Summary
Denna molekyl-baserade metod för bestämning av bakteriell kondition underlättar exakt och noggrann detektion av mikroorganismer med hjälp av unika genomiska DNA-streckkoder som kvantifieras via digital PCR. I protokollet beskrivs beräkning av konkurrens index för salmonella stammar. tekniken är dock lätt att anpassa till protokoll som kräver absolut kvantifiering av varje genetiskt formbar organism.
Abstract
Ett konkurrenskraftigt index är en vanlig metod som används för att bedöma bakteriell kondition och/eller virulens. Nyttan av detta tillvägagångssätt exemplifieras av dess lätthet att utföra och dess förmåga att standardisera lämplighet många stammar till en vild-typ organism. Tekniken är dock begränsad av tillgängliga fenotypiska markörer och antalet stammar som kan bedömas samtidigt, vilket skapar behovet av ett stort antal replikeringsexperiment. Samtidigt med ett stort antal experiment är arbets-och materialkostnaderna för att kvantifiera bakterier baserade på fenotypiska markörer inte obetydliga. För att övervinna dessa negativa aspekter och samtidigt behålla de positiva aspekterna har vi utvecklat en molekylär-baserad metod för att direkt kvantifiera mikroorganismer efter tekniska genetiska markörer på bakteriella kromosomer. Unika, 25 bas par DNA-streckkoder sattes in på en ofarlig Locus på kromosomen av vildtyp och Mutant stammar av salmonella. In vitro-konkurrens experiment utfördes med hjälp av inokulat bestående av poolade stammar. Efter tävlingen kvantifierades det absoluta antalet av varje stam med hjälp av digital PCR och konkurrens indexen för varje stam beräknades utifrån dessa värden. Våra data tyder på att denna metod för att kvantifiera salmonella är extremt känslig, noggrann och exakt för att upptäcka både mycket riklig (hög kondition) och sällsynta (låg kondition) mikroorganismer. Dessutom är denna teknik lätt att anpassa till nästan alla organismer med kromosomer som kan modifiering, samt till olika experimentella konstruktioner som kräver absolut kvantifiering av mikroorganismer.
Introduction
Att bedöma patogena organismers kondition och virulens är en grundläggande aspekt av mikrobiologi. Det gör det möjligt att göra jämförelser mellan stammar eller mellan muterade organismer, vilket gör det möjligt för forskarna att bestämma betydelsen av vissa gener under särskilda förhållanden. Traditionellt, virulens bedömning använder en djurmodell av infektion med hjälp av olika bakteriestammar och observera resultatet av det infekterade djuret (t. ex. infektiös dos50, dödlig dos50, tid till döden, symtomens svårighetsgrad, brist på symtom, etc.). Detta förfarande ger värdefulla beskrivningar av virulens, men det kräver stammar att orsaka betydande skillnader i utfall för att upptäcka variationer från vildtyp. Dessutom, resultaten är semi-kvantitativa eftersom medan sjukdomsprogression och symtom svårighetsgrad kan subjektivt kvantifieras över tiden, tolkning av virulens jämfört med vildtyp är mer kvalitativ (dvs. mer, mindre eller lika virulent). Ett vanligt alternativ till att utföra djur smittsamhet är att generera konkurrens index (CIs), värden som direkt jämför kondition eller virulens av en stam till en vild typ motsvarighet i en blandad infektion1. Denna teknik har många fördelar jämfört med en traditionell djurmodell av infektion genom att standardisera virulens till en vild typ stam och fastställa ett kvantifierbara värde för att återspegla graden av dämpning. Denna teknik kan också anpassas för att analysera geninteraktioner hos bakterier genom att fastställa ett avbrutet konkurrens index (COI)2. Vid beräkning av en COI för en grupp muterade organismer kan forskarna avgöra om två gener självständigt bidrar till patogenesen eller om de är involverade i samma virulensväg och är beroende av varandra. Dessutom kräver beräkning av en CI uppräkning av bakterier som kan ge värdefulla insikter i patogenesen av organismer. CIs och COIs gör det också möjligt för forskare att bedöma Avirulenta stammar som inte orsakar klinisk sjukdom men fortfarande har skillnader i kondition. Denna teknik begränsas av användningen av traditionella antibiotikaresistens markörer för att identifiera stammar, vilket begränsar antalet ingångs stammar till endast en eller två i taget. På grund av denna begränsning, krävs ett stort antal experimentella grupper och replikat, som förutom att lägga till arbets-och materialkostnader, också ökar möjligheterna till variation i experimentella förhållanden och felaktiga resultat. (För en grundlig genomgång av nyttan och tillämpningarna av att använda blandade infektioner för att studera virulens, kondition och geninteraktioner, se C.R. Beuzón och D.W. Holden 1)
Försök har gjorts för att övervinna denna begränsning, såsom användning av fluorescerande-märkta celler kvantifieras via flödescytometri3,4,5. Denna teknik kvantifierar celler med antingen 1) märkt antikroppar mot fenotypiska markörer eller 2) endogent producerade fluorescerande proteiner. Användningen av märkta antikroppar har en detektionsgräns på 1 000 celler/mL, och kräver därför ett stort antal celler för att analysera3. Celler som uttrycker fluorescerande proteiner har en förändrad fysiologi och är mottagliga för konditions förändringar till följd av högt proteinuttryck6. Båda metoderna är begränsade av antalet fluorescerande markörer detekterbara med flödescytometri. En avancemang i molekylär kvantifiering uppnåddes genom utveckling av en microarray teknik som detekterade dämpning i 120 stammar från en initial blandad infektion av över 1 000 stammar i en murin modell7. Denna teknik utnyttjade en Microarray analys av RNA från muterade stammar, vilket leder till betydande variation i resultatet. Det fastställdes dock att stora pooler av blandade infektioner kan vara ett användbart verktyg och att genom att använda känsliga detektionstekniker kan skillnader i bakteriell virulens identifieras. Med utvecklingen av nästa generations sekvensering utvidgade TN-SEQ nyttan av transposon mutationer, vilket möjliggjorde en kraftfull metod för att kvantifiera bakterier som var slumpmässigt muterade8,9,10, 11. Ett alternativt protokoll utvecklades nyligen som eliminerar behovet av transposoner och i stället använder DNA-streckkoder för att lättare identifiera och spåra genomiska förändringar och deras inverkan på Fitness12. Denna teknik är en stor avancemang, men införandet av genomiska streckkoder är fortfarande en slumpmässig process. För att övervinna slumpmässighet av tidigare experiment, Yoon et al. utvecklat en metod för att beräkna CIs av salmonella stammar med hjälp av unika DNA-streckkoder införas på exakta platser på kromosomerna av bakterier13. Unika barkodade stammar upptäcktes med hjälp av en qPCR-baserad metod med SYBR Green och primers som är specifika för varje unik streckkod. Tekniken begränsades av restriktioner som införts av qPCR, inklusive skillnader i primer effektivitetsvinster och låg känslighet, vilket framgår av behovet av kapslade-PCR före qPCR. Detta tillvägagångssätt visade dock att riktade genomiska modifikationer skulle kunna utnyttjas för att upptäcka och potentiellt kvantifiera pooler av flera bakteriestammar.
I följande protokoll beskriver vi en ny metod för att utföra bakteriella konkurrens experiment med stora pooler av blandade inokulat följt av noggrann kvantifiering med hjälp av en mycket känslig Digital PCR-teknik. Protokollet innebär genetiskt märkning bakteriestammar med en unik DNA-streckkod införas på en ofarlig region av kromosomen. Denna modifiering gör att stammar snabbt och korrekt kvantifieras med hjälp av modern molekylär teknik i stället för traditionella seriella utspädningar, replika plätering, och räkna Colony Forming enheter som förlitar sig på fenotypiska markörer (dvs. antibiotikaresistens ). Modifieringarna möjliggör samtidig bedömning av många stammar i en enda poolade inoculum, avsevärt minska risken för experimentell variation eftersom alla stammar utsätts för exakt samma villkor. Dessutom, medan denna teknik utvecklades i salmonella SalmonellaentericaSerovar serovar typhimurium, det är mycket anpassningsbar till någon genetiskt aducerade organism och nästan alla experimentella design där exakta bakterie värden krävs, vilket ger en ny verktyg för att öka noggrannheten och genomströmningen i mikrobiologi laboratorier utan de begränsningar som införts av tidigare metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. införliva unika DNA-streckkoder på en Plasmid innehållande de nödvändiga komponenterna för Allelic utbyte
Anmärkning: En ny plasmid, heter pskap, med en hög kopia nummer och ökad omvandling effektivitet jämfört med den befintliga pKD13 alleliska utbyte plasmid skapades. Detta beskrivs i steg 1.1-1.12 (figur 1). De avslutade plasmiderna som innehåller unika DNA-streckkoder och komponenter för alleliska utbyte är tillgängliga via en Plasmid repository (tabell över material).
