,001784 0,001457 0,001986 0,001571 0,001952
1/800 Feriehus 0,000769 0,001886 0,001819 0,001816 0,001155 0,002391 0,001000 0,001203
1/1600 A 0,000527 0,001038 0,001061 0,000820 0,000690 0,001093 0,000627 0,000795
1/1600 B 0,000851 0,001141 0,001041 0,000771 0,000625 0,001879 0,000562 0,000739
1/3200 A 0,000378 0,000506 0,000369 0,000357 0,000189 0,000609 0,000283 0,000242
1/3200 B 0,000110 0,000754 0,000344 0,000528 0,000274 0,000569 0,000328 0,000287
Gjennomsnittlig CI (teoretisk)
Ufortynnet (1) 0,999950 0,946194 1,271265 1,276849 1,142481 1,097765 1,294514 1,271775
1/50 (0,02) 0,022955 0,016474 0,025067 0,029068 0,023625 0,011161 0,025592 0,027466
1/100 (0,01) 0,011510 0,014046 0,013311 0,014148 0,011138 0,017667 0,013502 0,014832
1/200 (0,005) 0,005494 0,007322 0,005735 0,006978 0,004867 0,009453 0,004552 0,007322
1/400 (0,0025) 0,002260 0,003803 0,003238 0,003507 0,00260 * 0,005626 0,003073 0,003891
1/800 (0,00125) 0,001106 0,001740 0,001645 0,001800 0,001306 0,002188 0,001285 0,001577
1/1600 (0,000625) 0,000689 0,001089 0,001051 0,000795 0,000657 0,001486 0,000594 0,000767
1/3200 (0,000313) 0,000244 0,000630 0,000357 0,000443 0,000232 0,000589 0,000306 0,000265
Standardavvik
Ufortynnet 0,11494 0,10918 0,05035 0,16243 0,14317 0,07849 0,02182 0,02316
1/50 0,00209 0,00143 0,00114 0,00105 0,00072 0,00051 0,00103 0,00036
1/100 0,00069 0,00015 0,00023 0,00043 0,00056 0,00100 0,00028 0,00056
1/200 0,00016 0,00009 0,00005 0,00054 0,00050 0,00213 0,00117 0,00059
1/400 0,00040 0,00047 0,00039 0,00002 0 0,00108 0,00007 0,00004
1/800 0,00034 0,00015 0,00017 0,00002 0,00015 0,00020 0,00029 0,00037
1/1600 0,00016 0,00005 0,00001 0,00002 0,00003 0,00039 0,00003 0,00003
1/3200 0,00013 0,00012 0,00001 0,00009 0,00004 0,00002 0,00002 0,00002
* Representerer resultater fra et enkelt eksperiment.

Tabell 3: absolutt kvantifisering og simulert CI-beregning.

Tilstand Konkurrerende index1
Eksperiment 1
WTAA WTannonse WTAG WTAl WTAo WTved WTAW WTAX
Logaritmisk 0,927 ± 0,033 0,992 ± 0,031 1,068 ± 0,025 0,921 ± 0,02 1,044 ± 0,03 1,051 ± 0,057 1,094 ± 0,027 0,929 ± 0,005
Stasjonære 1,1 ± 0,021 1,071 ± 0,053 1,079 ± 0,065 0,948 ± 0,02 0,98 ± 0,02 0,873 ± 0,044 0,97 ± 0,056 1,021 ± 0,007
Eksperiment 2
CI (tradisjonell) WTAA ΔAannonse ΔBAl ΔCi ΔABAG ΔACAo ΔBCAW ΔABCAX
Logaritmisk 1 ± 0 0,802 ± 0,084 0,957 ± 0,02 0,989 ± 0,073 0,581 ± 0,153 0,86 ± 0,053 0,995 ± 0,011 0,695 ± 0,061
Stasjonære 1 ± 0 0,97 ± 0,063 1,043 ± 0,058 0,99 ± 0,036 1,625 ± 0,589 0,835 ± 0,051 0,912 ± 0,047 0,477 ± 0,049
CI (gruppert Inokulum)
Logaritmisk 1,114 ± 0,039 0,864 ± 0,074 1,073 ± 0,032 1,1 ± 0,068 0,633 ± 0,152 0,938 ± 0,056 1,111 ± 0,043 0,746 ± 0,06
Stasjonære 1,078 ± 0,039 1,039 ± 0,049 1,166 ± 0,093 1,066 ± 0,01 1,735 ± 0,613 0,876 ± 0,035 0,97 ± 0,045 0,49 ± 0,047
1 den andre Verdier representerer gjennomsnittlig CI ± standardavvik for tre eller fire replikere eksperimenter.

