Summary
Denne molekylære tilgang til bestemmelse af bakterie egnethed letter præcis og præcis påvisning af mikroorganismer ved hjælp af unikke genomiske DNA-stregkoder, der kvantificeres via Digital PCR. Protokollen beskriver beregningen af konkurrence indekset for salmonella stammer teknologien er dog let at tilpasse til protokoller, der kræver absolut kvantificering af enhver genetisk-formbare organisme.
Abstract
Et konkurrencepræget indeks er en almindelig metode, der anvendes til at vurdere bakteriel kondition og/eller virulens. Nytten af denne tilgang er eksemplificeret ved sin lethed at udføre og dens evne til at standardisere egnetheden af mange stammer til en vild-type organisme. Teknikken er imidlertid begrænset af tilgængelige fænotypiske markører og antallet af stammer, der kan vurderes samtidigt, hvilket skaber behov for et stort antal replikat eksperimenter. Samtidig med et stort antal eksperimenter er arbejds-og materialeomkostningerne ved kvantificering af bakterier baseret på fænotypiske markører ikke ubetydelige. For at overvinde disse negative aspekter, samtidig med at de positive aspekter bevares, har vi udviklet en molekyl baseret tilgang til direkte kvantificering af mikroorganismer efter ingeniør genetiske markører på bakterielle kromosomer. Unikke, 25 base pair DNA stregkoder blev indsat på en harmløs locus på kromosom af vilde-type og mutant stammer af salmonella. In vitro konkurrence eksperimenter blev udført ved hjælp af inocula bestående af poolede stammer. Efter konkurrencen blev det absolutte antal af hver stamme kvantificeret ved hjælp af digital PCR, og de konkurrencemæssige indekser for hver stamme blev beregnet ud fra disse værdier. Vores data indikerer, at denne tilgang til kvantificering af salmonella er ekstremt følsom, præcis og præcis til påvisning af både meget rigelige (høj kondition) og sjældne (lavt konditions) mikroorganismer. Desuden er denne teknik let kan tilpasses til næsten enhver organisme med kromosomer i stand til modifikation, samt til forskellige eksperimentelle design, der kræver absolut kvantificering af mikroorganismer.
Introduction
Vurdering af egnethed og virulens af patogene organismer er et grundlæggende aspekt af Mikrobiologi forskning. Det gør det muligt at foretage sammenligninger mellem stammer eller mellem muterede organismer, hvilket gør det muligt for forskerne at bestemme betydningen af visse gener under særlige forhold. Traditionelt, virulens vurdering anvender en dyremodel af infektion ved hjælp af forskellige bakteriestammer og observere resultatet af det inficerede dyr (f. eks infektiøs dosis50, dødelig dosis50, tid til døden, symptom sværhedsgrad, manglende symptomer osv.). Denne procedure giver værdifulde beskrivelser af virulens, men det kræver stammer til at forårsage betydelige forskelle i resultaterne for at opdage variationer fra vildtype. Desuden er resultaterne semi-kvantitative, fordi mens sygdomsprogression og symptom sværhedsgrad kan kvantificeres subjektivt over tid, er fortolkningen af virulens sammenlignet med vildtype mere kvalitativ (dvs. mere, mindre eller lige så virulent). Et fælles alternativ til at udføre dyre infektivitetsanalyser er at generere konkurrencebaserede indekser (CIs), værdier, der direkte sammenligner egnethed eller virulens af en stamme til en vildtype modpart i en blandet infektion1. Denne teknik har talrige fordele i forhold til en traditionel dyremodel af infektion ved at standardisere virulens til en vild-type stamme og bestemme en kvantificerbar værdi for at afspejle graden af dæmpning. Denne teknik kan også tilpasses til at analysere geninteraktioner i bakterier ved at bestemme en annulleret ud konkurrencedygtig indeks (COI)2. Ved at beregne en COI for en gruppe af muterede organismer kan forskerne afgøre, om to gener selvstændigt bidrager til patogenesen, eller om de er involveret i den samme virulens pathway og afhængige af hinanden. Derudover, beregning af en CI kræver opregning af bakterier, som kan give værdifuld indsigt i patogenesen af organismer. CIs og COIs giver også forskerne mulighed for at æde apulent stammer, der ikke forårsager klinisk sygdom, men stadig har forskelle i fitness. Denne teknik er begrænset af brugen af traditionelle antibiotikaresistensmarkører til at identificere stammer, og derved begrænse antallet af input stammer til kun en eller to ad gangen. På grund af denne begrænsning er der behov for et stort antal eksperimentelle grupper og replikater, hvilket ud over at tilføje til arbejdskraft-og materialeomkostninger også øger mulighederne for variation i eksperimentelle forhold og unøjagtige resultater. (For en grundig gennemgang af fordele og anvendelser ved at bruge blandede infektioner til at studere virulens, fitness, og gener interaktioner, Se C.R. Beuzón og D.W. Holden 1)
Der er gjort forsøg på at overvinde denne begrænsning, såsom brugen af fluorescently-mærkede celler kvantificeret via flowcytometri3,4,5. Denne teknik kvantificerer celler ved hjælp af enten 1) mærkede antistoffer mod fænotypiske markører eller 2) endogent producerede fluorescerende proteiner. Brugen af mærkede antistoffer har en grænse for påvisning af 1.000 celler/mL, og derfor kræver et stort antal celler til at analysere3. Celler, der udtrykker fluorescerende proteiner, har en ændret fysiologi og er modtagelige for konditions ændringer som følge af højt protein udtryk6. Begge metoder er begrænset af antallet af fluorescerende markører detekterbar ved hjælp af flow cytometri. En avancement i molekyl kvantificering blev opnået gennem udvikling af en mikroarray teknik, der detekterede dæmpning i 120 stammer fra en indledende blandet infektion på over 1.000 stammer i en murine model7. Denne teknik udnyttede en mikroarray analyse af RNA fra muterede stammer, hvilket fører til betydelig variation i resultatet. Ikke desto mindre fastslog den, at store puljer af blandede infektioner kan være et nyttigt redskab, og at der ved at anvende følsomme detekterings teknikker kan identificeres forskelle i bakteriel virulens. Med udviklingen af den næste generation sekvens, TN-SEQ udvidet nytten af gennemførelse af mutationer, muliggør en kraftfuld metode til kvantificering af bakterier, der blev tilfældigt muteret8,9,10, 11. En alternativ protokol blev for nylig udviklet, der eliminerer behovet for transposoner og i stedet bruger DNA stregkoder til lettere at identificere og spore genomændringer og deres indvirkning på fitness12. Denne teknologi er et stort fremskridt, men indsættelsen af de genomiske stregkoder er stadig en tilfældig proces. For at overvinde tilfældighed af tidligere eksperimenter, Yoon et al. udviklet en metode til at beregne CIs af salmonella stammer ved hjælp af unikke DNA stregkoder indsat på præcise steder på kromosomer af bakterier13. Unikke barkodede stammer blev detekteret ved hjælp af en qPCR-baseret metode med sybr grøn og primere specifikke for hver unik stregkode. Teknikken var begrænset af begrænsninger pålagt af qPCR, herunder forskelle i primer-effektivitet og lav følsomhed, hvilket fremgår af behovet for indlejret-PCR før qPCR. Ikke desto mindre viste denne tilgang, at målrettede genomændringer kunne udnyttes til påvisning og potentielt kvantificering af puljer af flere bakteriestammer.
I den følgende protokol beskriver vi en ny metode til at udføre bakterielle konkurrence eksperimenter med store puljer af blandet inocula efterfulgt af nøjagtig kvantificering ved hjælp af en meget følsom digital PCR-teknik. Protokollen indebærer genetisk mærkning bakteriestammer med en unik DNA-stregkode indsat på en uskadelige region af kromosom. Denne ændring gør det muligt at kvantificere stammer hurtigt og præcist ved hjælp af moderne Molekylær teknologi i stedet for traditionelle serielle fortyndinger, replika plating og tælle kolonidannende enheder, der er afhængige af fænotypiske markører (dvs. antibiotikaresistens ). Ændringerne giver mulighed for samtidig vurdering af mange stammer i et enkelt puljede inoculum, hvilket væsentligt reducerer muligheden for eksperimentel variabilitet, fordi alle stammer er udsat for nøjagtig samme betingelser. Desuden, mens denne teknik blev udviklet i Salmonella enterica blev typhimurium, det er meget tilpasningsdygtig til enhver genetisk formbar organisme og næsten enhver eksperimentel design, hvor nøjagtige bakterietal er påkrævet, hvilket giver en ny værktøj til at øge nøjagtighed og gennemløb i mikrobiologiske laboratorier uden begrænsninger pålagt af tidligere metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Indarbejd unikke DNA-stregkoder på et plasmid, der indeholder de nødvendige komponenter til Allelisk udveksling
Bemærk: En ny plasmid, ved navnet pskap, med et højt kopi nummer og øget transformation effektivitet i forhold til den eksisterende pKD13 alleliske Exchange plasmid blev skabt. Dette er beskrevet i trin 1.1-1.12 (figur 1). De færdige plasmider indeholdende unikke DNA stregkoder og komponenter til allelisk udveksling er tilgængelige via et plasmid repository (tabel over materialer).