- Med hjälp av en kommersiell plasmid miniprep kit, rena pKD1314 och ppcr script Cam sk+ från natten bakteriekulturer odlas i Luria-Bertani (lb) buljong kompletterad med 50 μg/ml kanamycin eller 25 μg/ml kloramfenikol (för pKD13 och ppcr script Cam SK +, respektive) (tabell 1).
- Utföra restriktiondigestioner på båda plasmiderna med hjälp av kommersiella restriktionsenzymer HindIII och BamHI enligt tillverkarens specifikationer.
- Ta bort restriktionsenzymer och censurerade DNA från ppcr-skriptet Cam sk+ -reaktionen och rena BP-plasmid-stamnätet (3 370-Base pair) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt DNA Cleanup kit enligt tillverkarens specifikationer.
- Separera fragment från pKD13 begränsning matsmältningen på en 1% aguppstod gel med hjälp av en elektrofores kammare.
- Visualisera band med en blå ljus transilluminator och punktskatter på 1 333 BP fragment från gelen (figur 1c).
Anmärkning: Detta fragment innehåller den FRT-flankerade kanamycin resistens gen som krävs för kromosomala alleliska ersättare. - Rena det exciderade DNA från steg 1,5 med hjälp av en kommersiell gel Extraction Kit.
- För att skapa pskap, ligera det renade fragmentet från pKD13 (från steg 1,6) till ppcr-skript Cam sk+ (från steg 1,3) med en kommersiell T4 DNA Ligase enligt tillverkarens specifikationer.
- Omvandla kemiskt kompetenta DH5α-celler med den ligerade pSKAP-plasmid enligt tillverkarens protokoll (tabell 1).
- Sprid omvandlar på LB-agar plattor kompletterade med 50 μg/mL Kanamycin och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Välj en koloni från plattan och strimma den på en ny LB-agarplatta kompletterad med 50 μg/mL Kanamycin och inkubera vid 37 ° c över natten. Välj en koloni från denna platta och använda för att Inokulera LB buljong kompletterad med 50 μg/mL kanamycin. Inkubera kulturen över natten vid 37 ° c med ständig agitation.
- Använd en kommersiell plasmid miniprep kit för att rena pSKAP från natten bakteriekulturen.
- Utför en diagnostisk begränsning nedbrytning av plasmid från steg 1,11 med hjälp av hind III och BAM HI enligt tillverkarens specifikationer. Visualisera fragment på en 1% aguppkom gel som i steg 1.4-1.5.
Anmärkning: Den pSKAP Total storlek bör vara 4 703 BP. fragment efter steg 1,12 bör vara 3 370 och 1 333 BP. - Konstruera PCR-primers för insertionsmutationer platsriktad mutagenes (SDM) (tabell 2 och S1) på ett sådant sätt att den infogar en unik DNA-sekvens på 25 basepair i position 725 av pskap (figur 2).
Anmärkning: Streckkoden DNA sätts in i plasmiden strax utanför den FRT-flankerad kanamycin motstånds gen, så streckkoden inte förloras under efterföljande avlägsnande av kanamycin motstånd kassetten. Om du skapar nya streckkods serier ska du använda onlineverktyg för att se till att de fluorescerande, målspecifika PCR-sonderna (hädanefter enbart kallade "sonder") effektivt binder till den nya sekvensen. Infognings sekvenser som utformats för att datera, tillsammans med de nödvändiga primers för att skapa dem, finns i tabellerna 2 och S1. - Förbered SDM reaktioner med hjälp av en kommersiell HiFi-DNA-polymeras, den önskade primer par (tabell 2), och pskap mall. Ställ in termocyklern att utföra följande: 1) 98 ° c för 30 s, 2) 98 ° c för 10 s, 56 ° c för 15 s, 72 ° c för 2 min, 3) Upprepa steg 2, 24 gånger, 4) 72 ° c i 5 min, 5) Håll vid 4 ° c.
- Efter avslutad PCR, bryter pSKAP mall genom att lägga till begränsningen enzymet DPN I till reaktionen. Inkubera vid 37 ° c i 20 min.
Anmärkning: Produkter från PCR ska visualiseras på en agaros gel för att kontrollera produktens storlek och renhet. En kontroll DPN I matsmältning bestående av den oförändrade pSKAP-mallen kan utföras och användas i efterföljande steg för att säkerställa att mallDNA är helt smält. - Använd 5 μL av produkten från steg 1,15 för att omvandla 100 μL av kommersiellt kemiskt kompetenta DH5α-celler enligt tillverkarens rekommendationer.
- Sprid transformanter på LB-agar plattor kompletterade med 25 μg/mL kloramfenikol och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Välj en koloni (eller kolonier) från över natten tallrikar och strimma på enskilda LB agar plattor kompletteras med 25 μg/mL kloramfenikol och inkubera vid 37 ° c över natten. Välj en koloni från över natten tallrikar och använda för att Inokulera 5 mL LB buljong kompletterad med 25 μg/mL kloramfenikol. Inkubera kulturen (s) över natten vid 37 ° c med ständig agitation.
- Använd en kommersiell plasmid miniprep kit för att rena plasmider från natten kulturen (s).
- Sanger sekvens renade plasmider med hjälp av M13 Framåtsekvensering primer (tabell 2). Jämför muterad region till den ursprungliga plasmid och utvärdera för SDM insertionsmutationer noggrannhet.
- Efter bekräftelse av streckkod insättning och noggrannhet, tilldela varje streckkod och plasmid ett namn.
Anmärkning: Streckkoder genererade till-datum har tilldelats en två bokstäver beteckning: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, etc. Barkodade plasmider betecknas som pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc. - Upprepa steg 1.14-1.21 för att generera önskat antal DNA-streckkoder.
2. införa DNA-streckkod på kromosomen av S. Typhimurium
Anmärkning: Införande av DNA-streckkoderna på S. Typhimurium kromosom uppnås genom att använda en alleliska utbytes metod som beskrivs av datsenko och Wanner14 som har modifierats för användning i S. Typhimurium.
- Bestäm Locus på S. Typhimurium genom vilken DNA-streckkoden ska infogas (figur 3).
Anmärkning: Välj en stor, InterGen region av kromosomen. Undvik regioner som producerar icke-kodningrna. Denna studie utnyttjade en Locus nedströms av put P mellan restsubstanser 1 213 840 och 1 213 861 (bestäms från genommontering GCA_ 000022165.1). Denna region har tidigare varit genetiskt manipulerats för i trans komplettering av gener15. Alternativt kan en DNA-streckkod införas samtidigt som en gen av intresse samtidigt störs. Detta skulle kräva minimala ändringar av detta protokoll och effektivisera mutantskapandet. - Konstruera PCR-primers för att förstärka den unika streckkoden och den FRT-flankerade kanamycin-resistensgenen från den önskade pSKAP barcode-innehållande plasmid från steg 1,21 (tabell 2). Lägg till 40-nukleotid förlängningar som är homologa till den region som valts i steg 2,1 till 5 ' slutet av varje primer (tabell 2).
- Utför amplifiering med hjälp av en kommersiell High Fidelity-polymeras, primers från steg 2,2, och önskad pSKAP streckkod som innehåller plasmid som mall. Ställ in termocyklern att utföra följande: 1) 98 ° c för 30 s, 2) 98 ° c för 10 s, 3) 56 ° c för 15 s, 4) 72 ° c för 60 s, upprepa steg 2-4 29 gånger, 5) 72 ° c i 5 min, 6) Håll vid 4 ° c.
- Efter avslutad PCR, tömma mallDNA med DpnI som beskrivs i steg 1,15. Rena och koncentrera DNA med hjälp av en kommersiell DNA Cleanup kit enligt tillverkarens specifikationer.
- Hänvisa till det tidigare publicerade protokollet för generering av mutanter i S. Typhimurium stam 14028s från PCR-produkter14,16,17,18.
Anmärkning: Det är inte nödvändigt att kanamycin resistens gen är censurerade från kromosomen. Men excision av genen är minimalt störande för bakteriell kromosom eftersom det resulterar i en 129 BP ärr som skulle lämna potentiella nedströms gener i bildruta. Det rekommenderas att stammen som innehåller kanamycin resistensgenen behålls eftersom den kan användas för att flytta streckkoder mellan stammar via P22-medierad transduktion. - Upprepa steg 2,3 – 2,5 för att skapa önskade stammar med rätt streckkoder.
Anmärkning: Streckkoder kan införas i Wild-Type S. Typhimurium som sedan kan utsättas för ytterligare genetisk manipulation, eller streckkoder kan införas i stammar som har tidigare genetiskt modifierade.
3. bakteriella tillväxtförhållanden och in vitro-konkurrensanalyser
- Från bakterier lager, strimma önskade S. Typhimurium stammar som varje hamn en unik DNA-streckkod på LB agar plattor. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
- Välj en enda koloni från varje stam och Inokulera 5 mL LB buljong. Inkubera i 20 h vid 37 ° c med ständig agitation.