Tabell 4: representative resultater fra in vitro konkurranse mellom S. Tyfimurium stammer.

Tabell S1. Valgfri grunning for å lage flere strekkode sekvenser og tilsvarende fluorescerende sonder for deteksjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Figure 1
Figur 1. Generering av pSKAP. (A) renset pKD13 ble utsatt for begrensning fordøyelsen med HindIII og BamHI. (B, C) 1 333 BP fragment av interesse som inneholder en FRT-flankert kanamycin motstand genet ble renset. (D) PPCR script cam SK + ble også fordøyd med HindIII og BamHI og fragment fra PKD13 (B) var ligaturer i å generere (E) pSKAP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Insertional site-regissert mutagenese til pSKAP. (A) innsetting av 25 BP DNA strekkoder i posisjon 725 ble utført ved hjelp av PCR. Forover og bakover primere spesifikke for at plasseringen ble utformet med komplementære 25-nukleotid 5 ' Extensions (betegnet i primer som små "a"). (B) en generisk pSKAP_Barcode plasmider som følge av SDM vises med plasseringen av den innsatte DNA strekkoden uthevet oransje. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kromosom omorganisering nedstrøms av putP. (A) etter λ-rød mediert rekombinasjon, det valgbar kanamycin motstand genet (mørk lilla) FLANKERT av frt nettsteder (grå) er satt inn på kromosom mellom Loci indikert (kromosom rekombinasjon site, rød). Den unike DNA strekkoden (oransje) er satt inn like utenfor FRT området. (B) kanamycin motstand genet er fjernet av frt-mediert forbruker, etterlot en rest av innsatt DNA på kromosom (totalt innsatt DNA, blå) BESTÅENDE av DNA strekkode og en frt arr. (C) den MODIFISERTE kromosom DNA-sekvensen rundt det innsatte DNA vises, sammen med forsterker priming nettsteder (lys lilla) som brukes til digital PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: fortynning ordning for å validere fluorescerende sonde følsomhet og spesifisitet. (A) renset gDNA fra syv Barcoded stammer blandes sammen i like mengder for å skape fortynnings MIDlet for fortynning av utelatt Barcoded GDNA (AX i eksempelet ovenfor). (B) utføre en seriell fortynning av utelatt Barcoded GDNA (AX i eksempelet ovenfor) ved hjelp av forberedt fortynningsmiddel beskrevet tidligere. Bland innholdet i hvert rør grundig før du overfører til neste rør. Figur 4 ble opprettet med BioRender. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: plate layout for analyse av følsomhet og spesifisitet av primer-sonde sett 1 og 2. Det digitale PCR-eksperimentet inkluderer NTCs, positive kontroller, negative kontroller og fortynnings ordninger for hver av de testede strekkodene. Platen for validering av primer-sonde sett 3 og 4 er lagt ut i samme mønster ved hjelp av riktig Barcoded gDNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: representative digitale PCR-resultater av UTVANNET AA-Barcoded gDNA. gDNA inneholder AA strekkode ble fortynnet i en bakgrunn av alle andre Barcoded gDNA som beskrevet i Figur 4. Kanal 1 representerer FAM-proben for AA-strekkode (øverste paneler), mens kanal 2 representerer HEX-sonden for AO-strekkode (nederste paneler). Resultatene av hver sonde er presentert som både individuelle dråpe fluorescerende amplitude (venstre paneler) og et histogram som representerer hyppigheten av fluorescerende intensitet av alle dråper i de valgte brønnene (høyre panel). For hver betingelse bør positive (høy fluorescens) og negative (lav fluorescens) dråper danne to distinkte populasjoner. I tilfelle av AA som ble fortynnet, og de fleste dråper var negative, histogram (øverst til høyre panel) ser ut til å bare skildre en enkelt befolkning. Dette er fordi positive dråper er vesentlig mindretall av negative dråper; Imidlertid er to distinkte populasjoner fortsatt synlig ved å undersøke dråpe fluorescerende amplitude i venstre panelene.  Populasjonen bør skilles ved hjelp av terskel-funksjonen for å definere positive og negative dråper (som vises med den rosa linjen). Terskelverdiene vil variere avhengig av sonder som ble brukt, men alle brønner som bruker samme sonde Mix bør ha identiske terskler. Som AA-Barcoded gDNA ble fortynnet, er det en reduksjon i positive (høy fluorescerende) dråper mens antall positive AO dråper forblir konstant i bakgrunnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til å nøyaktig kvantifisere mikroorganismer er av overordnet betydning for mikrobiologi forskning, og evnen til å nummerere unike stammer fra en innledende blandet befolkning har vist seg å være et uvurderlig verktøy for å vurdere fitness og virulens trekk i Bakterier. Men teknikkene for å oppnå dette har ikke kommet i takt med moderne utviklingen i molekylærbiologi. Teknologien for å enkelt endre kromosomer av mange bakterier, inkludert S. Tyfimurium, har vært tilgjengelig i nesten to ti år14, men denne evnen har vært sjelden utnyttet for Molecularly merking stammer med unike DNA-sekvenser. Ved å utnytte evnen til å skape lett identifiserbare belastninger basert på unike, minimalt forstyrrende DNA strekkoder satt inn på bakteriell kromosom, kombinert med den mest State-of-the-art teknologi for å oppdage og kvantifisere disse molekylære identifikatorer ( Digital PCR) har vi skapt et system som gir utsøkt følsomhet, spesifisitet, nøyaktighet og presisjon for lett kvantifisere av individuelle belastninger innenfor en mangfoldig bakterie populasjon.