- Ved hjælp af en kommerciel plasmid miniprep kit, rense pKD1314 og Ppcr script cam sk+ fra overnight bakterielle kulturer dyrket i Luria-bertani (lb) bouillon suppleret med 50 μg/ml kanamycin eller 25 μg/ml chloramphenicol (for PKD13 og ppcr script cam Henholdsvis SK +) (tabel 1).
- Udfør restriktions digestions på begge plasmid'er ved hjælp af kommercielle restriktionsenzymer HindIII og BamHI i henhold til producentens specifikationer.
- Fjern begrænsnings enzymer og fjernet DNA fra pPCR-scriptet cam SK+ -reaktionen, og rens 3.370-base pair (BP) plasmid-rygraden ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt DNA-oprydnings sæt i henhold til producentens specifikationer.
- Adskille fragmenter fra pKD13 begrænsning fordøjelsen på en 1% agopstået gel ved hjælp af en elektroforese kammer.
- Visualiser bands ved hjælp af en blå lys transilluminator og punkt 1.333 BP fragment fra gel (figur 1c).
Bemærk: Dette fragment indeholder det FRT-flankeret kanamycin-modstands-gen, der kræves til kromosomal allelisk udskiftning. - Rense det fjernede DNA fra trin 1,5 ved hjælp af et kommercielt gel ekstraktions udstyr.
- For at oprette pskap, ligere det rensede fragment fra pKD13 (fra trin 1,6) til ppcr script cam sk+ (fra trin 1,3) ved hjælp af en kommerciel T4 DNA ubiquitinligase i henhold til producentens specifikationer.
- Omdanne kemisk kompetente DH5α celler med det ligerede pSKAP plasmid efter producentens protokol (tabel 1).
- Spred transformanter på LB-agarplader suppleret med 50 μg/mL kanamycin og Inkuber ved 37 °C natten over.
- Vælg en koloni fra pladen og streak den på en ny LB agar plade suppleret med 50 μg/mL kanamycin og inkubere ved 37 °C natten over. Vælg en koloni fra denne plade og bruge til at inokulere LB bouillon suppleret med 50 μg/mL kanamycin. Inkubatér kulturen natten over ved 37 °C med konstant agitation.
- Brug et kommercielt plasmid miniprep-sæt til at rense pSKAP fra den overnattende bakteriekultur.
- Udfør en diagnostisk begrænsning fordøjelsen af plasmid fra trin 1,11 ved hjælp af Hind III og BAM HI i henhold til fabrikantens specifikationer. Visualiser fragmenter på en 1% agopstået gel som i trin 1.4-1.5.
Bemærk: Den samlede pSKAP-størrelse skal være 4.703 BP. fragmenter efter trin 1,12 skal være 3.370 og 1.333 BP. - Design PCR primere til indsættelse af site-instrueret mutagenese (SDM) (tabel 2 og S1) på en sådan måde, at der indsættes en unik 25-basepair-DNA-sekvens ved position 725 i pskap (figur 2).
Bemærk: Stregkode-DNA indsættes i plasmid lige uden for det FRT-flankeret kanamycin-modstands-gen, så stregkoden ikke går tabt under efterfølgende fjernelse af kanamycin-modstands kassetten. Hvis du genererer nye stregkode sekvenser, skal du bruge online værktøjer til at sikre, at de fluorescently-mærkede målspecifikke PCR-sonder (herefter blot kaldet "sonder") effektivt binder sig til den nye sekvens. Indsættelses sekvenser, der er konstrueret til dato, samt de nødvendige primere til at oprette dem, findes i tabel 2 og S1. - Forbered SDM-reaktioner ved hjælp af en kommerciel high-fidelity-DNA-Polymerase, de ønskede primer-par (tabel 2) og pSKAP-skabelon. Indstil termocycleren til at udføre følgende: 1) 98 °C for 30 s, 2) 98 °C for 10 s, 56 °C for 15 s, 72 °C i 2 min, 3) Gentag trin 2, 24 gange, 4) 72 °C i 5 min, 5) hold ved 4 °C.
- Efter færdiggørelse af PCR, nedbryder pskap skabelon ved at tilføje restriktions enzymet DPN I til reaktionen. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter.
Bemærk: Produkter fra PCR skal visualiseres på en agrose gel for at verificere produktets størrelse og renhed. En kontrol DPN I fordøjelse bestående af den umodificerede pSKAP skabelon kan udføres og anvendes i de efterfølgende trin for at sikre, at Template DNA er helt fordøjet. - Brug 5 μL af produktet fra trin 1,15 til at omdanne 100 μL kommercielt kemisk kompetente DH5α celler i henhold til fabrikantens anbefalinger.
- Spred transformanter på LB-agarplader suppleret med 25 μg/mL chloramphenicol og Inkuber ved 37 °C natten over.
- Vælg en koloni (eller kolonier) fra overnight plader og stribe på individuelle LB agar plader suppleret med 25 μg/mL chloramphenicol og inkubere ved 37 °C natten over. Vælg en koloni fra overnight plader og brug til at inokulere 5 mL LB bouillon suppleret med 25 μg/mL chloramphenicol. Inkuber kultur (er) natten over ved 37 °C med konstant agitation.
- Brug en kommerciel plasmid miniprep kit til at rense plasmider fra overnight kultur (r).
- Sanger sekvens rensede plasmid'er ved hjælp af M13 fremad sekventering primer (tabel 2). Sammenlign muterede region med den oprindelige plasmid og Vurder for SDM af nøjagtighed.
- Efter bekræftelse af stregkode indsættelse og nøjagtighed, tildele hver stregkode og plasmid et navn.
Bemærk: Stregkoder genereret til-dato er blevet tildelt en to bogstaver betegnelse: AA, AB, AC,..., BA, BB, BC, etc. Barcoded plasmider er betegnet som pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC,..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc. - Gentag trin 1.14-1.21 for at generere det ønskede antal DNA-stregkoder.
2. introducer DNA-stregkode på kromosom af S. Typhimurium
Bemærk: Indsættelse af DNA-stregkoder på S. Typhimurium kromosom opnås ved hjælp af en allelisk udvekslings metode beskrevet af Datsenko og Wanner14 , der er blevet modificeret til brug i S. Typhimurium.
- Bestem locus på S. Typhimurium genom til at indsætte DNA-stregkoden (figur 3).
Bemærk: Vælg en stor, InterGen region af kromosom. Undgå regioner, der producerer ikke-kodning RNA. Denne undersøgelse udnyttede en Locus nedstrøms for Put P mellem rester 1.213.840 og 1.213.861 (bestemt fra genom assembly gca_ 000022165.1). Denne region er tidligere blevet genmanipuleret med henblik på en Trans komplementering af gener15. Alternativt kan man indføre en DNA-stregkode, samtidig med at man forstyrrer et gen af interesse. Dette ville kræve minimale ændringer af denne protokol og strømline den mutante skabelse. - Design PCR primere at forstærke den unikke stregkode og FRT-flankeret kanamycin resistens gen fra det ønskede pskap stregkode-holdige plasmid fra trin 1,21 (tabel 2). Tilføj 40-nucleotid extensions, der er homologe til den region, valgt i trin 2,1 til 5 ' slutningen af hver primer (tabel 2).
- Udfør amplificeringen ved hjælp af en kommerciel high-fidelity polymerase, primere fra trin 2,2, og den ønskede pSKAP Barcode-holdige plasmid som skabelon. Indstil termocycleren til at udføre følgende: 1) 98 °C i 30 s, 2) 98 °C for 10 s, 3) 56 °C for 15 s, 4) 72 °C for 60 s, Gentag trin 2-4 29 gange, 5) 72 °C i 5 min, 6) hold ved 4 °C.
- Efter færdiggørelse af PCR, nedbryder Template DNA ved hjælp af DpnI som beskrevet i trin 1,15. Rense og koncentrere DNA ved hjælp af en kommerciel DNA oprydning kit i henhold til producentens specifikationer.
- Se den tidligere offentliggjorte protokol for generering af mutanter i S. Typhimurium stamme 14028s fra PCR-produkter14,16,17,18.
Bemærk: Det er ikke afgørende, at kanamycin resistens genet er fjernet fra kromosom. Men excision af genet er minimalt forstyrrende for bakteriernes kromosom, da det resulterer i en 129 BP Scar, der ville efterlade potentielle downstream gener i rammen. Det anbefales, at stammen, der indeholder kanamycin-resistens genet, bevares, da det kan bruges til at flytte stregkoder mellem stammer via P22-medieret transduktion. - Gentag trin 2,3 – 2,5 for at oprette de ønskede stammer med de relevante stregkoder.
Bemærk: Stregkoder kan indføres i Wild-type S. Typhimurium, der derefter kan blive udsat for yderligere genetisk manipulation, eller stregkoder kan indføres i stammer, der tidligere er genetisk ændret.
3. bakterielle vækstbetingelser og in vitro konkurrence assays
- Fra bakterier bestand, streak ønskede S. Typhimurium stammer, der hver havn en unik DNA stregkode på LB agar plader. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt koloni fra hver stamme og inokulere 5 mL LB bouillon. Inkuber i 20 timer ved 37 °C med konstant agitation.