Anmärkning: Med hjälp av natten kulturen, gå vidare till steg 3,5 att samla in ren genomisk DNA (gDNA) från varje barkodade stam. Detta är nödvändigt för efterföljande validerings-och kontroll experiment i avsnitt 6. - För varje konkurrensanalys, överföra en lika stor volym av varje natten kultur i en lämplig storlek steril röret. Blanda stammar noggrant genom att vortexera kraftigt i minst 5 s.
Anmärkning: Volymen av varje natt kultur att överföra bör vara tillräcklig för varje tillstånd och replikera, samt för att isolera gDNA att kvantifiera indata. Även om det inte är helt nödvändigt att mäta optiska densiteter av kulturer, eftersom det absoluta antalet input mikroorganismer kommer att kvantifieras med hjälp av digital PCR, bör antalet inmatnings bakterier för varje stam vara ungefär lika för att undvika flaskhalsar eller ojämlik konkurrens tidigt i experimentet. Representativa konkurrensanalyser i detta protokoll jämförde tillväxttakten med 8 stammar samtidigt. Ytterligare eller färre stammar kan behövas för individuell experimentell design. - Överför 100 μl av det blandade inokulum till 4,9 ml steril lb-buljong. Inkubera vid 37 ° c för önskad tid eller till önskad optisk densitet.
- Skörda 500 μl av inokulum genom centrifugering vid > 12000 x g under 1 min. ta bort och Kassera supernatanten. Fortsätt omedelbart till avsnitt 4 med cellerna.
- Vid önskade tidpunkter, ta bort 500 μL alikvoter av kultur och skörd celler genom centrifugering på > 12000 x g för 1 min. ta bort och Kassera supernatanten.
Anmärkning: Om du samlar in alikvoter vid flera tidpunkter, frysa pellets vid-20 ° c eller omedelbart gå vidare till steg 4,1 efter varje samling.
4. insamling och kvantifiering av gDNA från S. Typhimurium (från steg 3,5 och 3,6)
- Skörda gDNA från celler med hjälp av en kommersiell gDNA rening kit. Om tillgängligt, utför den valfria RNA utarmning steg.
Anmärkning: RNA utarmning är inte nödvändigt; dock kommer närvaron av RNA artificiellt öka DNA-koncentrationen, vilket leder till avvikande beräkningar i efterföljande steg. Om du använder en kommersiell gDNA renings sats, följ tillverkarens rekommendationer för att säkerställa att kolonnen inte är överbelastad med DNA. Det krävs ingen minsta DNA-koncentration om provet är kvantifierbar i efterföljande steg. - Använd en spektrofotometer för att kvantifiera DNA i varje prov.
Anmärkning: DNA kan kvantifieras med någon tillförlitlig metod. - Beräkna gDNA-kopieringsnummer baserat på bakterie genomets storlek med hjälp av följande ekvation: X är mängden DNA i ng och N är längden på en dubbelsträngad DNA-molekyl (genomets storlek).
Anmärkning: 660 g/mol används som den genomsnittliga massan av 1 DNA BP. små variationer kan förekomma beroende på organismens nukleotidsammansättning. Många räknare finns tillgängliga online för att utföra beräkningen.
5. design primers och sonder för kvantitativ detektion av DNA-streckkoder via dDigital PCR
- Design primers för att förstärka den barkodade regionen av S. Typhimurium-kromosomen nedströms Putp (figur 3c och tabell 2).
Anmärkning: Primer och sond konstruktioner kan underlättas av många online-program (tabell över material). Om streckkoder är alla insatta på samma loci, en enda uppsättning förstärkning primers är universell för alla streckkoder. - Design 6-karboxyfluorescein (FAM)-baserade och/eller hexaklorofluorescein (HEX)-baserade sonder som är specifika för varje streckkod (tabell 2 och S1).
Anmärkning: DROPP-läsare som används i det här experimentet kan identifiera både FAM-och hex-baserade sonder samtidigt i en multiplex-reaktion. Design 1/2 av sonderna att använda FAM och 1/2 att använda HEX. Detta är inte ett nödvändigt steg, men kommer att minska reagensanvändning och experimentella kostnader om de genomförs. - Gör 20x primer-sond Master mixer innehållande 1) 20 mM av varje framåt och bakåt amplifiering primer, 2) 10 mM av en enda FAM sond, och 3) 10 mM av en enda HEX sond (om multiplexering).
6. validera känsligheten och specificiteten för varje Pprimer-probuppsättning för varje genomisk streckkod med digital PCR
Anmärkning: I det här protokollet används validering av åtta unika streckkoder med åtta unika avsökningar som exempel. Antalet streckkoder utnyttjas kan ökas eller minskas för att rymma olika experimentella konstruktioner.
- Skapa en pool av gDNA som innehåller varje streckkod utom en. Använd den här poolen som spädningsvätska för att utföra en utspädningsserie med gDNA som innehåller den enda kvarvarande streckkoden (prov utspädningssystem finns i figur 4).
Anmärkning: Användning av poolade gDNA som spädningsvätska säkerställer en konsekvent bakgrund samtidigt som känslighet. Med hjälp av de kopierings nummer som bestäms i steg 4,3, späd gDNA till ett kopienummer inom det rekommenderade digitala PCR-intervallet (1-100000 kopior per 20 μL reaktion). Tänk på att intervallet är inställt för varje unikt mål (streckkod), inte den totala gDNA. - Förbered reaktioner för digital PCR i två exemplar enligt tillverkarens rekommendationer för användning av en digital PCR-portions Supermix avsedd för sond-baserad kemi. Använd blandningarna från steg 6,1 som DNA-mall. Använd 20x primer-sond Master Mix från steg 5,3 som innehåller sonden för den utspädda streckkoden i steg 6,1.
- Förbered replikations kontrollreaktioner för digital PCR enligt tillverkarens rekommendationer för användning av en digital PCR-portions Supermix avsedd för sond-baserad kemi. Kontroll reaktionerna för varje sond blandning måste bestå av 1) inga mallkontroller (NTCs), 2) negativa kontroller och 3) positiva kontroller.
Anmärkning: Det minsta antalet replikat kontrollreaktioner är två. Detta exempel protokoll använder fyra NTCs, sex negativa kontroller och sex positiva kontroller för varje streckkod. Negativa kontroller bör innehålla gDNA med varje streckkod utom den streckkod som motsvarar den sond som testas. Detta kommer att validera specificiteten hos varje sond. - Upprepa steg 6.1-6.3 för att skapa digitala PCR-reaktioner för varje barkodad gDNA-prov. Ett prov plåt arrangemang presenteras i figur 5.
Anmärkning: Detta och efterföljande steg beskrivs baserat på en specifik Digital PCR-plattform som använder dropletar och flödesbaserad teknik. Alternativa digitala PCR-plattformar som utnyttjar chip-baserad teknik kan enkelt ersättas med smärre ändringar av detta protokoll. Steg 6,4 kan kräva mer än 1 96-väl plattan för att validera alla primer uppsättningar. I motsats till qPCR kan separata plattor som analyseras med digital PCR lätt jämföras utan behov av standardiserade referensbrunnar mellan plattorna. - Generera droppar för varje reaktions tillstånd med hjälp av en dropp Generator enligt tillverkarens anvisningar.
- Överför nyligen skapade droppar i lämplig 96-brunn plattan. Använd 200 μL pipettspetsar på en 5-50 μL Multichannel-pipett.
Anmärkning: Vid pipettering av droppar, Pipettera långsamt och smidigt! Tillverkaren av den digitala PCR-utrustningen rekommenderar endast användning av pipetter och pipettspetsar från en viss tillverkare (t. ex. Ranin). Dessa pipettspetsar har en slät öppning utan mikroskopiska plastfragment som kan förstöra droppar eller skada mikrofluidien i dropp läsaren. Många märken av tips granskades och observerades för att ha ett spektrum av tillverkningskvalitet. Likvärdiga resultat har uppnåtts med hjälp av alternativ för pipettspetsen. emellertid, försiktighet bör iakttas när avviker från tillverkarens rekommendationer. - Efter alla droppar har genererats och överförts, täta plattan med en folie plåt sealer.
- Använd tillverkaren rekommenderade termocycler att utföra följande cykel förhållanden: 1) 94 ° c för 10 min; 2) 94 ° c i 1 min, ramphastighet inställd på 1 ° c/s; 3) 55 ° c i 2 min, ramphastighet inställd på 1 ° c/s; 4) Upprepa steg 2 och 3 49 gånger; 5) 98 ° c i 10 min; 6) Håll vid 4 ° c upp till 24 h.
Anmärkning: Termisk överföring i en dropp reaktion är inte detsamma som standard-PCR. Reaktions förhållanden kan kräva modifiering. - Medan termocykling utförs, programmera dataanalysprogram vara med plattan inställningsinformation såsom prov namn, experiment typ (absolut kvantifiering), portions Supermix används, mål 1 namn (FAM streckkod namn), mål 1 typ (NTC, positiv kontroll, negativ kontroll eller okänd), mål 2-namn (hexadecimalt streckkods namn), mål 2-typ (tom, positiv kontroll, negativ kontroll eller okänd). Den slutliga inställningsinformationen för plattan visas i figur 5.