Beregning av CIs og COIs som beskrevet ovenfor, er avhengig av evnen til å gjøre de nødvendige endringene i bakteriell kromosomer på en nøyaktig måte. Alle modifikasjoner bør verifiseres av sanger sekvensering for å sikre at ingen tilfeldige mutasjoner oppstod. Bruken av en High-Fidelity polymerase vil minimere disse feilene, men slike mutasjoner som forekommer vil svekke evnen til å oppdage belastningen, som er en annen kritisk aspekt av denne protokollen. Selv om vi har vist at digital PCR kan oppdage så få som to gDNA-eksemplarer i en bakgrunn på nesten 2 000 000, kan stammer utenfor dette området kreve ekstra fortynninger for nøyaktig kvantifisering. Videre må DNA strekkode sekvenser være utformet for å lette bruken av høykvalitets sonde sekvenser. Probe sekvenser bør analyseres for tendenser til selv-dimerize, form pinner, eller ineffectively binde sine mål. Viktigheten av å bruke kvalitet sekvenser og sonder kan ikke minimali, et faktum som er dokumentert av forsiktig validering eksperimenter som må utføres med hver sonde. Arbeidet med å skape optimale DNA strekkoder vil skape optimale digitale PCR kvantifisering resultater.

Mens nøye utformet molekylære koder er viktig for å oppnå kvalitet resultater, tolke resultatene er en annen viktig del av denne protokollen. CI er definert som forholdet mellom den muterte belastningen og den ville-type belastningen i output delt på forholdet mellom de to stammene i input1,19,20. Denne tradisjonelle CI presentert i § 9 er nyttig når blandet infeksjon består av bare én stamme versus vill-type. Men når du bruker store bassenger av stammer til vaksinere Media eller dyr, stammer er ikke bare konkurrerer mot vill-type, men også mot alle andre belastninger tilstede i inokulum. Tidligere studier som utførte konkurranse eksperimenter med flere infisere stammer har unnlatt å ta hensyn til dette i sine beregninger7,13. For å gjøre rede for denne funksjonen av blandede infeksjoner, har vi innført en formel for å beregne CIs som er endret for grupperte infeksjoner. Det er usannsynlig at alle stammer vil gi samme nivå av konkurransen en vill-type belastning ville. Men fordi de fleste bakterielle gener har liten innvirkning på virulens, som antall stammer brukes i konkurrerende indeksen eksperimentet øker, sannsynligheten for at generelle virulens vil tenderer mot vill-type belastningen øker. Dette kan ikke nødvendigvis være tilfelle for visse eksperimentelle design ved hjelp av bassenger av mange stammer alle med kjente virulens defekter. Imidlertid er dette utgjorde i den endrede ligningen fordi mindre rikelig stammer (mindre plass) i utfallet vil ha en mindre effekt på X-utgang. Avhengig av den spesifikke eksperimentelle designen, kan det være tilfeller der den ene eller den andre formelen foretrekkes. I de fleste tilfeller som involverer grupperte infeksjoner, er det imidlertid viktig å vurdere at i en blandet infeksjon, alle stammer konkurrerer mot hverandre, ikke bare mot vill-type. Når analysere resultatene, er det avgjørende at begrunnelsen bak hver formel er godt forstått å gjøre de mest nøyaktige tolkninger av belastningen fitness. Når du rapporterer resultater, er det like viktig å formidle nøyaktig hvordan data ble analysert.