Bemærk: Ved hjælp af overnight kultur, Fortsæt til trin 3,5 for at indsamle ren genomisk DNA (gDNA) fra hver Barcoded stamme. Dette er nødvendigt for efterfølgende validerings-og kontrol eksperimenter i afsnit 6. - For hver konkurrence analyse, overføre en tilsvarende mængde af hver overnight kultur i en passende størrelse sterile rør. Bland omhyggeligt stammer sammen ved at vortexning energisk i mindst 5 s.
Bemærk: Mængden af hver overnight kultur til overførsel bør være tilstrækkelig for hver betingelse og replikere, samt for at isolere gDNA at kvantificere input. Selv om det ikke er helt nødvendigt at måle de optiske tætheder af kulturer, fordi det absolutte antal af input mikroorganismer vil blive kvantificeret ved hjælp af digital PCR, bør antallet af input bakterier for hver stamme være omtrent lig med for at undgå flaskehalse eller ulige konkurrence tidligt i forsøget. Repræsentative konkurrence assays i denne protokol sammenlignede vækstrater på 8 stammer samtidig. Yderligere eller færre stammer kan være nødvendige for individuelle eksperimentelle design. - Overfør 100 μl af den blandede inokulum til 4,9 ml steril lb bouillon. Inkuber ved 37 °C i det ønskede tidsrum eller til den ønskede optiske tæthed.
- Høst 500 μl af inokulum ved centrifugering ved > 12000 x g i 1 min. Fjern og kassér supernatanten. Fortsæt straks til afsnit 4 med cellerne.
- På de ønskede tidspunkter fjernes 500 μL aliquoter af kultur og høst celler ved centrifugering ved > 12000 x g i 1 min. Fjern og kassér supernatanten.
Bemærk: Hvis du samler aliquoter ved flere tidspunkter, skal du fryse pellets ved-20 °C eller straks fortsætte til trin 4,1 efter hver samling.
4. indsamling og kvantificering af gDNA fra S. Typhimurium (fra trin 3,5 og 3,6)
- Høst gDNA fra celler ved hjælp af en kommerciel gDNA rensning kit. Hvis det er muligt, udføres det valgfrie RNA-udtynding trin.
Bemærk: RNA-nedbrydning er ikke nødvendig; men tilstedeværelsen af RNA vil kunstigt øge DNA-koncentrationen, hvilket fører til afvigende beregninger i de efterfølgende trin. Hvis du bruger et kommercielt gDNA-rensningsudstyr, skal du følge producentens anbefalinger for at sikre, at kolonnen ikke er overbelastet med DNA. Der kræves ingen mindste DNA-koncentration, hvis prøven er kvantificerbar i efterfølgende trin. - Brug et spektrofotometer til at kvantificere DNA i hver prøve.
Bemærk: DNA kan kvantificeres ved hjælp af en pålidelig metode. - Beregn gDNA kopi nummer baseret på den bakterielle genom størrelse ved hjælp af følgende ligning, hvor: X er mængden af DNA i ng og N er længden af et dobbeltstrenget DNA-molekyle (genomstørrelsen).
Bemærk: 660 g/mole anvendes som den gennemsnitlige masse af 1 DNA-BP. der kan forekomme små variationer afhængigt af organismens nukleotidsammensætning. Talrige regnemaskiner er tilgængelige online til at udføre beregningen.
5. design primere og sonder til kvantitativ påvisning af DNA-stregkoder via dDigital PCR
- Design primere til at forstærke den barkodede region af S. Kromosom nedstrøms for Putp (figur 3c og tabel 2).
Bemærk: Primer og Probe designs kan lettes ved talrige online-programmer (tabel over materialer). Hvis stregkoder er indsat på samme loci, er et enkelt sæt af forstærknings primere universel for alle stregkoder. - Design 6-carboxyfluorescein (FAM)-baserede og/eller hexachlorofluorescein (HEX)-baserede sonder, som er specifikke for hver stregkode (tabel 2 og S1).
Bemærk: Den dråbe læser, der bruges i dette eksperiment, er i stand til at detektere både FAM-og HEX-baserede sonder samtidig i en multiplex-reaktion. Design 1/2 af sonder at udnytte FAM og 1/2 at udnytte HEX. Dette er ikke et nødvendigt skridt, men vil reducere reagens anvendelsen og eksperimentelle omkostninger, hvis de gennemføres. - Lav 20x primer-Probe Master blandinger indeholdende 1) 20 mM af hver fremad-og tilbage forstærknings primer, 2) 10 mM af en enkelt FAM-sonde og 3) 10 mM af en enkelt HEX-sonde (hvis multiplexing).
6. Valider følsomheden og specificiteten af hvert Pprimer-Probe-sæt for hver genomisk stregkode ved hjælp af digital PCR
Bemærk: Denne protokol brugervalidering otte unikke stregkoder med otte unikke sonder som et eksempel. Antallet af stregkoder udnyttes kan øges eller reduceres til at rumme forskellige eksperimentelle designs.
- Opret en pulje af gDNA, der indeholder hver stregkode undtagen én. Brug denne pulje som fortyndingsmiddel til at udføre en fortyndings serie med gDNA, der indeholder den enkelte resterende stregkode (prøve fortyndings ordningen findes i figur 4).
Bemærk: Brug af poolet gDNA som fortyndingsmiddel sikrer en konsistent baggrund, samtidig med at følsomheden fastslår følsomhed. Ved hjælp af de kopierings numre, der er fastlagt i trin 4,3, fortyndes gDNA til et kopi nummer inden for det anbefalede digitale PCR-område (1-100000 kopier pr. 20 μL reaktion). Husk, at intervallet er indstillet for hvert unikt mål (stregkode), ikke den samlede gDNA. - Forbered reaktioner på digital PCR i duplikat i henhold til producentens anbefalinger til brug af en digital PCR Moda designet til Probe-baseret kemi. Brug blandingerne fra trin 6,1 som skabelon-DNA. Brug 20x primer-Probe Master Mix fra trin 5,3, der indeholder sonden til den fortyndede stregkode i trin 6,1.
- Forbered replikate kontrolreaktioner for digital PCR i henhold til producentens anbefalinger til brug af en digital PCR Moda designet til Probe-baseret kemi. Kontrolreaktioner for hver sonde blanding skal bestå af 1) ingen Template Controls (NTCs), 2) negative kontroller og 3) positive kontroller.
Bemærk: Det mindste antal replikat-kontrolreaktioner er to. I dette eksempel protokol bruges fire Ntc'er, seks negative kontrolelementer og seks positive kontrolelementer for hver stregkode. Negative kontroller skal indeholde gDNA med hver stregkode undtagen stregkoden svarende til den sonde, der testes. Dette vil validere specificiteten af hver sonde. - Gentag trin 6.1-6.3 for at oprette digitale PCR-reaktioner for hver enkelt Barcoded gDNA-prøve. En prøveplade arrangement er præsenteret i figur 5.
Bemærk: Dette og de efterfølgende trin beskrives ud fra en specifik digital PCR-platform, der udnytter dråber og flow baseret teknologi. Alternative digitale PCR-platforme, der udnytter chip baseret teknologi, kan nemt erstattes med mindre ændringer af denne protokol. Trin 6,4 kan kræve mere end 1 96-brønd plade for at validere alle primer sæt. I modsætning til qPCR kan separate plader, der analyseres ved digital PCR, let sammenlignes, uden at der er behov for standardiserede reference brønde mellem pladerne. - Generer dråber for hver reaktions tilstand ved hjælp af en dråbe generator i henhold til producentens anvisninger.
- Overfør nyligt oprettede dråber til den passende 96-brønd plade. Brug 200 μL pipettespidser på en 5-50 μL multikanals pipette.
Bemærk: Når du pipettering dråber, pipetter langsomt og jævnt! Producenten af det digitale PCR-udstyr anbefaler, at der kun anvendes pipetter og pipettespidser fra en bestemt fabrikant (f. eks. Ranin). Disse pipettespidser har en glat åbning uden mikroskopiske plastik fragmenter, der kan ødelægge dråber eller beskadige dråbe læsernes mikrofluidics. Talrige mærker af tips blev undersøgt og observeret for at have et spektrum af fremstillings kvalitet. Tilsvarende resultater er opnået ved hjælp af pipettespids alternativer; der bør dog udvises forsigtighed, når det afviger fra fabrikantens anbefalinger. - Efter at alle dråberne er blevet genereret og overført, forsegler du pladen med en folie plade sealer.
- Brug den af fabrikanten anbefalede termo cycler til at udføre følgende cykelforhold: 1) 94 °C i 10 min; 2) 94 °C i 1 min., rampe hastighed indstillet til 1 °C/s; 3) 55 °C i 2 min., rampe hastighed indstillet til 1 °C/s; 4) Gentag trin 2 og 3 49 gange; 5) 98 °C i 10 min; 6) hold ved 4 °C op til 24 timer.
Bemærk: Termisk overførsel i en dråbe reaktion er ikke det samme som standard PCR. Reaktions forholdene kan kræve ændringer. - Mens termo cykling udføres, programmere dataanalyse software med pladen setup oplysninger såsom prøve navn, eksperimenttype (absolut kvantificering), Moda anvendes, mål 1 navn (Fam stregkode navn), mål 1 type (NTC, positiv kontrol, negativ kontrol eller ukendt), mål 2-navn (HEX-stregkode navn), mål 2-type (blank, positiv kontrol, negativ kontrol eller ukendt). Oplysningerne om den endelige plade opsætning vises i figur 5.