- Efter att termocyklingen är klar, överför de slutförda reaktionerna till dropp-läsaren och starta läsprocessen enligt tillverkarens anvisningar.
7. kvantifiera antalet bakterier i ett konkurrensutsatt index experiment
- Späd gDNA isolerat och kvantifierade från avsnitt 4 till en lämplig koncentration enligt beskrivningen ovan.
- Förbered reaktioner för digital PCR enligt tillverkarens rekommendationer för användning av lämplig Supermix. Använd DNA från steg 7,1 som mall. Använd en 20x primer-sond Master Mix som innehåller sonden (eller sonderna om upptäcka både FAM och HEX) för eventuella streckkoder som finns i experimentet.
- Förbered ytterligare digitala PCR-reaktioner som i steg 7,2 med hjälp av olika 20x primer-sond Master mixer tills alla streckkoder utnyttjas i experimentell design kan upptäckas.
- Inkludera kontroller för varje villkor som beskrivs i 6,3. Detta inkluderar 1) inga mallkontroller (NTCs), 2) negativa kontroller och 3) positiva kontroller.
- Fortsätt med protokollet enligt beskrivningen i steg 6.5-6.10.
8. analysera digitala PCR-data och beräkna absoluta kopienummer
- När alla brunnar har lästs och körningen är klar, öppna. QLP-datafilen med hjälp av dataanalysprogrammet.
Anmärkning: De filtyper och dataanalys procedurer som beskrivs här är specifika för en digital PCR-tillverkare. Om du använder alternativa digitala PCR-plattformar kommer filtyper och dataanalys procedurer att vara specifika för den plattform som används och bör utföras i enlighet med tillverkarens rekommenderade specifikationer. - Välj alla brunnar som använder samma primer-sond Master Mix.
- På fliken dropletar undersöker du antalet droppar som analyseras i varje brunn (både positiva och negativa droppar). Utesluta från analys någon brunn så pass har färre än 10 000 räkna samman dropparna.
- Gå till fliken 1d-amplitud och undersök amplituderna för positiva och negativa droppar. Se till att de består av två distinkta populationer.
- I programvaran använder du funktionen tröskelvärde för att göra en cutoff mellan positiva och negativa droppar för varje sond som användes (figur 6).
Anmärkning: Alla brunnar som använder samma primer-sond Master Mix från steg 5,3 bör ha samma trösklar. - När lämpliga tröskelvärden har tillämpats på alla brunnar, kommer programvaran beräkna antalet DNA-kopior i varje reaktion. Exportera data till ett kalkylark för att underlätta ytterligare analys.
Anmärkning: Dataanalysprogrammet använder antalet positiva och negativa droppar som är lämpliga för en Poissonfördelning för att fastställa kopierings numret. - Med hjälp av värdena från steg 8,6 beräknar du det initiala kopierings numret för varje unik genomisk streckkod i provet. Bestäm medelvärdet av falskt positiva tal från de negativa kontroll reaktionerna och subtrahera detta värde från de värden som erhållits i experimentella reaktioner. Multiplicera värden som behövs baserat på utspädningar som utfördes när du ställer in varje experiment (tabell 3).
9. Bestäm relativ kondition hos en organism genom att beräkna CI eller COI från Digital PCR-baserad kvantifiering av Barkodade stammar
- Beräkna CI för en streckkodad stam med hjälp av följande formler där: enutgång är den absoluta kvantifieringen av den barkodade stammen vid en given tidpunkt, WT-utgång är den absoluta kvantifieringen av barkodade Wild-Type bakterier på samma timepoint är eningång den absoluta kvantifieringen av ininoculum av den barkodade stammen, WT-ingången är den absoluta kvantifiering av ininoculum av barkodade Wild-Type bakterier, X-utgång är summan av alla stammar vid samma timepoint, Xinput är summeringen av den totala input inokulum av alla barkodade stammar.
Anmärkning: Se diskussionen för fördelar, nackdelar och den lämpligaste användningen av varje formel.
- Upprepa steg 9,1 för varje streckkodad stam vid alla tidpunkter.
- Om tillämpligt, beräkna COI med hjälp av följande formler där: enutgång är den absoluta kvantifieringen av en streckkodad stam med muterad gen A vid en given tidpunkt, ABoutput är en absolut kvantifiering av en streckkodad stam med muterade gener a och B vid samma tidpunkt är eningång den absoluta kvantifieringen av indatabininoculum hos den barkodade stammen med muterad gen a, ABinput är den absoluta kvantifieringen av ininoculum av barkodad stam med muterade gener A och b, b-utgång är den absoluta kvantifieringen av en streckkodad stam med muterad gen B vid en given tidpunkt, och b-ingången är den absoluta kvantifieringen av inokulum av den barkodade stammen med muterad gen B.
Eller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av denna metod kräver att lämpliga kontrollreaktioner utförs för att validera känsligheten och specificiteten hos varje sond som används för att identifiera måldna. I detta representativa experiment validerade vi åtta unika DNA-streckkoder med de åtta motsvarande sonderna för identifiering. Alla åtta sonder hade en låg frekvens av falska positiva i både NTC och negativa kontrollreaktioner (tabell 3), belyser deras specificitet även bland mycket likartade DNA-sekvenser. För att bedöma känsligheten för varje tillstånd, gDNA som innehåller en unik streckkod var seriellt utspädd i en ständig bakgrund av gDNA som innehåller var och en av de sju återstående streckkod sekvenser. Med den metod som beskrivs ovan kan Digital PCR särskilja så få som 2 kopior av gDNA i en bakgrund av nästan 2 000 000 liknande DNA-sekvenser (tabell 3).
Förutom att fastställa känsligheten och specificiteten hos varje sond och DNA-streckkodssekvens, gjorde utspädningar som utfördes i validerings undersökningen det möjligt för oss att beräkna ett simulerat konkurrens index från de resulterande uppgifterna. Det fanns inga sanna indata eller utdata för det här experimentet, data kan analyseras som om ett konkurrens experiment har utförts. För att göra detta anser vi att varje blandning i den seriella utspädningen som en utgång (enutgång) för den utspädda streckkoden, medan den totala produktionen (x-utgång), indata (eningång) och den totala ingången (x-ingången) för varje stam beräknas från kvantifiering i de positiva kontrollerna där alla streckkoder ingår. Genom att använda utspädningsfaktorn för varje blandning bestämdes det teoretiska KI-värdet och rapporteras i tabell 3. I varje utspädningsserie som utfördes för varje streckkod rapporteras den genomsnittliga simulerade CI tillsammans med standardavvikelserna för varje duplicerad utspädningsserie. I samtliga fall, den simulerade CI som beräknades liknar den teoretiska CI. Merparten av beräknad CIs avviker från den teoretiska CIs med mindre än 25%. I fall med lägre teoretiska CIs, var avvikelsen av det beräknade värdet uppemot 2-faldigt. Detta innebar till exempel en förändring från en teoretisk CI på 0,000625 till en beräknad CI på 0,001220. Dessa data belyser att den beskrivna metoden är både mycket noggrann och mycket exakt. Kombinationen av hög känslighet, specificitet, noggrannhet och precision aktivera detta system för att tillförlitligt upptäcka skillnader i kondition som annars kan gå obemärkt förbi.
Efter att ha validerat att genomiska streckkoder kunde upptäckas och kvantifieras korrekt utförde vi in vitro-konkurrensexperiment (tabell 4). Det första tävlings experimentet utnyttjade åtta Wild-Type S. Typhimurium stammar som var och en innehöll en unik DNA-streckkod. Varje stam odlades över en natt, och de åtta kulturerna blandades ihop i lika mängder. 100 μl av detta blandade inokulum användes för att Inokulera 4,9 ml steril lb-buljong och den resulterande kulturen inkuberades vid 37 ° c med ständig agitation. gDNA skördades från inokulum för att beräkna den exakta inmatningen av varje stam. Tillväxten av kulturen övervakades genom att mäta absorbansen vid 600 Nm (OD600). Vid OD600 = 0,5 (logaritmisk fas) samlades ett prov från varje kultur och gDNA skördades. Den resterande kulturen återlämnades till 37 ° c med ständig agitation till 8 timmar efter inympning när ett slutligt prov samlades in och gDNA skördades (stillastående). Resultaten beräknades med hjälp av den CI-formel som modifierats för poolade infektioner. Som väntat hade alla vildtyps-stammar CI-värden som var nästan lika med 1 (tabell 4). Ett liknande tävlings experiment utfördes med hjälp av åtta Mutant S. Typhimurium stammar som var och en hade unika streckkoder förutom en enkel-, dubbel-, eller trippel-transketolase brist18. Som visats tidigare, stammarna växte alla på samma sätt i LB buljong, med endast en liten fördröjning observerades i Triple-transketolase-bristfällig stam. Emellertid, när tillväxten av varje stam bedömdes genom att analysera CI, en mycket mer djupgående defekt observerades för transketolase-bristfällig stam (CI jämfördes med tillväxtkurvor i Shaw et al.18). Dessutom tillät detta experiment oss att tilldela varje stam tillväxtkarakteristika ett kvantifierbara värde i stället för att enbart kvalitativt beskriva tillväxt mönstren. CIs för varje stam beräknades med hjälp av både den traditionella formeln där varje stam endast jämfördes med vildtyp och den modifierade formeln där alla insats stammar ansågs. Medan förändringarna var små, CI av Triple-transketolase-bristfällig stam var artificiellt låg i den traditionella formeln eftersom det inte står för de andra sex konkurrerande stammar som alla uppvisade nära-Wild-typ Fitness.