§ 9 i protokollen inneholder også formler for å bidra til å bestemme gen interaksjoner ved hjelp av en COI. Med denne analysen kan spådommer gjøres for å avgjøre om to virulens gener opererer uavhengig eller sammen. COI er definert som forholdet mellom den doble mutant til enkelt mutant belastning i output delt på forholdet mellom de to stammene i input1. Formelen er utformet for å detektere fenotypiske additivity av gen forstyrrelser. Hvis gener fungerer uavhengig å forsterke virulens, en forstyrrelse av begge gener bør føre til en større reduksjon i kondisjon sammenlignet med en enkelt forstyrrelse av enten genet alene. Hvis gener fungerer sammen for å forbedre virulens (som gener som koder to enzymer i en vei), bør en forstyrrelse av enten genet ha samme virkning på virulens som å forstyrre begge genene. Påvisning av fenotypiske additivity kan være vanskelig i tilfeller der nivået av demping forårsaket av et enkelt gen er enten svært høyt eller svært lavt. Likevel, direkte sammenligning av belastninger innenfor samme dyre system gir mindre variasjon og en mer pålitelig redegjørelse for den funksjonelle forholdet mellom gener, og denne beregningen kan utføres fra to stammer i en større blandet befolkning.

En endelig kritisk aspekt for å tolke resultatene er å vurdere virkningene av befolkningen dynamikk. I noen blandede infeksjoner som har flere stammer, en enkelt stamme kan fremstå som enten mer dominerende eller mindre plass på grunn av tilfeldige befolkningen drift. Dette fenomenet kan forsterkes når flaskehals hendelser inntreffer. Dette kan skyldes bruk av et svært stort antall inn data stammer, et svært lite antall total bakterier i inokulum, eller en kombinasjon av begge. Et annet forstyrrende aspekt som oppstår fra blandede infeksjoner er muligheten for i trans komplementering. Dette skjer når en passe belastning, slik som Wild-type, kunstig forbedrer virulens av en mindre skikket belastning. Et hypotetisk eksempel på dette ville være å sammenligne egnethet av en S. Tyfimurium patogenitet Island 2 (SPI2)-knockout belastning co-smittet med en vill-type belastning. SPI2 aktiverer S. Tyfimurium å overleve intracellulært av sekresjon effekt Orer inn i verten stoffer som modifiserer phagosome innenfor en macrophage. Forstyrrelse av dette systemet gjør S. Tyfimurium mottakelig for intracellulære drap. Men fordi makrofager er i stand til å henger sammen to eller flere bakterier samtidig, kan SPI2-knockout få en betydelig økning i kondisjon hvis den er bosatt i samme macrophage som en vill-type S.  Tyfimurium som er sekresjon effekt Orer inn i verten stoffer. Tilfeldig befolkning dynamikk og muligheten for i trans komplementering er en begrensning av enhver konkurranse eksperiment. Hvis i trans komplementering mistenkes, bør fenotyper bekreftes ved hjelp av andre komplementære metoder for å vurdere fitness. Hvis du vil overvinne tilfeldige befolknings dynamikk, økes sannsynligheten for å identifisere outliers i resultater hvis du øker antallet replikere eksperimenter. Heldigvis, protokollen beskrevet ovenfor gjør det enklere å ha et større antall identiske replikere eksperimenter fordi antall eksperimentelle forhold er drastisk redusert.