- Når termo cykling er fuldført, skal du overføre de udfyldte reaktioner til dråbe læseren og starte læseprocessen i henhold til producentens anvisninger.
7. kvantificere antallet af bakterier i et konkurrencepræget indeks eksperiment
- GDNA fortyndes isoleret og kvantificeres fra afsnit 4 til en passende koncentration som beskrevet ovenfor.
- Forbered reaktioner på digital PCR i henhold til producentens anbefalinger til brug af den relevante supermix. Brug DNA fra trin 7,1 som skabelon. Brug en 20x primer-Probe Master Mix, der indeholder sonden (eller sonder, hvis detekterer både FAM og HEX) for mulige stregkoder til stede i forsøget.
- Forbered yderligere digitale PCR-reaktioner som i trin 7,2 ved hjælp af forskellige 20x primer-Probe Master blandinger, indtil alle stregkoder udnyttet i det eksperimentelle design kan påvises.
- Medtag kontrolelementer for hver betingelse som beskrevet i 6,3. Dette omfatter 1) ingen Template Controls (NTCs), 2) negative kontroller, og 3) positive kontroller.
- Fortsæt med protokollen som beskrevet i trin 6.5-6.10.
8. Analysér digitale PCR-data, og Beregn absolutte kopi numre
- Når alle brønde er læst, og kørslen er fuldført, skal du åbne. QLP-datafilen ved hjælp af dataanalyse softwaren.
Bemærk: De filtyper og dataanalyse procedurer, der er beskrevet her, er specifikke for én digital PCR-producent. Hvis du bruger alternative digitale PCR-platforme, vil filtyper og dataanalyse procedurer være specifikke for den anvendte platform og bør udføres i overensstemmelse med producentens anbefalede specifikationer. - Vælg alle brønde, der udnytter den samme primer-Probe Master mix.
- Under fanen dråber undersøges antallet af dråber, som analyseres i hver brønd (både positive og negative dråber). Udelukke fra analyse nogen brønd, der har færre end 10.000 samlede dråber.
- Flyt til 1d amplitude fanen og undersøge amplituden af positive og negative dråber. Sikre, at de omfatter to forskellige populationer.
- I softwaren skal du bruge funktionen tærskel til at foretage en cutoff mellem positive og negative dråber for hver sonde, der blev udnyttet (figur 6).
Bemærk: Alle brønde, der bruger den samme primer-Probe Master Mix fra trin 5,3, bør have de samme tærskler. - Når passende tærskler er blevet anvendt på alle brønde, vil softwaren beregne antallet af DNA-kopier i hver reaktion. Eksportere data til et regneark for at gøre det lettere at analysere.
Bemærk: Data Analysis software bruger antallet af positive og negative dråber, der er egnet til en Poisson fordeling til at bestemme kopi nummeret. - Ved hjælp af værdierne fra trin 8,6 beregnes det oprindelige kopi nummer for hver entydig genomisk-stregkode i eksemplet. Bestem den gennemsnitlige falsk positive hastighed fra de negative kontrolreaktioner, og træk denne værdi fra de værdier, som er opnået i eksperimentelle reaktioner. Multiplicer værdier som nødvendigt baseret på de fortyndinger, der blev udført ved opsætning af hvert eksperiment (tabel 3).
9. fastslå en organismes relative egnethed ved at beregne CI eller COI fra digital PCR-baseret kvantificering af Barkodede stammer
- Beregn CI for en barkodet stamme ved hjælp af følgende formler, hvor: enudgang er den absolutte kvantificering af den barkodede stamme på et givet tidspunkt, WT-output er den absolutte kvantificering af barkodede vildtype bakterier på samme tidspunkt, etinput er den absolutte kvantificering af inokulum af den barkodede stamme, WTinput er den absolutte kvantificering af input inokulum af barkodede vildtype bakterier, Xoutput er summen af alle stammer på det samme tidspunkt, Xinput er summen af den samlede input inokulum af alle barkodede stammer.
Bemærk: Se diskussionen om fordele, ulemper og den mest hensigtsmæssige brug af hver formel.
- Gentag trin 9,1 for hver Barcoded stamme på alle tidspunkter.
- Hvis det er relevant, beregnes COI ved hjælp af følgende formler, hvor: enudgang er den absolutte kvantificering af en barkodet stamme med muteret gen A på et givet tidspunkt, AB-udgang er den absolutte kvantificering af en barkodet stamme med muterede gener a og B på samme tidspunkt er etinput den absolutte kvantificering af inokulum af den barkodede stamme med muteret gen a, AB-indgang er den absolutte kvantificering af inokulum-inddata af barkodet stamme med muterede gener a og b, b-udgang er den absolutte kvantificering af en barkodet stamme med muteret gen B på et givet tidspunkt, og b-input er den absolutte kvantificering af input inokulum af den barkodede stamme med muteret gen B.
Eller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelsen af denne metode kræver, at der udføres passende kontrolreaktioner for at validere følsomheden og specificiteten af hver sonde, der anvendes til at identificere måldna. I dette repræsentative eksperiment validerede vi otte unikke DNA-stregkoder med de otte tilsvarende sonder til identifikation. Alle otte sonder havde en lav hyppighed af falske positiver i både NTC og negative kontrolreaktioner (tabel 3), hvilket fremhæver deres specificitet selv blandt meget lignende DNA-sekvenser. For at vurdere følsomheden af hver betingelse blev gDNA indeholdende en unik stregkode serielt fortyndet i en konstant baggrund af gDNA, der indeholdt hver af de syv resterende stregkode sekvenser. Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kunne digital PCR skelne så få som 2 eksemplarer af gDNA i en baggrund af næsten 2.000.000 lignende DNA-sekvenser (tabel 3).
Ud over at bestemme følsomheden og specificiteten af hver sonde og DNA-stregkode sekvens gjorde de fortyndinger, der blev udført i valideringsundersøgelsen, det muligt for os at beregne et simuleret konkurrencemæssigt indeks fra de resulterende data. Mens der ikke var nogen ægte input eller output for dette eksperiment, kan dataene analyseres, som om et konkurrence eksperiment er blevet udført. For at gøre dette, betragter vi hver blanding i den serielle fortynding som en udgang (enudgang) for den fortyndede stregkode, mens den samlede udgang (xudgang), input (Ainput), og den samlede indgang (xinput) af hver stamme beregnes fra kvantificering i de positive kontroller, hvor alle stregkoder er inkluderet. Ved anvendelse af fortyndingsfaktoren for hver blanding blev det teoretiske CI fastlagt og angivet i tabel 3. I hver af de fortyndingsserier, der blev udført for hver stregkode, rapporteres den gennemsnitlige simulerede CI sammen med standardafvigelserne for hver duplikeret fortyndings serie. I alle tilfælde svarer den simulerede CI, der blev beregnet, til det teoretiske CI. Størstedelen af de beregnede CIs afviger fra det teoretiske CIs med mindre end 25%. I tilfælde af lavere teoretiske CIs var afvigelsen af den beregnede værdi opad 2 gange. For eksempel, dette repræsenterede en ændring fra en teoretisk CI af 0,000625 til en beregnet CI af 0,001220. Disse data fremhæver, at den beskrevne metode er både meget præcis og meget præcis. Kombinationen af høj følsomhed, specificitet, nøjagtighed og præcision gør dette system i stand til pålideligt at detektere forskelle i egnethed, der ellers kan gå ubemærket hen.
Efter at have valideret, at genomiske stregkoder kunne påvises nøjagtigt og kvantificeres, udførte vi in vitro-konkurrence eksperimenter (tabel 4). Det første konkurrence eksperiment udnyttede otte vilde-type S. Typhimurium stammer, der hver indeholdt en unik DNA stregkode. Hver stamme blev dyrket natten over, og de otte kulturer blev blandet sammen i lige store mængder. 100 μl af denne blandede inokulum blev anvendt til at inokulere 4,9 ml steril lb-bouillon, og den resulterende kultur blev inkuberet ved 37 °c med konstant agitation. gDNA blev høstet fra inokulum for at beregne det nøjagtige input af hver stamme. Væksten i kulturen blev overvåget ved at måle absorbansen ved 600 nm (OD600). Ved OD600 = 0,5 (logaritmisk fase) blev der udtaget en prøve fra hver kultur, og gDNA blev høstet. Den resterende kultur blev returneret til 37 °C med konstant agitation indtil 8 timer efter inokulering, når en endelig prøve blev indsamlet og gDNA høstet (stationær). Resultaterne blev beregnet ved hjælp af den CI-formel, der blev modificeret til puljede infektioner. Som forventet havde alle vildtype-stammer CI-værdier, som var næsten lig med 1 (tabel 4). Et lignende konkurrence eksperiment blev udført med otte mutant S. Typhimurium stammer, der hver havde unikke stregkoder ud over en enkelt-, dobbelt-, eller tredobbelt-transketolase mangel18. Som vist tidligere, stammer alle voksede på samme måde i LB bouillon, med kun en lille lag observeret i Triple-transketolase-mangelfuld stamme. Men når væksten af hver stamme blev vurderet ved at analysere CI, en langt mere dybtgående defekt blev observeret for transketolase-mangelfuld stamme (CI blev sammenlignet med vækstkurver i Shaw et al.18). Desuden tillod dette eksperiment os at tildele en kvantificerbar værdi til hver stamme vækst karakteristika i stedet for blot kvalitativt at beskrive vækst mønstrene. CIs for hver stamme blev beregnet ved hjælp af både den traditionelle formel, hvor hver stamme kun blev sammenlignet med vildtype og den modificerede formel, hvor alle input stammer blev taget i betragtning. Mens ændringerne var små, var EF-erhvervsgrenen for den Triple-transketolase-utilstrækkelige stamme kunstigt lav i den traditionelle formel, fordi den ikke tegner sig for de andre seks konkurrerende stammer, der alle udstillet nær-vild-type fitness.
| Stammer | Genotype | Kilde eller reference |
| S. typhimurium ATCC 14028s | vild-type | Atcc |
| TT22236 | LT2 salmonella transporterer pTP2223 | 27 |
| DH5α | F– φ 80Laczδm15 Δ (LacZYA-ARGF) U169 RECa1 enda1 HSDR17 (rk–, mk+) PhoA supE44 λ– thi-1 GyrA96 rela1 | 28 |
| JAS18077 | Putp::AA:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18080 | Putp::ad:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18083 | Putp::AG:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18088 | Putp::al:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18091 | Putp::Ao:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18096 | Putp::at:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18099 | Putp::AW:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18100 | Putp::AX:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18122 | ΔTkta:: FRT Putp::ad:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18130 | ΔTktb:: FRT Putp::al:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18138 | ΔTktc:: FRT Putp::at:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18125 | ΔTkta:: FRT Δtktb:: FRT putp::AG:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18133 | ΔTkta:: FRT Δtktc:: FRT putp::Ao:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18141 | ΔTktb:: FRT Δtktc:: FRT putp::AW:: FRT | Denne undersøgelse |
| JAS18142 | ΔTkta:: FRT δTktb:: FRT δTktc:: FRT Putp::AX:: FRT | Denne undersøgelse |
| Plasmider | ||
| pKD13 | bla FRT Ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | 14 |
| pPCR script cam SK + | ColE1 ori; CmR | Stratgene/Aligent |
| pTP2223 | Plac lam bet EXO tetRasmussen | 16 |
| pCP20 | bla kat cI857 PRFLP pSC101 orits | 29 |
| pSKAP | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AA | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; AA | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AD | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; Ad | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AG | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; AG | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AL | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; Al | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AO | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; Ao | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AT | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; På The | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AW | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; AW | Denne undersøgelse |
| pSKAP_AX | ColE1 ori; CmR; bla FRT Ahp FRT; AX | Denne undersøgelse |
Tabel 1: stammer og plasmider anvendt i dette studie.
| Navn | Sekvens (5 '-3 ')1, 2, 3 |
| pSKAP SDM AA-F | Agaagtctcctgctggtgcttgagt CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AA-R | Har du et par CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AD-F | Aagagcacggtgaggtgatagtagg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AD-R | Cctactatcacctcaccgtgctctt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AG-F | Agtagtgtcctggaggagcatgtga CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AG-R | Tcacatgctcctccaggacactact CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL-F | Accacacatcgaaggcactagctct CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL-R | Agagctagtgccttcgatgtgtggt CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AO-F | Gtccacaaccacactcagtgatact CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AO-R | Agtatcactgagtgtggttgtggac CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM hos-F | Accagtgtccgtgacatggctagac CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM hos-R | Gtctagccatgtcacggacactggt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AW-F | Acgactgagtgatgtggatgtgacg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AW-R | Cgtcacatccacatcactcagtcgt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AX-F | Actatcgtggtgtaacgacaggctg CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AX-R | Cagcctgtcgttacaccacgatagt CTCAAGACGTGTAATGCTG |
| M13-F | GTAAAACGACGGCCAG |
| Putp Rekombination-F |
TAGCGATGGGAGAGAGGACACGTTAATTATTCCATTTTAA TGCAGCATTACACGTC |
| Putp Rekombination-R |
HAR du ikke mere end det, du har I det mindste? CCTGCAGTTCGAAGTTCC |
| qPCR stregkode region Amplify-F1 | TGCAGCATTACACGTCTTG |
| qPCR stregkode region Amplify-R2 | TAGGAACTTCGAAGCAGC |
| Stregkode AA Probe-FAM | 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGCTTGAGTC/IBFQ |
| Stregkode annonce sonde-FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ |
| Stregkode AG Probe-FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ |
| Stregkode AL Probe-FAM | 6-FAM/AGAGCTAGT/ZEN/GCCTTCGATGTGTGGTC/IBFQ |
| Stregkode AO Probe-HEX | HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGGTTGTGGACC/IBFQ |
| Stregkode ved Probe-HEX | HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
| Stregkode AW Probe-HEX | HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ |
| Stregkode AX sonde-HEX | HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ |
|
1 Understregede nukleotider indikerer komplementære sekvenser for hver DNA-stregkode, der indsættes på pSKAP efter SDM. 2 Dobbelte understregede nukleotider indikerer en komplementær region på S. Typhimurium kromosom anvendes til allelisk udskiftning. 3 Prime Time qPCR sonder er hybridiserings oligoer mærket med et 5 ' fluorescerende farvestof, enten 6-carboxyfluorescein (6-FAM) eller hexachlorofluorescein (HEX), en intern QUENCHER (ZEN) og 3 ' quencer Iowa Black® FQ (IBFQ). |
|
Tabel 2: primere og sonder anvendt i dette studie.
| Kvantificering (kopier/20μL reaktion) | ||||||||
| Beskrivelse | Aa | Ad | Ag | Al | Ao | På | Aw | Ax |
| Ntc | Nielsen | 0,000 | 0,000 | 3,510 | Nielsen | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 3,600 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 3,510 | 0,000 | 1,280 | 1,180 | 2,340 | 0,000 | 0,000 | 0,000 |
| Ntc | 2,290 | 0,000 | 0,000 | 1,200 | 1,150 | 1,160 | 0,000 | 0,000 |
| Mener | 3,133 | 0,000 | 0,320 | 1,473 | 1,163 | 0,290 | 0,000 | 0,000 |
| Negative | 5,130 | 1,156 | 0,000 | 1,124 | 3,745 | 1,281 | 7,354 | 7,142 |
| Negative | 5,270 | 0,000 | 0,000 | 1,087 | 1,666 | 1,643 | 7,746 | 2,269 |
| Negative | 2,660 | 0,000 | 1,361 | 1,451 | 8,974 | 0,000 | Nielsen | 0,000 |
| Negative | 6,090 | 0,000 | 0,000 | 2,251 | 0,000 | 2,531 | 8,700 | 3,495 |
| Negative | 1,740 | 0,000 | 1,086 | 2,130 | 4,171 | 0,000 | 7,113 | 5,522 |
| Negative | 6,220 | 3,581 | 0,000 | 4,022 | 1,175 | 1,341 | Nielsen | 5,950 |
| Mener | 4,518 | 0,789 | 0,408 | 2,011 | 3,288 | 1,133 | 7,728 | 4,063 |
| Positive | 22281,540 | 42673,039 | 46442,242 | 45359,180 | 47885,625 | 15708,027 | 45325,906 | 20810,559 |
| Positive | 23989,676 | 44625,523 | 47356,438 | 45790,660 | 47456,973 | 15096,601 | 47929,840 | 22455,234 |
| Positive | 17846,824 | 38980,133 | 45633,809 | 44174,820 | 33875,039 | 15156,063 | 42536,270 | 21467,840 |
| Positive | 21047,588 | 40140,848 | 41672,648 | 46028,496 | 47426,527 | 16718,000 | 46978,664 | 19876,473 |
| Positive | 20218,238 | 44660,602 | 41718,707 | 45799,375 | 46495,602 | 14590,264 | 54741,023 | 22011,938 |
| Positive | 18531,740 | 41620,801 | Nielsen | 48082,313 | 35645,199 | 15341,382 | 48950,992 | 21117,559 |
| Mener | 20652,601 | 42116,824 | 44564,769 | 45872,474 | 43130,827 | 15435,056 | 47743,783 | 21289,934 |
| Blank subtraktion | 20648,083 | 42116,035 | 44564,361 | 45870,463 | 43127,539 | 15433,923 | 47736,054 | 21285,871 |
| Ufortyndet A | 23024,961 | 44448,875 | 58897,510 | 51120,948 | 55450,191 | 18155,305 | 62844,068 | 27567,828 |
| Ufortyndet B | 18278,174 | 35252,586 | 54409,510 | 66022,396 | 43101,148 | 15732,609 | 60761,328 | 26581,979 |
| 1/50 A | 521,670 | 755,035 | 1066,898 | 1287,187 | 1053,339 | 181,324 | 1278,336 | 580,961 |
| 1/50 B | 435,326 | 634,215 | 1168,087 | 1383,537 | 991,040 | 165,443 | 1180,445 | 596,461 |
| 1/100 A | 228,028 | 598,848 | 603,911 | 631,116 | 507,956 | 258,405 | 665,647 | 331,590 |
| 1/100 B | 256,330 | 585,834 | 583,325 | 670,875 | 459,325 | 289,207 | 638,916 | 307,948 |
| 1/200 A | 121,283 | 305,293 | 258,247 | 346,965 | 234,774 | 114,163 | 169,055 | 172,553 |
| 1/200 B | 114,638 | 313,040 | 253,685 | 297,216 | 191,637 | 179,895 | 280,989 | 147,297 |
| 1/400 A | 42,829 | 141,343 | 127,337 | 163,605 | Nielsen | 71,241 | 157,697 | 85,976 |
| 1/400 B | 59,544 | 180,543 | 162,080 | 162,108 | 115,508 | 104,682 | 151,141 | 87,804 |
| 1/800 A | 34,304 | 67,934 | 65,939 | 83,857 | 66,134 | 31,784 | 82,722 | 45,616 |
| 1/800 B | 20,390 | 80,222 | 81,453 | 85,325 | 53,102 | 38,034 | 55,460 | 29,660 |
| 1/1600 A | 15,405 | 44,505 | 47,672 | 39,613 | 33,027 | 18,006 | 37,655 | 20,988 |
| 1/1600 B | 22,091 | 48,828 | 46,781 | 37,388 | 30,245 | 30,138 | 34,553 | 19,795 |
| 1/3200 A | 12,333 | 22,104 | 16,850 | 18,403 | 11,460 | 10,535 | 21,245 | 9,218 |
| 1/3200 B | 6,796 | 32,555 | 15,742 | 26,249 | 15,111 | 9,908 | 23,393 | 10,175 |
| Blank subtraktion | ||||||||
| Ufortyndet A | 23020,443 | 44448,086 | 58897,103 | 51118,937 | 55446,903 | 18154,172 | 62836,339 | 27563,765 |
| Ufortyndet B | 18273,655 | 35251,797 | 54409,103 | 66020,385 | 43097,860 | 15731,477 | 60753,600 | 26577,916 |
| 1/50 A | 517,152 | 754,246 | 1066,490 | 1285,176 | 1050,051 | 180,192 | 1270,607 | 576,898 |
| 1/50 B | 430,808 | 633,426 | 1167,679 | 1381,526 | 987,751 | 164,311 | 1172,717 | 592,398 |
| 1/100 A | 223,509 | 598,059 | 603,503 | 629,105 | 504,668 | 257,272 | 657,918 | 327,527 |
| 1/100 B | 251,812 | 585,044 | 582,918 | 668,864 | 456,036 | 288,074 | 631,187 | 303,885 |
| 1/200 A | 116,765 | 304,503 | 257,840 | 344,954 | 231,486 | 113,030 | 161,327 | 168,490 |
| 1/200 B | 110,120 | 312,251 | 253,277 | 295,205 | 188,348 | 178,762 | 273,261 | 143,234 |
| 1/400 A | 38,310 | 140,554 | 126,929 | 161,594 | Nielsen | 70,108 | 149,968 | 81,913 |
| 1/400 B | 55,026 | 179,753 | 161,672 | 160,097 | 112,219 | 103,549 | 143,413 | 83,741 |
| 1/800 A | 29,786 | 67,145 | 65,531 | 81,847 | 62,846 | 30,651 | 74,994 | 41,553 |
| 1/800 B | 15,872 | 79,433 | 81,045 | 83,314 | 49,813 | 36,901 | 47,732 | 25,596 |
| 1/1600 A | 10,886 | 43,716 | 47,264 | 37,602 | 29,739 | 16,874 | 29,927 | 16,925 |
| 1/1600 B | 17,573 | 48,039 | 46,373 | 35,377 | 26,957 | 29,005 | 26,825 | 15,732 |
| 1/3200 A | 7,815 | 21,314 | 16,442 | 16,392 | 8,172 | 9,402 | 13,517 | 5,155 |
| 1/3200 B | 2,278 | 31,765 | 15,334 | 24,238 | 11,822 | 8,776 | 15,664 | 6,112 |
| Simuleret CI | ||||||||
| Ufortyndet A | 1,114895 | 1,055372 | 1,321619 | 1,114419 | 1,285650 | 1,176251 | 1,316329 | 1,294932 |
| Ufortyndet B | 0,885005 | 0,837016 | 1,220911 | 1,439279 | 0,999312 | 1,019279 | 1,272698 | 1,248618 |
| 1/50 A | 0,025046 | 0,017909 | 0,023931 | 0,028018 | 0,024348 | 0,011675 | 0,026617 | 0,027102 |
| 1/50 B | 0,020864 | 0,015040 | 0,026202 | 0,030118 | 0,022903 | 0,010646 | 0,024567 | 0,027831 |
| 1/100 A | 0,010825 | 0,014200 | 0,013542 | 0,013715 | 0,011702 | 0,016669 | 0,013782 | 0,015387 |
| 1/100 B | 0,012195 | 0,013891 | 0,013080 | 0,014582 | 0,010574 | 0,018665 | 0,013222 | 0,014276 |
| 1/200 A | 0,005655 | 0,007230 | 0,005786 | 0,007520 | 0,005367 | 0,007323 | 0,003380 | 0,007916 |
| 1/200 B | 0,005333 | 0,007414 | 0,005683 | 0,006436 | 0,004367 | 0,011582 | 0,005724 | 0,006729 |
| 1/400 A | 0,001855 | 0,003337 | 0,002848 | 0,003523 | Nielsen | 0,004542 | 0,003142 | 0,003848 |
| 1/400 B | 0,002665 | 0,004268 | 0,003628 | 0,003490 | 0,002602 | 0,006709 | 0,003004 | 0,003934 |
| 1/800 A | 0,001443 | 0,001594 | 0,001470 | 0,001784 | 0,001457 | 0,001986 | 0,001571 | 0,001952 |
| 1/800 B | 0,000769 | 0,001886 | 0,001819 | 0,001816 | 0,001155 | 0,002391 | 0,001000 | 0,001203 |
| 1/1600 A | 0,000527 | 0,001038 | 0,001061 | 0,000820 | 0,000690 | 0,001093 | 0,000627 | 0,000795 |
| 1/1600 B | 0,000851 | 0,001141 | 0,001041 | 0,000771 | 0,000625 | 0,001879 | 0,000562 | 0,000739 |
| 1/3200 A | 0,000378 | 0,000506 | 0,000369 | 0,000357 | 0,000189 | 0,000609 | 0,000283 | 0,000242 |
| 1/3200 B | 0,000110 | 0,000754 | 0,000344 | 0,000528 | 0,000274 | 0,000569 | 0,000328 | 0,000287 |
| Gennemsnitlig CI (teoretisk) | ||||||||
| Ufortyndet (1) | 0,999950 | 0,946194 | 1,271265 | 1,276849 | 1,142481 | 1,097765 | 1,294514 | 1,271775 |
| 1/50 (0,02) | 0,022955 | 0,016474 | 0,025067 | 0,029068 | 0,023625 | 0,011161 | 0,025592 | 0,027466 |
| 1/100 (0,01) | 0,011510 | 0,014046 | 0,013311 | 0,014148 | 0,011138 | 0,017667 | 0,013502 | 0,014832 |
| 1/200 (0,005) | 0,005494 | 0,007322 | 0,005735 | 0,006978 | 0,004867 | 0,009453 | 0,004552 | 0,007322 |
| 1/400 (0,0025) | 0,002260 | 0,003803 | 0,003238 | 0,003507 | 0,00260 * | 0,005626 | 0,003073 | 0,003891 |
| 1/800 (0,00125) | 0,001106 | 0,001740 | 0,001645 | 0,001800 | 0,001306 | 0,002188 | 0,001285 | 0,001577 |
| 1/1600 (0,000625) | 0,000689 | 0,001089 | 0,001051 | 0,000795 | 0,000657 | 0,001486 | 0,000594 | 0,000767 |
| 1/3200 (0,000313) | 0,000244 | 0,000630 | 0,000357 | 0,000443 | 0,000232 | 0,000589 | 0,000306 | 0,000265 |
| Standardafvigelse | ||||||||
| Ufortyndet | 0,11494 | 0,10918 | 0,05035 | 0,16243 | 0,14317 | 0,07849 | 0,02182 | 0,02316 |
| 1/50 | 0,00209 | 0,00143 | 0,00114 | 0,00105 | 0,00072 | 0,00051 | 0,00103 | 0,00036 |
| 1/100 | 0,00069 | 0,00015 | 0,00023 | 0,00043 | 0,00056 | 0,00100 | 0,00028 | 0,00056 |
| 1/200 | 0,00016 | 0,00009 | 0,00005 | 0,00054 | 0,00050 | 0,00213 | 0,00117 | 0,00059 |
| 1/400 | 0,00040 | 0,00047 | 0,00039 | 0,00002 | 0 | 0,00108 | 0,00007 | 0,00004 |
| 1/800 | 0,00034 | 0,00015 | 0,00017 | 0,00002 | 0,00015 | 0,00020 | 0,00029 | 0,00037 |
| 1/1600 | 0,00016 | 0,00005 | 0,00001 | 0,00002 | 0,00003 | 0,00039 | 0,00003 | 0,00003 |
| 1/3200 | 0,00013 | 0,00012 | 0,00001 | 0,00009 | 0,00004 | 0,00002 | 0,00002 | 0,00002 |
| * Repræsenterer resultater fra et enkelt eksperiment. | ||||||||
Tabel 3: absolut kvantificering og simuleret CI-beregning.
| Betingelse | Konkurrencedygtigt indeks1 | |||||||
| Eksperiment 1 | ||||||||
| WTAA | WTad | WTAG | WTal | WTAo | WTpå | WTAW | WTAX | |
| Logaritmisk | 0,927 ± 0,033 | 0,992 ± 0,031 | 1,068 ± 0,025 | 0,921 ± 0,02 | 1,044 ± 0,03 | 1,051 ± 0,057 | 1,094 ± 0,027 | 0,929 ± 0,005 |
| Stationære | 1,1 ± 0,021 | 1,071 ± 0,053 | 1,079 ± 0,065 | 0,948 ± 0,02 | 0,98 ± 0,02 | 0,873 ± 0,044 | 0,97 ± 0,056 | 1,021 ± 0,007 |
| Eksperiment 2 | ||||||||
| CI (traditionelt) | WTAA | ΔAad | ΔBal | ΔCpå | ΔABAG | ΔACAo | ΔBCAW | ΔABCAX |
| Logaritmisk | 1 ± 0 | 0,802 ± 0,084 | 0,957 ± 0,02 | 0,989 ± 0,073 | 0,581 ± 0,153 | 0,86 ± 0,053 | 0,995 ± 0,011 | 0,695 ± 0,061 |
| Stationære | 1 ± 0 | 0,97 ± 0,063 | 1,043 ± 0,058 | 0,99 ± 0,036 | 1,625 ± 0,589 | 0,835 ± 0,051 | 0,912 ± 0,047 | 0,477 ± 0,049 |
| CI (poolede inoculum) | ||||||||
| Logaritmisk | 1,114 ± 0,039 | 0,864 ± 0,074 | 1,073 ± 0,032 | 1,1 ± 0,068 | 0,633 ± 0,152 | 0,938 ± 0,056 | 1,111 ± 0,043 | 0,746 ± 0,06 |
| Stationære | 1,078 ± 0,039 | 1,039 ± 0,049 | 1,166 ± 0,093 | 1,066 ± 0,01 | 1,735 ± 0,613 | 0,876 ± 0,035 | 0,97 ± 0,045 | 0,49 ± 0,047 |
| 1 Værdier repræsenterer den gennemsnitlige CI ± standardafvigelse for tre eller fire replikate eksperimenter. | ||||||||
Tabel 4: repræsentative resultater af in vitro-konkurrence mellem S. Typhimurium stammer.
Tabel S1. Valgfri primere til at skabe yderligere stregkode sekvenser og tilsvarende fluorescerende sonder til deres detektion. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Figur 1. Generering af pSKAP. A) renset pKD13 blev udsat for begrænsning af fordøjelsen med HindIII og bamhi. (B, C) 1.333 BP-fragmentet af interesse, der indeholder et FRT-flankeret kanamycin-resistens-gen, blev renset. (D) Ppcr script cam SK + blev også fordøjet med HindIII og bamhi, og fragmentet fra PKD13 (B) blev ligeret i at generere (E) pskap. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Indindsat site-instrueret mutagenese til pSKAP. A) indsættelse af 25 BP-DNA-stregkoder på position 725 blev udført med PCR. Frem-og tilbage-primere, der er specifikke for dette sted, er designet med komplementære 25-nucleotid 5 ' forlængelser (angivet i primer som små bogstaver "a"). (B) en generisk pSKAP_Barcode plasmid, der er resultatet af SDM, vises med placeringen af den indsatte DNA-stregkode fremhævet orange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kromosomal omorganisering nedstrøms for Putp. A) efteren-rød medieret rekombination indsættes det valgbar kanamycin-modstands gen (mørk lilla) flankeret af FRT-lokaliteter (grå) på kromosom mellem det angivne loci (kromosom Rekombinationsted, rød). Den unikke DNA-stregkode (orange) indsættes lige uden for FRT-stedet. B) kanamycin-modstands genet fjernes ved FRT-medieret excision, efterlader en rest af indsat DNA på kromosom (samlet indsat DNA, blå) bestående af DNA-stregkoden og et FRT-ar. C) den modificerede kromosomale DNA-sekvens, der omgiver det indsatte DNA, vises sammen med de forstærknings steder (lyse lilla), som anvendes til digital PCR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fortyndingssystem til validering af fluorescerende Probe følsomhed og specificitet. A) renset gDNA fra syv barkodede stammer blandes i lige store mængder for at skabe fortyndingsvæsken til fortynding af den udeladte Barkodede gDNA (AX i eksemplet ovenfor). (B) udføre en seriel fortynding af den udeladte Barcoded gDNA (AX i eksemplet ovenfor) ved hjælp af den tilberedte fortyndingsvæske, der er beskrevet tidligere. Bland indholdet af hvert rør grundigt, før det overføres til det næste rør. Figur 4 blev oprettet med BioRender. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: plade layout til analyse af følsomhed og specificitet af primer-Probe sæt 1 og 2. Det digitale PCR-eksperiment omfatter Ntc'er, positive kontroller, negative kontroller og fortyndings ordningerne for hver af de testede stregkoder. Pladen til validering af primer-Probe sæt 3 og 4 er lagt ud i samme mønster ved hjælp af den relevante Barcoded gDNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative digitale PCR resultater af fortyndet AA-Barcoded gDNA. gDNA, der indeholder AA-stregkoden, blev fortyndet i en baggrund af alle andre barkodede gDNA som beskrevet i figur 4. Channel 1 repræsenterer FAM-sonden for AA-stregkoden (øverste paneler), mens Channel 2 repræsenterer HEX-sonden for AO-stregkoden (nederste paneler). Resultaterne af hver sonde præsenteres som både individuelle dråbe fluorescerende amplitude (venstre paneler) og et histogram, der repræsenterer hyppigheden af fluorescerende intensitet af alle dråber i de valgte brønde (højre paneler). For hver betingelse, positive (høj fluorescens) og negative (lav fluorescens) dråber bør danne to særskilte populationer. I tilfælde af AA, der blev fortyndet, og de fleste dråber var negative, histogrammet (øverste højre panel) ser ud til kun at skildre en enkelt population. Dette skyldes, at positive dråber er væsentligt i undertal med negative dråber; Men, to forskellige populationer er stadig synlige ved at undersøge dråbe fluorescerende amplitude i venstre paneler. Populationerne skal adskilles ved hjælp af tærskel funktionen for at definere positive og negative dråber (visualiseret af den lyserøde linje). Tærskelværdierne vil variere afhængigt af de sensorer, der blev brugt, men alle brønde, der udnytter den samme sonde blanding, bør have identiske tærskler. Da AA-Barcoded gDNA blev fortyndet, er der et fald i positive (høj fluorescerende) dråber, mens antallet af positive AO dråber forbliver konstant i baggrunden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til præcist at kvantificere mikroorganismer er af afgørende betydning for Mikrobiologi forskning, og evnen til at optælle unikke stammer fra en indledende blandet befolkning har vist sig at være et uvurderligt værktøj til vurdering af egnethed og virulens træk i Bakterier. Men de teknikker til at opnå dette har ikke udviklet sig i takt med den moderne udvikling i molekylær biologi. Teknologien til nemt at ændre kromosomer af mange bakterier, herunder S. Typhimurium, har været tilgængelig i næsten to årtier14, men denne evne er blevet sjældent udnyttet til molekylært tagging stammer med unikke DNA-sekvenser. Ved at udnytte evnen til at skabe let identificerbare stammer baseret på unikke, minimalt forstyrrende DNA stregkoder indsat på det bakterielle kromosom, kombineret med den mest State-of-the-art teknologi til at opdage og kvantificere disse molekylære identifikatorer ( dvs. digital PCR), har vi skabt et system, der giver udsøgt følsomhed, specificitet, nøjagtighed og præcision for let at kvantificere individuelle stammer inden for en forskelligartet population af bakterier.
Beregning af CIs og COIs som beskrevet ovenfor afhænger af evnen til nøjagtigt at foretage de nødvendige ændringer af bakterielle kromosomer. Alle modifikationer skal verificeres af sanger sekvensering for at sikre, at der ikke forekom tilfældige mutationer. Brugen af en high-fidelity polymerase vil minimere disse fejl, men sådanne mutationer, der opstår, vil forringe evnen til at detektere stammen, hvilket er et andet kritisk aspekt af denne protokol. Selv om vi har vist, at Digital PCR kan detektere så få som to gDNA kopier i en baggrund på næsten 2.000.000, stammer uden for dette interval kan kræve yderligere fortyndinger for deres nøjagtige kvantificering. Desuden skal DNA-stregkode sekvenser være konstrueret til at lette brugen af sonde sekvenser af høj kvalitet. Sonde sekvenser bør analyseres for tendenser til selv-dimerize, danne Hårnåle, eller ineffektivt binde deres mål. Betydningen af at bruge kvalitet sekvenser og sonder kan ikke være minimaliseret, en kendsgerning, der er dokumenteret ved de omhyggelige validering eksperimenter, der skal udføres med hver sonde. Bestræbelserne på at skabe optimale DNA-stregkoder vil skabe optimale digitale PCR kvantificerings resultater.
Mens omhyggeligt designede molekylære Tags er vigtige for at opnå kvalitet resultater, fortolke resultaterne er et andet kritisk aspekt af denne protokol. EF-erhvervsgrenen defineres som forholdet mellem den mutante stamme og den vilde type stamme i produktionen divideret med forholdet mellem de to stammer i input1,19,20. Denne traditionelle CI præsenteret i afsnit 9 er nyttig, når den blandede infektion består af kun én stamme versus vildtype. Men, når du bruger store puljer af stammer til at inokulere medier eller dyr, stammer er ikke kun konkurrerer mod vild-type, men også mod enhver anden stamme til stede i inoculum. Tidligere undersøgelser, der udførte konkurrence eksperimenter med flere inficerende stammer, har undladt at tage hensyn til dette i deres beregninger7,13. For at gøre rede for denne funktion af blandede infektioner, har vi introduceret en formel til at beregne CIs, der er blevet ændret for poolede infektioner. Det er usandsynligt, at alle stammer vil give den samme grad af konkurrence en vild-type stamme ville. Men fordi de fleste bakterielle gener har ringe indvirkning på virulens, da antallet af stammer, der anvendes i konkurrencedygtige indeks eksperiment stiger, sandsynligheden for, at den samlede virulens vil tendens til at vild-type stamme stigninger. Dette kan ikke nødvendigvis være tilfældet for visse eksperimentelle design ved hjælp af puljer af mange stammer alle med kendte virulens defekter. Men, dette er tegnede sig for i den modificerede ligning, fordi mindre rigelige stammer (mindre pasform) i resultatet vil have en mindre effekt på Xoutput. Afhængigt af det specifikke eksperimentelle design kan der være tilfælde, hvor den ene eller den anden formel foretrækkes. I de fleste tilfælde involverer poolede infektioner, men det er vigtigt at overveje, at i en blandet infektion, alle stammer konkurrere mod hinanden, ikke bare mod vild-type. Når du analyserer resultater, er det afgørende, at rationalet bag hver formel er godt forstået at gøre de mest præcise fortolkninger af stammen fitness. Når du rapporterer resultater, er det lige så vigtigt præcist at oplyse, hvordan data blev analyseret.
Afsnit 9 i protokollen indeholder også formler til at hjælpe med at bestemme geninteraktioner ved hjælp af en COI. Med denne analyse kan der foretages forudsigelser for at afgøre, om to virulens gener opererer selvstændigt eller sammen. COI defineres som forholdet mellem dobbelt mutant og enkelt mutant stamme i produktionen divideret med forholdet mellem de to stammer i indgang1. Formlen er designet til at detektere fænotypisk afhængighed af genforstyrrelser. Hvis gener fungerer selvstændigt for at øge virulens, en forstyrrelse af begge gener bør forårsage et større fald i kondition sammenlignet med en enkelt forstyrrelse af enten genet alene. Hvis gener fungerer sammen for at forbedre virulens (såsom gener, der koder for to enzymer i en pathway), bør en afbrydelse af begge gener have samme virkning på virulens som at forstyrre begge generne. Påvisning af fænotypisk afhængighed kan være vanskeligt i tilfælde, hvor dæmpningsgraden forårsaget af et enkelt gen er enten meget høj eller meget lav. Ikke desto mindre giver direkte sammenligning af stammer inden for samme dyre system mindre variation og en mere pålidelig redegørelse for det funktionelle forhold mellem gener, og denne beregning kan udføres fra to stammer inden for en større blandet population.
Et endeligt kritisk aspekt ved fortolkningen af resultaterne er at overveje virkningerne af befolkningens dynamik. I nogle blandede infektioner, der har flere stammer, en enkelt stamme kan opstå som enten mere dominerende eller mindre pasform på grund af tilfældige befolknings drift. Dette fænomen kan forstærkes, når der indtræffer flaskehals hændelser. Dette kan være forårsaget af at bruge et meget stort antal input stammer, et meget lille antal af samlede bakterier i inoculum, eller en kombination af begge. Et andet forstyrrende aspekt, der opstår som følge af blandede infektioner, er muligheden for i Trans komplementaritet. Dette sker, når en pasform stamme, såsom vild-type, kunstigt øger virulens af en mindre pasform stamme. Et hypotetisk eksempel på dette ville være at sammenligne egnetheden af en S. Typhimurium patogenicitet ø 2 (SPI2)-knockout stamme Co-inficeret med en vild-type stamme. SPI2 aktiverer S. Typhimurium at overleve intracellulært ved at udskiller efftorer i værten cytosol, der ændrer phagosome inden for en makrofag. Afbrydelse af dette system gør S. Typhimurium modtagelig for intracellulære drab. Men fordi makrofager er i stand til at opsluge to eller flere bakterier på én gang, kan SPI2-knockout få en betydelig stigning i fitness, hvis det er bosat i samme makrofag som en vild-type S. Typhimurium, der udskiler efftorer i værten cytosol. Tilfældig populationsdynamik og muligheden for i Trans komplementaritet er en begrænsning af ethvert konkurrence eksperiment. Hvis der er mistanke om en Trans komplementation, skal fænotyper bekræftes ved hjælp af andre komplementære metoder til vurdering af egnethed. For at overvinde tilfældig populationsdynamik øger antallet af replikat eksperimenter sandsynligheden for at identificere outliers i resultater. Heldigvis gør den ovenfor beskrevne protokol det lettere at have et større antal identiske replikate eksperimenter, fordi antallet af forsøgsbetingelser reduceres drastisk.
Et centralt element i den ovenfor beskrevne CI-teknik er dens evne til at blive tilpasset til næsten enhver organisme og ethvert eksperimentelt design, der kræver nøjagtig kvantificering af mikroorganismer. Det kræver imidlertid genetisk manipulation af en organisme at indarbejde en unik DNA-sekvens på kromosom. Den tilpasningsevne af teknikken kræver, at arterne er genetisk-Malleable og vil basere sig på generation af alternative protokoller for ændring af genomet (trin 1 og 2). De DNA-stregkoder, der er anført i tabel 2 og S1 , bør være nok til de fleste bakterier. men som i alle kvantitative PCR-eksperimenter er det relevant at analysere det bakterielle genom for at sikre minimal mulighed for off-Target binding af primere og sonder ved en simpel blast analyse. De DNA-stregkode sekvenser, der anvendes i denne undersøgelse, afviger kun med 3-4 baser i nogle tilfælde, hvilket fremhæver den udsøgte specificitet af sonder, som minimerer potentialet for ikke-specifik binding. Uafhængigt af fluorescerende sonder specificitet skal alle nye stregkode sekvenser valideres behørigt for følsomhed og specificitet som beskrevet i trin 6. Efter at have skabt barkodede stammer, er det muligt at tilpasse denne protokol til mange typer af eksperimenter foruden in vitro konkurrence assays som beskrevet ovenfor. Stammerne er velegnede til in vivo-konkurrenceundersøgelser i mus eller andre dyremodel systemer. Kun minimale modifikationer er nødvendige for at udtrække gDNA fra dyreorganer og væv, og disse modifikationer er godt beskrevet af fabrikanter af kits til sådanne formål. Desuden er store puljer af blandede infektioner for in vivo-konkurrence blevet udnyttet tidligere7, hvilket giver mulighed for at reducere antallet af dyr, der er nødvendige for et enkelt eksperiment, hvilket ikke blot mindsker omkostningerne ved disse eksperimenter men mindsker også potentialet for dyre-til-dyr variabilitet. Tilsvarende kan barkodede stammer anvendes i andre in vitro -assays, der undersøger modtagelighed af stammer til forskellige behandlingsforhold (f. eks. antibiotika, syre følsomhed, drab med reaktiv ilt eller nitrogen arter osv.). For disse eksperimenter, vurdere væksthæmning kunne opnås ved at tilføje det ønskede kemikalie til vækstmediet i trin 3,4 og fortsætter som beskrevet. For at vurdere bakteriel død, en stor pulje af stammer kunne blandes, og input kvantificeret som beskrevet ovenfor. Efter udsættelse for den ønskede behandling kan levende celler kvantificeres selektivt ved at koble den digitale PCR-kvantificerings procedure med rentabilitets PCR til at skelne mellem levende og døde celler21,22,23 , 24 , 25 , 26. gennemløb for sådanne eksperimenter vil blive dramatisk forøget, fordi fortyndinger og replikateter for hver stamme erstattes af mere strømlinede molekylære teknikker. Endelig, selv om analysere evolutionær biologi og befolkning genetik er uden for rammerne af dette papir, barkodede organismer er meget tilpasningsdygtige til sådanne undersøgelser. I sidste ende var formålet med denne protokol at udvikle en stærk teknik til kvantificering af bakterier, der er meget tilpasningsdygtige til brug i mange forskellige arter og i mange typer eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af George F. Haddix præsidentens Fakultets forskningsfond og National Institute of General Medical Science af National Institutes of Health (NIH) under tildeling nummer GM103427. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