| Stammar | Genotyp | Källa eller referens |
| S. typhimurium ATCC 14028s | Wild-Type | Atcc |
| TT22236 | LT2 salmonella redovisade pTP2223 | 27 |
| DH5α | F– φ 80Laczδm15 Δ (LacZYA-argF) U169 RECa1 Enda1 HSDR17 (rk–, mk+) PhoA SUPE44 λ– Thi-1 GyrA96 rela1 | 28 |
| JAS18077 | Putp::AA:: FRT | Denna studie |
| JAS18080 | Putp::AD:: FRT | Denna studie |
| JAS18083 | Putp::AG:: FRT | Denna studie |
| JAS18088 | Putp::Al:: FRT | Denna studie |
| JAS18091 | Putp::Ao:: FRT | Denna studie |
| JAS18096 | Putp::på:: FRT | Denna studie |
| JAS18099 | Putp::AW:: FRT | Denna studie |
| JAS18100 | Putp::AX:: FRT | Denna studie |
| JAS18122 | ΔTkta:: FRT Putp::AD:: FRT | Denna studie |
| JAS18130 | ΔTktb:: FRT Putp::Al:: FRT | Denna studie |
| JAS18138 | ΔTktc:: FRT Putp::på:: FRT | Denna studie |
| JAS18125 | ΔTkta:: FRT Δtktb:: FRT putp::AG:: FRT | Denna studie |
| JAS18133 | ΔTkta:: FRT δtktc:: FRT putp::Ao:: FRT | Denna studie |
| JAS18141 | ΔTktb:: FRT Δtktc:: FRT putp::AW:: FRT | Denna studie |
| JAS18142 | ΔTkta:: utt δtktb:: FRT δTktc:: FRT Putp::AX:: FRT | Denna studie |
| Plasmider | ||
| pKD13 | bla FRT AHP FRT ps1 PS4 oriR6K | 14 |
| pPCR-skript Cam SK + | ColE1 Ori; CmR | Stratagene/Aligent |
| pTP2223 | Plac lam bet EXO tetR | 16 |
| pCP20 | bla Cat cI857 PRFLP pSC101 Orits | 29 |
| pSKAP | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT | Denna studie |
| pSKAP_AA | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AA | Denna studie |
| pSKAP_AD | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AD | Denna studie |
| pSKAP_AG | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AG | Denna studie |
| pSKAP_AL | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Al | Denna studie |
| pSKAP_AO | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AOS | Denna studie |
| pSKAP_AT | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Vid | Denna studie |
| pSKAP_AW | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; AW | Denna studie |
| pSKAP_AX | ColE1 Ori; CmR; bla FRT AHP FRT; Yxa | Denna studie |
Tabell 1: stammar och plasmider som används i denna studie.
| Namn | Sekvens (5 '-3 ')1, 2, 3 |
| pSKAP SDM AA-F | Mer från Agaagtctcctgctggtgcttgagt CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AA-R | Actcaagcaccagcaggagacttct CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AD-F | Aagagcacggtgaggtgatagtagg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AD-R | Cctactatcacctcaccgtgctctt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AG-F | Mer från Agtagtgtcctggaggagcatgtga CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AG-R | Tcacatgctcctccaggacactact CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL-F | Accacacatcgaaggcactagctct CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL-R | Agagctagtgccttcgatgtgtggt CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AO-F | Gtccacaaccacactcagtgatact CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AO-R | Agtatcactgagtgtggttgtggac CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM på-F | Accagtgtccgtgacatggctagac CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AT-R | Gtctagccatgtcacggacactggt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AW-F | Mer från Acgactgagtgatgtggatgtgacg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AW-R | Cgtcacatccacatcactcagtcgt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AX-F | Actatcgtggtgtaacgacaggctg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AX-R | Cagcctgtcgttacaccacgatagt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| M13-F | GTAAAACGACGGCCAG |
| Putp Rekombination-F |
Mer från TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA TGCAGCATTACACGTC |
| Putp Rekombination-R |
TACTGCGGGTATTAATGCTGAAAACATCCATAACCCATTG CCTGCAGTTCGAAGTTCC |
| qPCR-streckkods region Amplify-F1 | TGCAGCATTACACGTCTTG |
| qPCR-streckkods region Amplify-R2 | TAGGAACTTCGAAGCAGC |
| Streckkod AA sond-FAM | 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ |
| Streckkod AD PROBE-FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ |
| Streckkod AG PROBE-FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ |
| Streckkod AL PROBE-FAM | 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ |
| Streckkod AO sond-HEX | HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ |
| Streckkod på PROBE-HEX | HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
| Streckkod AW sond-HEX | HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ |
| Streckkod AX sond-HEX | HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ |
|
1 Understrukna nukleotider indikerar kompletterande sekvenser för varje DNA-streckkod som sätts in på pSKAP efter SDM. 2 Dubbla understrukna nukleotider indikerar en kompletterande region på S. Typhimurium kromosom används för alleliska ersättare. 3 Primetime qPCR sonder är hybridisering oligos märkta med en 5 ' fluorescerande färgämne, antingen 6-karboxyfluorescein (6-FAM) eller hexachlorofluorescein (hex), en intern törstsläckare (Zen), och 3 ' quencer Iowa Black® FQ (ibfq). |
|
Tabell 2: primrar och sonder som används i denna studie.
| Kvantifiering (kopior/20μL reaktion) | ||||||||
| Beskrivning | Aa | Ad | Ag | Al | Ao | På | Aw | Ax |
| Ntc | N/A | 0,000 | 0,000 | 3,510 | N/A | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 3,600 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 3,510 | 0,000 | 1,280 | 1,180 | 2,340 | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 2,290 | 0,000 | 0,000 | 1,200 | 1,150 | 1,160 | 0,000 | 0,000 |
| Menar | 3,133 | 0,000 | 0,320 | 1,473 | 1,163 | 0,290 | 0,000 | 0,000 |
| Negativa | 5,130 | 1,156 | 0,000 | 1,124 | 3,745 | 1,281 | 7,354 | 7,142 |
| Negativa | 5,270 | 0,000 | 0,000 | 1,087 | 1,666 | 1,643 | 7,746 | 2,269 |
| Negativa | 2,660 | 0,000 | 1,361 | 1,451 | 8,974 | 0,000 | N/A | 0,000 |
| Negativa | 6,090 | 0,000 | 0,000 | 2,251 | 0,000 | 2,531 | 8,700 | 3,495 |
| Negativa | 1,740 | 0,000 | 1,086 | 2,130 | 4,171 | 0,000 | 7,113 | 5,522 |
| Negativa | 6,220 | 3,581 | 0,000 | 4,022 | 1,175 | 1,341 | N/A | 5,950 |
| Menar | 4,518 | 0,789 | 0,408 | 2,011 | 3,288 | 1,133 | 7,728 | 4,063 |
| Positiva | 22281,540 | 42673,039 | 46442,242 | 45359,180 | 47885,625 | 15708,027 | 45325,906 | 20810,559 |
| Positiva | 23989,676 | 44625,523 | 47356,438 | 45790,660 | 47456,973 | 15096,601 | 47929,840 | 22455,234 |
| Positiva | 17846,824 | 38980,133 | 45633,809 | 44174,820 | 33875,039 | 15156,063 | 42536,270 | 21467,840 |
| Positiva | 21047,588 | 40140,848 | 41672,648 | 46028,496 | 47426,527 | 16718,000 | 46978,664 | 19876,473 |
| Positiva | 20218,238 | 44660,602 | 41718,707 | 45799,375 | 46495,602 | 14590,264 | 54741,023 | 22011,938 |
| Positiva | 18531,740 | 41620,801 | N/A | 48082,313 | 35645,199 | 15341,382 | 48950,992 | 21117,559 |
| Menar | 20652,601 | 42116,824 | 44564,769 | 45872,474 | 43130,827 | 15435,056 | 47743,783 | 21289,934 |
| Tom subtraktion | 20648,083 | 42116,035 | 44564,361 | 45870,463 | 43127,539 | 15433,923 | 47736,054 | 21285,871 |
| Outspädd A | 23024,961 | 44448,875 | 58897,510 | 51120,948 | 55450,191 | 18155,305 | 62844,068 | 27567,828 |
| Outspädd B | 18278,174 | 35252,586 | 54409,510 | 66022,396 | 43101,148 | 15732,609 | 60761,328 | 26581,979 |
| 1/50 en | 521,670 | 755,035 | 1066,898 | 1287,187 | 1053,339 | 181,324 | 1278,336 | 580,961 |
| 1/50 B | 435,326 | 634,215 | 1168,087 | 1383,537 | 991,040 | 165,443 | 1180,445 | 596,461 |
| 1/100 en | 228,028 | 598,848 | 603,911 | 631,116 | 507,956 | 258,405 | 665,647 | 331,590 |
| 1/100 B | 256,330 | 585,834 | 583,325 | 670,875 | 459,325 | 289,207 | 638,916 | 307,948 |
| 1/200 en | 121,283 | 305,293 | 258,247 | 346,965 | 234,774 | 114,163 | 169,055 | 172,553 |
| 1/200 B | 114,638 | 313,040 | 253,685 | 297,216 | 191,637 | 179,895 | 280,989 | 147,297 |
| 1/400 en | 42,829 | 141,343 | 127,337 | 163,605 | N/A | 71,241 | 157,697 | 85,976 |
| 1/400 B | 59,544 | 180,543 | 162,080 | 162,108 | 115,508 | 104,682 | 151,141 | 87,804 |
| 1/800 en | 34,304 | 67,934 | 65,939 | 83,857 | 66,134 | 31,784 | 82,722 | 45,616 |
| 1/800 B | 20,390 | 80,222 | 81,453 | 85,325 | 53,102 | 38,034 | 55,460 | 29,660 |
| 1/1600 en | 15,405 | 44,505 | 47,672 | 39,613 | 33,027 | 18,006 | 37,655 | 20,988 |
| 1/1600 B | 22,091 | 48,828 | 46,781 | 37,388 | 30,245 | 30,138 | 34,553 | 19,795 |
| 1/3200 en | 12,333 | 22,104 | 16,850 | 18,403 | 11,460 | 10,535 | 21,245 | 9,218 |
| 1/3200 B | 6,796 | 32,555 | 15,742 | 26,249 | 15,111 | 9,908 | 23,393 | 10,175 |
| Tom subtraktion | ||||||||
| Outspädd A | 23020,443 | 44448,086 | 58897,103 | 51118,937 | 55446,903 | 18154,172 | 62836,339 | 27563,765 |
| Outspädd B | 18273,655 | 35251,797 | 54409,103 | 66020,385 | 43097,860 | 15731,477 | 60753,600 | 26577,916 |
| 1/50 en | 517,152 | 754,246 | 1066,490 | 1285,176 | 1050,051 | 180,192 | 1270,607 | 576,898 |
| 1/50 B | 430,808 | 633,426 | 1167,679 | 1381,526 | 987,751 | 164,311 | 1172,717 | 592,398 |
| 1/100 en | 223,509 | 598,059 | 603,503 | 629,105 | 504,668 | 257,272 | 657,918 | 327,527 |
| 1/100 B | 251,812 | 585,044 | 582,918 | 668,864 | 456,036 | 288,074 | 631,187 | 303,885 |
| 1/200 en | 116,765 | 304,503 | 257,840 | 344,954 | 231,486 | 113,030 | 161,327 | 168,490 |
| 1/200 B | 110,120 | 312,251 | 253,277 | 295,205 | 188,348 | 178,762 | 273,261 | 143,234 |
| 1/400 en | 38,310 | 140,554 | 126,929 | 161,594 | N/A | 70,108 | 149,968 | 81,913 |
| 1/400 B | 55,026 | 179,753 | 161,672 | 160,097 | 112,219 | 103,549 | 143,413 | 83,741 |
| 1/800 en | 29,786 | 67,145 | 65,531 | 81,847 | 62,846 | 30,651 | 74,994 | 41,553 |
| 1/800 B | 15,872 | 79,433 | 81,045 | 83,314 | 49,813 | 36,901 | 47,732 | 25,596 |
| 1/1600 en | 10,886 | 43,716 | 47,264 | 37,602 | 29,739 | 16,874 | 29,927 | 16,925 |
| 1/1600 B | 17,573 | 48,039 | 46,373 | 35,377 | 26,957 | 29,005 | 26,825 | 15,732 |
| 1/3200 en | 7,815 | 21,314 | 16,442 | 16,392 | 8,172 | 9,402 | 13,517 | 5,155 |
| 1/3200 B | 2,278 | 31,765 | 15,334 | 24,238 | 11,822 | 8,776 | 15,664 | 6,112 |
| Simulerad CI | ||||||||
| Outspädd A | 1,114895 | 1,055372 | 1,321619 | 1,114419 | 1,285650 | 1,176251 | 1,316329 | 1,294932 |
| Outspädd B | 0,885005 | 0,837016 | 1,220911 | 1,439279 | 0,999312 | 1,019279 | 1,272698 | 1,248618 |
| 1/50 en | 0,025046 | 0,017909 | 0,023931 | 0,028018 | 0,024348 | 0,011675 | 0,026617 | 0,027102 |
| 1/50 B | 0,020864 | 0,015040 | 0,026202 | 0,030118 | 0,022903 | 0,010646 | 0,024567 | 0,027831 |
| 1/100 en | 0,010825 | 0,014200 | 0,013542 | 0,013715 | 0,011702 | 0,016669 | 0,013782 | 0,015387 |
| 1/100 B | 0,012195 | 0,013891 | 0,013080 | 0,014582 | 0,010574 | 0,018665 | 0,013222 | 0,014276 |
| 1/200 en | 0,005655 | 0,007230 | 0,005786 | 0,007520 | 0,005367 | 0,007323 | 0,003380 | 0,007916 |
| 1/200 B | 0,005333 | 0,007414 | 0,005683 | 0,006436 | 0,004367 | 0,011582 | 0,005724 | 0,006729 |
| 1/400 en | 0,001855 | 0,003337 | 0,002848 | 0,003523 | N/A | 0,004542 | 0,003142 | 0,003848 |
| 1/400 B | 0,002665 | 0,004268 | 0,003628 | 0,003490 | 0,002602 | 0,006709 | 0,003004 | 0,003934 |
| 1/800 en | 0,001443 | 0,001594 | 0,001470 | 0,001784 | 0,001457 | 0,001986 | 0,001571 | 0,001952 |
| 1/800 B | 0,000769 | 0,001886 | 0,001819 | 0,001816 | 0,001155 | 0,002391 | 0,001000 | 0,001203 |
| 1/1600 A | 0,000527 | 0,001038 | 0,001061 | 0,000820 | 0,000690 | 0,001093 | 0,000627 | 0,000795 |
| 1/1600 B | 0,000851 | 0,001141 | 0,001041 | 0,000771 | 0,000625 | 0,001879 | 0,000562 | 0,000739 |
| 1/3200 A | 0,000378 | 0,000506 | 0,000369 | 0,000357 | 0,000189 | 0,000609 | 0,000283 | 0,000242 |
| 1/3200 B | 0,000110 | 0,000754 | 0,000344 | 0,000528 | 0,000274 | 0,000569 | 0,000328 | 0,000287 |
| Genomsnittlig CI (teoretisk) | ||||||||
| Outspädd (1) | 0,999950 | 0,946194 | 1,271265 | 1,276849 | 1,142481 | 1,097765 | 1,294514 | 1,271775 |
| 1/50 (0,02) | 0,022955 | 0,016474 | 0,025067 | 0,029068 | 0,023625 | 0,011161 | 0,025592 | 0,027466 |
| 1/100 (0,01) | 0,011510 | 0,014046 | 0,013311 | 0,014148 | 0,011138 | 0,017667 | 0,013502 | 0,014832 |
| 1/200 (0,005) | 0,005494 | 0,007322 | 0,005735 | 0,006978 | 0,004867 | 0,009453 | 0,004552 | 0,007322 |
| 1/400 (0,0025) | 0,002260 | 0,003803 | 0,003238 | 0,003507 | 0,00260 * | 0,005626 | 0,003073 | 0,003891 |
| 1/800 (0,00125) | 0,001106 | 0,001740 | 0,001645 | 0,001800 | 0,001306 | 0,002188 | 0,001285 | 0,001577 |
| 1/1600 (0,000625) | 0,000689 | 0,001089 | 0,001051 | 0,000795 | 0,000657 | 0,001486 | 0,000594 | 0,000767 |
| 1/3200 (0,000313) | 0,000244 | 0,000630 | 0,000357 | 0,000443 | 0,000232 | 0,000589 | 0,000306 | 0,000265 |
| Standardavvikelsen | ||||||||
| Outspädd | 0,11494 | 0,10918 | 0,05035 | 0,16243 | 0,14317 | 0,07849 | 0,02182 | 0,02316 |
| 1/50 | 0,00209 | 0,00143 | 0,00114 | 0,00105 | 0,00072 | 0,00051 | 0,00103 | 0,00036 |
| 1/100 | 0,00069 | 0,00015 | 0,00023 | 0,00043 | 0,00056 | 0,00100 | 0,00028 | 0,00056 |
| 1/200 | 0,00016 | 0,00009 | 0,00005 | 0,00054 | 0,00050 | 0,00213 | 0,00117 | 0,00059 |
| 1/400 | 0,00040 | 0,00047 | 0,00039 | 0,00002 | 0 | 0,00108 | 0,00007 | 0,00004 |
| 1/800 | 0,00034 | 0,00015 | 0,00017 | 0,00002 | 0,00015 | 0,00020 | 0,00029 | 0,00037 |
| 1/1600 | 0,00016 | 0,00005 | 0,00001 | 0,00002 | 0,00003 | 0,00039 | 0,00003 | 0,00003 |
| 1/3200 | 0,00013 | 0,00012 | 0,00001 | 0,00009 | 0,00004 | 0,00002 | 0,00002 | 0,00002 |
| * Representerar resultat från ett enda experiment. | ||||||||
Tabell 3: absolut kvantifiering och simulerad CI-beräkning.
| Villkor | Konkurrenskraftig index1 | |||||||
| Experiment 1 | ||||||||
| WTAA | WTAD | WTAG | WTAl | WTAo | WTvid | WTAW | WTAX | |
| Logaritmisk | 0,927 ± 0,033 | 0,992 ± 0,031 | 1,068 ± 0,025 | 0,921 ± 0,02 | 1,044 ± 0,03 | 1,051 ± 0,057 | 1,094 ± 0,027 | 0,929 ± 0,005 |
| Stationära | 1,1 ± 0,021 | 1,071 ± 0,053 | 1,079 ± 0,065 | 0,948 ± 0,02 | 0,98 ± 0,02 | 0,873 ± 0,044 | 0,97 ± 0,056 | 1,021 ± 0,007 |
| Experiment 2 | ||||||||
| CI (traditionell) | WTAA | ΔAAD | ΔBAl | ΔCvid | ΔABAG | ΔACAo | ΔBCAW | ΔABCAX |
| Logaritmisk | 1 ± 0 | 0,802 ± 0,084 | 0,957 ± 0,02 | 0,989 ± 0,073 | 0,581 ± 0,153 | 0,86 ± 0,053 | 0,995 ± 0,011 | 0,695 ± 0,061 |
| Stationära | 1 ± 0 | 0,97 ± 0,063 | 1,043 ± 0,058 | 0,99 ± 0,036 | 1,625 ± 0,589 | 0,835 ± 0,051 | 0,912 ± 0,047 | 0,477 ± 0,049 |
| CI (poolad Inoculum) | ||||||||
| Logaritmisk | 1,114 ± 0,039 | 0,864 ± 0,074 | 1,073 ± 0,032 | 1,1 ± 0,068 | 0,633 ± 0,152 | 0,938 ± 0,056 | 1,111 ± 0,043 | 0,746 ± 0,06 |
| Stationära | 1,078 ± 0,039 | 1,039 ± 0,049 | 1,166 ± 0,093 | 1,066 ± 0,01 | 1,735 ± 0,613 | 0,876 ± 0,035 | 0,97 ± 0,045 | 0,49 ± 0,047 |
| 1 Värden representerar medelvärdet CI ± standardavvikelsen för tre eller fyra replikat experiment. | ||||||||
Tabell 4: representativa resultat från in vitro-konkurrens mellan S. Typhimurium stammar.
Tabell S1. Valfria primers för att skapa ytterligare streckkod sekvenser och motsvarande fluorescerande sonder för deras detektering. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Figur 1. Generering av pSKAP. A) renat pKD13 utsattes för begränsning av matsmältningen med HindIII och BamHI. (B, C) Den 1 333 BP fragment av intresse som innehåller en FRT-flankerad kanamycin resistens gen renades. (D) ppcr script Cam sk + var också smält med hindiii och BamHI och fragment från pKD13 (B) var och ligaturer i att generera (E) pskap. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Insertional platsriktad mutagenes till pSKAP. (A) införandet av 25 BP DNA-streckkoder vid position 725 utfördes med hjälp av PCR. Framåtriktade och omvända primers som är specifika för den platsen utformades med komplementära 25-nukleotid 5 ' förlängningar (betecknade i primern som små bokstäver "a"). (B) en generisk pSKAP_Barcode plasmid till följd av SDM visas med placeringen av den infogade DNA-streckkoden markerade orange. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kromosom omordning nedströms Putp. (A) efter λ-röd medierad rekombination, den valbara kanamycin resistens genen (mörklila) flankerad av FRT platser (grå) sätts in på kromosomen mellan loci anges (kromosom rekombination plats, röd). Den unika DNA-streckkoden (orange) infogas precis utanför FRT-platsen. B) kanamycinresistensgenen avlägsnas genom FRT-medierad excision och lämnar en återstod av insatt DNA på kromosomen (totalt insatt DNA, blått) bestående av DNA-streckkoden och ett FRT-ärr. C) den modifierade kromosomala DNA-sekvensen som omger det införda DNA-värdet visas tillsammans med de förstärknings platser (ljuslila) som används för digital PCR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utspädningssystem för validering av fluorescerande sond känslighet och specificitet. A) renat gDNA från sju barkodade stammar blandas i lika mängder för att skapa spädningsvätskan för spädning av det utelämnade Barkodade GDNA (AX i exemplet ovan). B) utföra en seriell utspädning av det utelämnade Barkodade gDNA (AX i exemplet ovan) med hjälp av den beredda spädningsvätskan som beskrivits ovan. Blanda innehållet i varje tub noggrant innan du överför det till nästa tub. Figur 4 skapades med BioRender. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: plattlayout för analys av känslighet och specificitet hos primer-sond set 1 och 2. Det digitala PCR-experimentet omfattar NTCs, positiva kontroller, negativa kontroller och utspädnings scheman för var och en av de testade streckkoderna. Plattan för validering av primer-sond Set 3 och 4 är lagd i samma mönster med hjälp av lämplig barkodad gDNA. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa digitala PCR-resultat av utspädd AA-barkodad gDNA. gDNA som innehåller AA-streckkoden späddes i en bakgrund av alla andra barkodade gDNA enligt beskrivningen i figur 4. Kanal 1 representerar FAM-sonden för AA-streckkoden (övre paneler) medan kanal 2 representerar HEX-sonden för AO-streckkoden (botten paneler). Resultaten av varje sond presenteras som både enskilda dropp fluorescerande amplitud (vänster paneler) och ett histogram som representerar frekvensen av fluorescerande intensitet av alla droppar i de valda brunnarna (höger paneler). För varje tillstånd, positiva (hög fluorescens) och negativa (låg fluorescens) droppar bör bilda två distinkta populationer. När det gäller AA som var utspädd, och de flesta droppar var negativa, histogrammet (övre högra panelen) verkar bara skildra en enda population. Detta beror på att positiva droppar är betydligt större än de negativa dropparna. emellertid, två distinkta populationer är fortfarande synlig genom att undersöka dropp fluorescerande amplitud i de vänstra panelerna. Populationerna bör separeras med hjälp av tröskel funktionen för att definiera positiva och negativa droppar (visualiseras av den rosa linjen). Tröskelvärden varierar beroende på sonderna som användes, men alla brunnar som utnyttjar samma sond blandningen bör ha identiska tröskelvärden. Eftersom den AA-barkodade gDNA späddes, det finns en minskning av positiva (hög fluorescerande) droppar medan antalet positiva AO droppar förblir konstant i bakgrunden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att korrekt kvantifiera mikroorganismer är av största vikt för mikrobiologi forskning, och förmågan att räkna upp unika stammar från en initial blandad population har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för att bedöma fitness och virulens egenskaper i Bakterier. Men teknikerna för att åstadkomma detta har inte utvecklats i takt med den moderna utvecklingen inom molekylärbiologi. Tekniken för att enkelt modifiera kromosomerna hos många bakterier, inklusive S. Typhimurium, har varit tillgänglig för nästan två decennier14, men denna förmåga har sällan utnyttjas för molekylärt märkning stammar med unika DNA-sekvenser. Genom att utnyttja förmågan att skapa lätt identifierbara stammar baserade på unika, minimalt störande DNA-streckkoder insatta på bakterie kromosomen, tillsammans med den mest State-of-the-art teknik för att upptäcka och kvantifiera dessa molekylära identifierare ( dvs Digital PCR), har vi skapat ett system som ger utsökt känslighet, specificitet, noggrannhet och precision för att enkelt kvantifiera enskilda stammar inom en varierad population av bakterier.
Beräkna CIs och COIs som beskrivits ovan förlitar sig på förmågan att korrekt göra lämpliga modifieringar av bakteriella kromosomer. Alla modifieringar bör verifieras av sanger sekvensering för att säkerställa att inga slumpmässiga mutationer inträffade. Användningen av en High-Fidelity polymeras kommer att minimera dessa fel, men alla sådana mutationer som inträffar kommer att försämra förmågan att upptäcka stammen, vilket är en annan kritisk aspekt av detta protokoll. Även om vi har visat att digital PCR kan detektera så få som två gDNA-kopior i en bakgrund av nästan 2 000 000, kan stammar utanför detta intervall kräva ytterligare utspädningar för korrekt kvantifiering. Dessutom måste DNA-streckkodsekvenser utformas för att underlätta användningen av högkvalitativa sond sekvenser. Sond sekvenser bör analyseras för tendenser till själv-dimerize, form hårnålar, eller ineffektivt binda sina mål. Vikten av att använda kvalitetssekvenser och sonder kan inte minimaliseras, ett faktum som framgår av de noggranna validerings experiment som måste utföras med varje sond. Ansträngningar för att skapa optimala DNA-streckkoder kommer att skapa optimala digitala PCR-kvantifieringsresultat.
Även noggrant utformade molekylära taggar är viktiga för att uppnå kvalitetsresultat, tolka resultaten är en annan kritisk aspekt av detta protokoll. CI definieras som förhållandet mellan den muterade stammen och den vildtyp stammen i produktionen dividerat med förhållandet mellan de två stammarna i input1,19,20. Denna traditionella CI presenteras i avsnitt 9 är användbart när den blandade infektionen består av endast en stam kontra vildtyp. Men när du använder stora pooler av stammar att Inokulera media eller djur, stammar konkurrerar inte bara mot vildtyp, men också mot varje annan stam som finns i inoculum. Tidigare studier som utförde tävlings experiment med flera infekterar stammar har underlåtit att ta hänsyn till detta i sina beräkningar7,13. För att redogöra för denna funktion av blandade infektioner, har vi infört en formel för att beräkna CIs som har modifierats för poolade infektioner. Det är osannolikt att alla stammar kommer att ge samma nivå av konkurrens en vild typ stam skulle. Men eftersom de flesta bakteriella gener har liten inverkan på virulens, eftersom antalet stammar som används i konkurrenskraftiga index experiment ökar, sannolikheten för att den totala virulens tenderar mot Wild-typ stammen ökar. Detta kan inte nödvändigtvis vara fallet för vissa experimentella konstruktioner med hjälp av pooler av många stammar alla med kända virulensdefekter. Detta redovisas dock i den modifierade ekvationen eftersom mindre rikliga stammar (mindre passform) i resultatet kommer att ha en mindre effekt på X-utgång. Beroende på den specifika experimentella designen kan det finnas fall där den ena eller andra formeln är att föredra. I de flesta fall som involverar poolade infektioner, är det dock viktigt att tänka på att i en blandad infektion, alla stammar konkurrerar mot varandra, inte bara mot vildtyp. När du analyserar resultat är det viktigt att logiken bakom varje formel är väl förstådd för att göra de mest exakta tolkningar av stam kondition. Vid rapportering av resultat är det lika viktigt att noggrant redovisa hur data analyserades.
Avsnitt 9 i protokollet innehåller också formler för att hjälpa till att bestämma geninteraktioner med hjälp av en COI. Med denna analys kan förutsägelser göras för att avgöra om två virulensgener fungerar självständigt eller tillsammans. COI definieras som förhållandet mellan den dubbla muterade till enstaka Mutant stam i produktionen dividerat med förhållandet mellan de två stammarna i input1. Formeln är utformad för att detektera fenotypisk additivitet av gen störningar. Om gener fungerar oberoende för att förbättra virulens, bör en störning av båda gener orsaka en större minskning av konditionen jämfört med en enda störning av endera genen ensamt. Om gener fungerar tillsammans för att förbättra virulens (t. ex. gener som kodar två enzymer i en väg), bör en störning av endera genen ha samma effekt på virulens som att störa båda generna. Att detektera fenotypisk additivitet kan vara svårt i de fall där den försvagning som orsakas av en enda gen är antingen mycket hög eller mycket låg. En direkt jämförelse av stammar inom samma djur system ger dock mindre variation och en mer tillförlitlig redogörelse för det funktionella förhållandet mellan gener, och denna beräkning kan utföras från två stammar inom en större blandad population.
En slutlig kritisk aspekt för att tolka resultaten är att betrakta effekterna av populationsdynamik. I vissa blandade infektioner som har flera stammar, en enda stam kan uppstå som antingen mer dominerande eller mindre lämpade på grund av slumpmässig befolknings drift. Detta fenomen kan förstärkas när flaskhals händelser inträffar. Detta kan orsakas av att använda ett mycket stort antal ingångs stammar, ett mycket litet antal totala bakterier i inoculum, eller en kombination av båda. En annan störande aspekt som uppkommer genom blandade infektioner är möjligheten till en transkomplettering. Detta inträffar när en fit stam, såsom Wild-typ, artificiellt förbättrar virulens av en mindre passform stam. Ett hypotetiskt exempel på detta skulle vara att jämföra lämplighet för en S. Typhimurium patogenicitet Island 2 (SPI2)-knockout stam Co-infekterade med en vild-typ stam. SPI2 aktiverar S. Typhimurium att överleva intracellulärt genom att utsönta manipulatorer i värd Cytosol som modifierar phagosome inom en makrofage. Störningar i detta system gör S. Typhimurium mottagliga för intracellulära dödande. Men eftersom makrofager kan uppsluka två eller flera bakterier på en gång, SPI2-knockout kan få en avsevärd ökning av konditionen om det är bosatt i samma makrofager som en vild-typ S. Typhimurium som utsöndring effektorer i värd Cytosol. Slumpmässig populationsdynamik och möjligheten till transkomplettering är en begränsning av eventuella konkurrens experiment. Om det i transkomplementär misstänks bör fenotyper bekräftas med hjälp av andra kompletterande metoder för att bedöma konditionen. För att övervinna slumpmässig populationsdynamik ökar antalet replikerande experiment sannolikheten för att identifiera avvikare i resultaten. Lyckligtvis, det protokoll som beskrivs ovan gör det lättare att ha ett större antal identiska replikeringsexperiment eftersom antalet experimentella villkor drastiskt minskar.
En viktig del av den CI-teknik som beskrivs ovan är dess förmåga att anpassas till nästan vilken organism som helst och varje experimentell design som kräver noggrann kvantifiering av mikroorganismer. Det kräver dock genetisk manipulation av en organism för att införliva en unik DNA-sekvens på kromosomen. Teknikanternas anpassningsförmåga kräver att arten är genetiskt formbar och förlitar sig på generering av alternativa protokoll för modifiering av arvsmassan (steg 1 och 2). De DNA-streckkoderna som förtecknas i tabellerna 2 och S1 bör räcka till för de flesta bakterier. som i alla kvantitativa PCR-experiment är det dock relevant att analysera bakteriernas arvsmassa för att säkerställa minimal potential för off-Target-bindning av primrar och sonder genom en enkel BLAST-analys. DNA streckkod sekvenser som används i denna studie skiljer sig från endast 3-4 baser i vissa fall, belyser den utsökta specificiteten hos sonderna som minimerar risken för icke-specifik bindning. Oberoende av fluorescerande sonder specificitet, alla nya streckkod sekvenser måste vara lämpligt valideras för känslighet och specificitet som beskrivs i steg 6. Efter att ha skapat barkodade stammar, är det möjligt att anpassa detta protokoll till många typer av experiment förutom in vitro-konkurrensanalyser som beskrivs ovan. Stammarna är lämpliga för in vivo konkurrensanalyser i möss eller andra djurmodell system. Endast minimala modifieringar krävs för att extrahera gDNA från djurorgan och vävnader, och dessa modifieringar är väl beskrivna av tillverkare av byggsatser för sådana ändamål. Ytterligare, stora pooler av blandade infektioner för in vivo konkurrens har framgångsrikt utnyttjats tidigare7, erbjuder potential att minska antalet djur som behövs för ett enda experiment, som inte bara minskar kostnaderna för dessa experiment minskar också risken för variationer mellan djur och djur. På samma sätt kan barkodade stammar användas i andra in vitro -analyser som undersöker mottagligheten hos stammar för olika behandlingsförhållanden (t. ex. antibiotika, syra känslighet, dödande av reaktivt syre eller kväve arter, etc.). För dessa experiment, bedöma tillväxthämning kan uppnås genom att lägga till önskad kemikalie till odlingssubstrat i steg 3,4 och fortsätter enligt beskrivningen. För att bedöma bakteriell död, en stor pool av stammar kan blandas, och input kvantifieras som beskrivs ovan. Efter exponering för önskad behandling kan levande celler selektivt kvantifieras genom att koppla det digitala PCR-kvantifieringsförfarandet med genomförbarhet PCR för att skilja mellan levande och döda celler21,22,23 , 24 , 25 , 26. genomströmning för sådana experiment skulle ökas dramatiskt eftersom utspädningar och replika plattor för varje stam ersätts med mer strömlinjeformade molekylära tekniker. Slutligen, även om att analysera evolutionsbiologi och populationsgenetik är bortom omfattningen av detta papper, barkodade organismer är mycket anpassningsbar för sådana studier. I slutändan var syftet med detta protokoll att utveckla en kraftfull teknik för att kvantifiera bakterier som är mycket anpassningsbara för dess användning i många olika arter och i många typer av experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av George F. Haddix presidentens forskningsfond och National Institute of General Medical Science vid National Institutes of Health (NIH) under tilldelnings nummer GM103427. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