Et nøkkelelement til CI-teknikken som er beskrevet ovenfor, er dens evne til å være tilpasset nesten enhver organisme og enhver eksperimentell design som krever nøyaktig kvantifisering av mikroorganismer. Det gjør imidlertid kreve genetisk manipulering av en organisme å innlemme en unik DNA-sekvens på kromosom. Den tilpasningsdyktighet av teknikken krever arten å være genetisk-formbare og vil stole på generering av alternative protokoller for å endre Genova (trinn 1 og 2). DNA strekkodene oppført i tabell 2 og S1 bør være nok for de fleste bakterier; som i alle kvantitative PCR-eksperimenter er det imidlertid relevant å analysere de bakterielle Genova for å sikre minimalt potensial for off-Target binding av primere og sonder ved en enkel BLAST analyse. DNA strekkode sekvenser som brukes i denne studien varierer med bare 3-4 baser i noen tilfeller, fremhever utsøkt spesifisitet av sonder som minimerer potensialet for ikke-spesifikk binding. Uavhengig av fluorescerende sonder spesifisitet, må alle nye strekkode sekvenser være hensiktsmessig validert for følsomhet og spesifisitet som beskrevet i trinn 6. Etter å ha opprettet Barcoded stammer, er det mulig å tilpasse denne protokollen til mange typer eksperimenter foruten in vitro konkurranse analyser som beskrevet ovenfor. Stammene er egnet for in vivo konkurranse analyser i mus eller andre dyr modellsystemer. Bare minimal modifiseringer er krevde å ekstra gDNA fra dyr organ og vev, og disse modifiseringer er frisk beskrevet av fabrikanter av kits for slik hensikt. Videre har store bassenger med blandede infeksjoner for in vivo konkurranse blitt vellykket utnyttet tidligere7, og tilbyr potensial til å redusere antall dyr som er nødvendig for et enkelt eksperiment, som ikke bare reduserer kostnadene for disse eksperimentene men også reduserer potensialet for dyr-til-dyr variasjon. Tilsvarende kan Barcoded stammer brukes i andre in vitro -analyser som undersøker mottakelighet av stammer til ulike behandlings forhold (f. eks antibiotika, syre mottakelighet, drap av reaktive oksygen eller nitrogen arter, etc.). For disse eksperimentene, vurdere veksthemming kan oppnås ved å legge den ønskede kjemiske til vekstmedium i trinn 3,4 og fortsetter som beskrevet. For å vurdere bakteriell død, kan en stor pool av stammer blandes, og input kvantifisert som beskrevet ovenfor. Etter eksponering til ønsket behandling, kan levende celler være selektivt kvantifisert ved å kopling den digitale PCR kvantifisering prosedyre med levedyktighet PCR å skille mellom levende og døde celler21,22,23 , 24 priser og , 25 priser og , 26. gjennomstrømming for slike eksperimenter vil bli dramatisk økt fordi fortynninger og kopi plater for hver stamme er erstattet av mer strømlinjeformet molekylære teknikker. Til slutt, selv om analysere evolusjonære biologi og befolkning genetikk er utenfor omfanget av denne utredningen, Barcoded organismer er svært tilpasningsdyktig for slike studier.  Til syvende og sist var hensikten med denne protokollen å utvikle en kraftig teknikk for kvantifisere bakterier som er svært tilpasningsdyktig for bruk i mange ulike arter og i mange typer eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av George F. Haddix president ' s Faculty Research Fund og National Institute of General Medical Science av National Institutes of Health (NIH) under tildeling nummer GM103427. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Tags

Genetikk konkurransedyktig indeks virulens faktorer fitness bakteriell kvantifisering ddPCR digital PCR kansellert ut konkurransedyktig indeks Salmonella DNA strekkode molekylær kvantifisering gen interaksjoner
Digital PCR-basert konkurransedyktig indeks for høy-produksjon analyse av Anvendelighet inne <em>Salmonella</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital… More

Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter