Summary
Этот молекулярный подход для определения бактериальной пригодности облегчает точное и точное обнаружение микроорганизмов с помощью уникальных геномных штрих-кодов ДНК, которые количественно с помощью цифровых ПЦР. Протокол описывает расчет конкурентного индекса штаммов сальмонеллы; однако технология легко адаптируется к протоколам, требующим абсолютной количественной оценки любого генетически легкоподобимого организма.
Abstract
Конкурентный индекс является распространенным методом, используемым для оценки бактериальной пригодности и / или вирулентности. Полезность этого подхода иллюстрируется его легкостью выполнения и его способностью стандартизировать пригодность многих штаммов к организму дикого типа. Техника ограничена, однако, имеющимися фенотипическими маркерами и количеством штаммов, которые могут быть оценены одновременно, создавая необходимость в большом количестве повторных экспериментов. Параллельно с большим количеством экспериментов, затраты на проработку и материальные затраты на количественную оценку бактерий на основе фенотипических маркеров не являются незначительными. Чтобы преодолеть эти негативные аспекты, сохраняя при этом положительные аспекты, мы разработали молекулярный подход к непосредственной количественной оценке микроорганизмов после инженерных генетических маркеров на бактериальные хромосомы. Уникальные, 25 базовых пар ДНК штрих-коды были вставлены в безобидный локус на хромосоме дикого типа и мутант штаммов сальмонеллы. В пробирке были проведены эксперименты по проведению соревнований с использованием инокула, состоящего из объединенных штаммов. После проведения конкурса абсолютные цифры каждого штамма были количественно определены с помощью цифровых ПЦР, и из этих значений были рассчитаны конкурентоспособные индексы для каждого штамма. Наши данные показывают, что этот подход к количественной оценке сальмонеллы является чрезвычайно чувствительным, точным и точным для обнаружения как очень обильные (высокая пригодность) и редких (низкий фитнес) микроорганизмов. Кроме того, эта техника легко адаптируется практически к любому организму с хромосомами, способными к модификации, а также к различным экспериментальным конструкциям, которые требуют абсолютной количественной оценки микроорганизмов.
Introduction
Оценка пригодности и вирулентности патогенных организмов является фундаментальным аспектом микробиологических исследований. Это позволяет проводить сравнения между штаммами или между мутировавшими организмами, что позволяет исследователям определить важность определенных генов в определенных условиях. Традиционно, вирулентность оценка использует животных модель инфекции с использованием различных бактериальных штаммов и наблюдения за результатом инфицированного животного (например, инфекционная доза50, Смертельная доза50, время до смерти, тяжесть симптомов, отсутствие симптомы и т.д.). Эта процедура содержит ценные описания вирулентности, но она требует штаммов, чтобы вызвать значительные различия в результатах, с тем чтобы обнаружить отклонения от дикого типа. Кроме того, результаты являются полуколичественными, поскольку в то время как прогрессирование заболевания и тяжесть симптомов могут быть субъективно количественно с течением времени, интерпретация вирулентности по сравнению с диким типом является более качественной (т.е. больше, меньше или в равной степени вирулентным). Общей альтернативой для выполнения анализов инфекционной инфекции животных является создание конкурентоспособных индексов (CIs), значения, которые непосредственно сравнить фитнес или вирулентность штамма с диким типом аналога в смешанной инфекции1. Этот метод имеет многочисленные преимущества перед традиционной животной моделью инфекции путем стандартизации вирулентности к штамму дикого типа и определения количественной оценки, отражающей степень ослабления. Этот метод также может быть адаптирован для анализа взаимодействия генов в бактериях, определив отмененный конкурентный индекс (COI)2. Расчет COI для группы мутировавших организмов позволяет исследователям определить, независимо ли два гена способствуют патогенезу или если они участвуют в том же пути вирулентности и зависят друг от друга. Кроме того, расчет CI требует перечисления бактерий, которые могут обеспечить ценную информацию о патогенезе организмов. CIs и COIs также позволяют исследователям осла avirulent напряжения которые не причиняют клинические заболевания но все еще имеют разницы в пригодности. Этот метод ограничен использованием традиционных маркеров устойчивости к антибиотикам для выявления штаммов, тем самым ограничивая количество входных штаммов только одним или двумя за один раз. Из-за этого ограничения требуется большое количество экспериментальных групп и репликаций, что в дополнение к увеличению затрат на рабочую силу и материальные затраты, а также увеличивает возможности для изменчивости в экспериментальных условиях и неточных результатов. (Для тщательного анализа преимуществ и применений использования смешанных инфекций для изучения вирулентности, фитнеса и взаимодействия генов см. C.R. Beuzon и D.W. Holden 1)
Были предприняты попытки преодолеть это ограничение, такие как использование флуоресцентно помеченных клеток количественно через поток цитометрии3,4,5. Этот метод количественно клеток, использующих либо 1) помеченные антитела к фенотипическим маркерам или 2) эндогенно производства флуоресцентных белков. Использование помеченных антител имеет предел обнаружения 1000 клеток / мл, и поэтому требует большого количества клеток для анализа3. Клетки, выражающие флуоресцентные белки, имеют измененную физиологию ивосприимчивы к изменениям в фитнесе в результате высокой экспрессии белка 6. Оба метода ограничены количеством флуоресцентных маркеров, обнаруживаемых с помощью цитометрии потока. Прогресс в молекулярной количественной была достигнута за счет разработки метода microarray, которые обнаружили затусание в 120 штаммов от первоначальной смешанной инфекции более 1000 штаммов в модели мурин7. Этот метод использовал микроаррейный анализ РНК от мутировавших штаммов, которые приводят к значительной изменчивости в результате. Тем не менее она установила, что большие пулы смешанных инфекций могут быть полезным инструментом и что, используя чувствительные методы обнаружения, можно выявить различия в бактериальной вирулентности. С развитием последовательности следующего поколения, Tn-seq расширил полезность транспозонных мутаций, что позволило мощный метод для количественной оценки бактерий, которые были случайно мутировали8,9,10, 11. Альтернативный протокол был недавно разработан, что устраняет необходимость транспозонов и вместо этого использует ДНК штрих-коды для более легко гораздо выявления и отслеживания геномных изменений и их влияние на фитнес12. Эта технология является важным прогрессом, но вставка геномных штрих-кодов по-прежнему является случайным процессом. Чтобы преодолеть случайность предыдущих экспериментов, Yoon et al. разработали метод расчета CIs штаммов сальмонеллы с помощью уникальных штрих-кодов ДНК, вставленных в точных местах на хромосомых бактерий13. Уникальные штрих-кодированные штаммы были обнаружены с помощью метода на основе qPCR с зеленым цветом SYBR и грунтовками, специфичными для каждого уникального штрих-кода. Этот метод был ограничен ограничениями, налагаемыми qPCR, включая различия в эффективности праймера и низкую чувствительность, о чем свидетельствует необходимость вложенного ПЦР до qPCR. Тем не менее этот подход продемонстрировал, что целевые геномные изменения могут быть использованы для обнаружения и потенциально количественной оценки пулов многочисленных бактериальных штаммов.
В следующем протоколе мы описываем новую методологию для проведения экспериментов бактериальной конкуренции с большими пулами смешанных инокула, а затем точной количественной оценки с использованием высокочувствительной цифровой техники ПЦР. Протокол включает в себя генетически маркировки бактериальных штаммов с уникальным штрих-кодом ДНК вставляется на безобидной области хромосомы. Эта модификация позволяет быстро и точно количественно производить штаммы с использованием современных молекулярных технологий вместо традиционных серийных разбавлений, реплики покрытия и подсчета колоний, образующих единицы, которые полагаются на фенотипические маркеры (т.е. устойчивость к антибиотикам (т.е. устойчивость к антибиотикам ). Изменения позволяют одновременно оценивать многие штаммы в одном объединенном инокулуме, существенно уменьшая возможность экспериментальной изменчивости, поскольку все штаммы подвергаются точно таким же условиям. Кроме того, в то время как этот метод был разработан в Salmonella enterica serovar Typhimurium, он очень адаптируется к любой генетически податливый организм и почти любой экспериментальный дизайн, где точные бактериальные подсчеты необходимы, обеспечивая новый инструмент для повышения точности и пропускной их пропускной связи в микробиологических лабораториях без ограничений, налагаемых предыдущими методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Включите уникальные штрих-коды ДНК на плазмид, содержащий необходимые компоненты для аллелики Exchange
ПРИМЕЧАНИЕ: Был создан новый плазмид, названный pSKAP, с высоким числом копий и повышенной эффективностью преобразования по сравнению с существующим иаллеливой биржевой плазмидой pKD13. Это описано в шагах 1.1-1.12(рисунок1). Завершенные плазмиды, содержащие уникальные штрих-коды ДНК и компоненты для аллельного обмена, доступны через плазмидное хранилище(Таблицаматериалов).
- Используя коммерческий плазмидный мини-набор, очистите pKD1314 и pPCR Script Cam SK- от ночных бактериальных культур, выращенных в бульоне Лурия-Бертани (LB), дополненном 50 мкг/мл канамицином или 25 мкг/мл хлорамфениколом (для pKD13 и pPCR Script Cam СКЗ, соответственно)(Таблица 1).
- Выполняйте ограничения на обе плазмиды с использованием ферментов коммерческого ограничения HindIII и BamHI в соответствии со спецификациями производителя.
- Удалить ограничения ферментов и вырезанных ДНК из pPCR Сценарий Cam SK реакции и очистить 3370-базовый пара (bp) плазмид позвоночника с помощью коммерчески доступных ДНК очистки комплект в соответствии со спецификациями производителя.
- Отделить фрагменты от pKD13 ограничение пищеварения на 1% агарозный гель с помощью камеры электрофореза.
- Визуализируйте полосы с помощью синего светло-просветлятеля и выexcise 1,333 bp фрагмент из геля(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот фрагмент содержит ФРТ-фланговый ген канамицина, необходимый для хромосомной аллелевой замены. - Очистите вырезанную ДНК от шага 1.5 с помощью коммерческого комплекта для извлечения геля.
- Для создания pSKAP, сваить очищенный фрагмент из pKD13 (от шага 1.6) в pPCR Script Cam SK (от шага 1.3) с использованием коммерческой лиги T4 ДНК в соответствии со спецификациями производителя.
- Преобразуйте химически компетентные клетки DH5 с ligated плазмид pSKAP следуя протоколу производителя (таблица 1).
- Распространение трансформаторов на LB агар пластины дополнены 50 мкг /мл канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Выберите колонию из пластины и полоса его на новый LB агар пластины дополняется 50 мкг /мл канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. Выберите колонию из этой тарелки и использовать для привить LB бульон дополнен 50 мкг /мл канамицин. Инкубировать культуру на ночь при 37 градусах Цельсия при постоянном возбуждении.
- Используйте коммерческий плазмидный мини-комплект для очищения pSKAP от ночной бактериальной культуры.
- Выполните диагностическое ограничение пищеварения плазмида от шага 1.11 с использованием Hind III и Bam HI в соответствии со спецификациями производителя. Визуализируйте фрагменты на 1% агарозном геле, как в шагах 1.4-1.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий размер pSKAP должен сойти 4703 б.п. Фрагменты после шага 1.12 должны сойти 3370 и 1333 б.п. - Дизайн ПЦР праймеры для вставки сайта направлены мутагенез (SDM) (Таблица 2 и S1) таким образом, чтобы вставить уникальный 25-базовый последовательности ДНК в положении 725 pSKAP (Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК штрих-кода вставляется в плазмид недалеко от гена сопротивления канамицина, так что штрих-код не теряется при последующем удалении кассеты сопротивления канамицина. При генерации новых последовательностей штрих-кодов используйте онлайн-инструменты для обеспечения того, чтобы флуоресцентно помеченные целевые зонды ПЦР (далее называются просто "зондами") будут эффективно связываться с новой последовательностью. Последовательности вставки, разработанные на сегодняшний день, наряду с необходимыми грунтовками для их создания, предоставляются в таблицах 2 и S1. - Подготовка SDM реакции с использованием коммерческих высокой точности ДНК полимеразы, желаемых праймер пар (таблица 2), и шаблон pSKAP. Установите термоцикл, чтобы выполнить следующие: 1) 98 КС для 30 с, 2) 98 C для 10 с, 56 C для 15 с, 72 C для 2 мин, 3) повторить шаги 2, 24 раза, 4) 72 C для 5 мин, 5) держать при 4 c.
- После завершения PcR, истощать шаблон pSKAP, добавив ограничение фермента Dpn I к реакции. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты из ПЦР должны быть визуализированы на геле агарозы, чтобы проверить размер и чистоту продукта. Контроль Dpn I пищеварения, состоящий из неизмененного шаблона pSKAP может быть выполнен и использован в последующих шагах для обеспечения шаблона ДНК полностью усваивается. - Используйте 5 л продукта от шага 1.15 для преобразования 100 л коммерческих химически компетентных клеток DH5 в соответствии с рекомендациями производителя.
- Распространение трансформаторов на LB агар пластины дополнены 25 мкг /мЛ хлорамфеникол и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Выберите колонию (или колонии) из ночных пластин и полоску на отдельные пластины агара LB, дополненные 25 мкг/мл хлорамфениколом и инкубировать при 37 градусах Цельсия за одну ночь. Выберите колонию из ночных пластин и используйте для привить 5 мл бульона LB, дополненного 25 мкг/мл хлорамфениколом. Инкубировать культуры (ы) на ночь при 37 градусов по Цельсию с постоянным волнением.
- Используйте коммерческий плазмидный мини-набор для очистки плазмидов от ночной культуры (ы).
- Sanger последовательность очищенных плазмидов с помощью M13 Вперед секвенирования грунтовки (Таблица 2). Сравните мутировавший регион с исходной плазмидой и оцените точность вставки SDM.
- После подтверждения вставки штрих-кода и точности, назначить каждый штрих-код и плазмид имя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды, генерируемые на сегодняшний день были назначены два буквы обозначение: AA, AB, AC, ..., BA, BB, до н.э., и т.д. Баркодированные плазмиды обозначаются как pSKAP-AA, pSKAP-AB, pSKAP-AC, ..., pSKAP-BA, pSKAP-BB, pSKAP-BC и т.д. - Повторите шаги 1.14-1.21 для генерации нужного количества штрих-кодов ДНК.
2. Введите штрих-код ДНК на хромосому С. Типимуриум
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка штрих-кодов ДНК на S. Тифимурия хромосома достигается с помощью метода аллелики обмена, описанного Даценко и Ваннером14, который был модифицирован для использования в S. Тифимурий.
- Определите локус на С. Тифимурий геном, при котором вставить штрих-код ДНК(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите большую межгенную область хромосомы. Избегайте регионов, которые производят некодирующую РНК. В этом исследовании использовался локус вниз по течению от положенных P между остатками 1 213 840 и 1 213 861 (определяется из сборки генома GCA-000022165.1). Этот регион ранее был генетически манипулировать в транс-дополнения генов15. Кроме того, штрих-код ДНК может быть введен при одновременном нарушении гена интереса. Для этого потребуются минимальные изменения в этом протоколе и рационализация создания мутантов. - Дизайн ПЦР праймеры для усиления уникального штрих-кода и FRT-фланговые kanamycin сопротивление гена от желаемого pSKAP штрих-код-содержащих плазмид от шага 1.21 (Таблица 2). Добавьте 40 нуклеотидные расширения, которые являются гомологичными в регионе, выбранном в шаге 2.1 к концу 5' каждой грунтовой части (Таблица 2).
- Выполните усиление с использованием коммерческой полимеразы высокой точности, грунтовки от шага 2.2, и желаемого pSKAP штрих-кода, содержащего плазмид в качестве шаблона. Установите термоцикл для выполнения следующих: 1) 98 КС на 30 с, 2) 98 градусов по Цельсию для 10 с, 3) 56 градусов по Цельсию для 15 с, 4) 72 КС для 60 с, повторяющие шаги 2-4 29 раз, 5) 72 C на 5 мин, 6) удерживайте при 4 градусах по Цельсию.
- После завершения ПЦР, истощать шаблон ДНК с помощью DpnI, как описано в шаге 1.15. Очистите и сконцентрируйте ДНК с помощью коммерческого комплекта для очистки ДНК в соответствии со спецификациями производителя.
- Ссылайтесь на ранее опубликованный протокол для генерации мутантов в S. Тифимурий штамм 14028s из продуктов ПЦР14,16,17,18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно, чтобы ген сопротивления канамицину вырезали из хромосомы. Тем не менее, иссечение гена является минимально разрушительным для бактериальной хромосомы, как это приводит к 129 bp шрам, который оставит потенциальных вниз по течению генов в кадре. Рекомендуется, чтобы штамм, содержащий ген резистентности канамицина сохраняется, поскольку он может быть использован для перемещения штрих-кодов между штаммами через P22-опосредованную трансдукцию. - Повторите шаги 2.3 - 2.5 для создания желаемых штаммов с соответствующими штрих-кодами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды могут быть введены в дикий тип S. Тифимурий, который затем может быть подвергнут дальнейшим генетическим манипуляциям, или штрих-коды могут быть введены в штаммы, которые ранее были генетически изменены.
3. Условия роста бактерий и в пробирке конкурс ныесли
- Из бактерий запасов, полоса желаемого S. Typhimurium штаммов, что каждый гавани уникальный штрих-код ДНК на LB агар пластин. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Выберите одну колонию из каждого штамма и привить 5 мл бульона LB. Инкубировать в течение 20 ч при 37 градусах Цельсия при постоянном возбуждении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя ночную культуру, приступайте к шагу 3.5 для сбора чистой геномной ДНК (gDNA) с каждого штрих-кода штамма. Это необходимо для последующей проверки и контрольных экспериментов в разделе 6. - Для каждого конкурса анализ, передача равного объема каждой ночной культуры в соответствующих размеров стерильной трубки. Тщательно смешать штаммы вместе, вихревой энергично, по крайней мере 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем каждой ночной культуры для передачи должен быть достаточным для каждого состояния и репликации, а также для изоляции гДНК для количественной оценки входных средств. Хотя не совсем необходимо измерять оптическую плотность культур, поскольку абсолютное число входному микроорганизмов будет количественно оцениваться с помощью цифровых ПЦР, количество вхотливых бактерий для каждого штамма должно быть примерно равным, чтобы избежать узких мест или неравной конкуренции в начале эксперимента. Представительная конкуренция в этом протоколе сравнивала темпы роста на 8 штаммов одновременно. Дополнительные или меньше штаммов могут быть необходимы для отдельных экспериментальных конструкций. - Перенесите 100 л смешанного инокулума в стерильный бульон LB 4,9 мл. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в нужное время или до желаемой оптической плотности.
- Урожай 500 л инокулума путем центрифугирования на йgt;12,000 х г в течение 1 мин. Удалить и отбросить супернатант. Немедленно приступайке к разделу 4 с ячейками.
- В желаемые точки времени, удалить 500 qL aliquots культуры и сбора клеток центрифугирования на йgt; 12000 х г в течение 1 мин. Удалить и отказаться от супернатанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе aliquots в нескольких тайм-пойнтах, заморозить гранулы на -20 градусов по Цельсию или сразу же приступить к шагу 4.1 после каждой коллекции.
4. Сбор и количественная оценка gDNA от S. Тифимурий (от шагов 3.5 и 3.6)
- Урожай gDNA из клеток с помощью коммерческого комплекта очистки gDNA. При наличии, выполните факультативный шаг истощения РНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение РНК не является необходимым; однако наличие РНК искусственно увеличит концентрацию ДНК, что приведет к аномальным расчетам в последующих шагах. При использовании коммерческого комплекта очистки gDNA следуйте рекомендациям производителя, чтобы гарантировать, что столбец не перегружен ДНК. Минимальная концентрация ДНК не требуется, если образец поддается количественной оценке в последующих шагах. - Используйте спектрофотометр для количественной оценки ДНК в каждом образце.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно количественно обезопасить с помощью любого надежного метода. - Рассчитайте число копий gDNA на основе размера бактериального генома, используя следующее уравнение, где: X является количество ДНК в нг и N является длина двухцепочечной молекулы ДНК (размер генома).
ПРИМЕЧАНИЕ: 660 г/моль используется в качестве средней массы 1 ДНК bp. Небольшие вариации могут существовать в зависимости от состава нуклеотидов организма. Многочисленные калькуляторы доступны в Интернете для выполнения расчета.
5. Дизайн праймериз и зонды для количественного обнаружения ДНК штрих-кодов через dDigital PCR
- Дизайн грунтовки для усиления штрих-кодированной области S. Тифимурия хромосома вниз по течению putP (Рисунок 3C и Таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер и зонд конструкций может быть облегчено многочисленными онлайн-программ (Таблица материалов). Если штрих-коды вставляются в одни и те же локусы, то единый набор грунтовок усиления является универсальным для всех штрих-кодов. - Дизайн 6-carboxyfluorescein (FAM) на основе и / или hexachlorofluorescein (HEX) на основе зондов, специфичных для каждого штрих-кода (Таблица 2 и S1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель капель, используемых в этом эксперименте, способен обнаруживать как зонды на основе FAM, так и HEX одновременно в реакции мультиплекса. Дизайн 1/2 зондов для использования FAM и 1/2 для использования HEX. Это не является необходимым шагом, но сократит использование реагентов и экспериментальные затраты в случае их реализации. - Сделайте 20x грунтово-зонд мастер смеси, содержащие 1) 20 мм каждого вперед и обратное усиление грунтовки, 2) 10 мМ одного зонда FAM, и 3) 10 мм одного зонда HEX (если мультиплексирование).
6. Проверить чувствительность и специфику каждого Pprimer-зонд набор для каждого геномного штрих-кода с использованием цифровых ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует проверку восьми уникальных штрих-кодов с восемью уникальными зондами в качестве примера. Количество используемых штрих-кодов может быть увеличено или уменьшено с учетом различных экспериментальных конструкций.
- Создайте пул gDNA, который содержит все штрих-коды, кроме одного. Используйте этот пул в качестве разбавитель для выполнения серии разбавления с gDNA, содержащей один оставшийся штрих-код (схема разбавления образцов предусмотрена на рисунке 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование объединенной гДНК в качестве разбавитель обеспечивает согласованный фон при установлении чувствительности. Используя номера копий, определенные в шаге 4.3, разбавьте gDNA к номеру копии в пределах рекомендуемого цифрового диапазона ПЦР (1-100 000 копий на 20 qL реакции). Имейте в виду, что диапазон установлен для каждой уникальной цели (штрих-код), а не всего gDNA. - Подготовьте реакции для цифрового PCR в дублировать согласно рекомендациям производителя для использования цифрового supermix PCR конструированный для химии зонда-основанной. Используйте смеси со ступени 6.1 в качестве шаблона ДНК. Используйте 20x грунтовка-зонд мастер смесь от шага 5.3, который содержит зонд для разбавленного штрих-кода в шаге 6.1.
- Подготовьте реплика контрольные реакции для цифрового ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя по использованию цифрового супермикса ПЦР, предназначенного для химии на основе зонда. Контрольные реакции для каждого набора зонда должны состоять из 1) не шаблон управления (NTCs), 2) отрицательные элементы управления, и 3) положительные элементы управления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество реакций контроля репликации составляет два. В этом примере протокола используются четыре NTCs, шесть отрицательных элементов управления и шесть положительных элементов управления для каждого штрих-кода. Отрицательные элементы управления должны содержать gDNA с каждым штрих-кодом, за исключением штрих-кода, соответствующего тестируемому зонду. Это позволит проверить специфику каждого зонда. - Повторите шаги 6.1-6.3 для создания цифровых реакций ПЦР для каждого образца gDNA со штрих-кодом. Расположение образцовой пластины представлено на рисунке 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти и последующие шаги описаны на основе конкретной цифровой платформы ПЦР, которая использует капли и технологии на основе потока. Альтернативные цифровые платформы PCR, использующие технологию на основе чипов, могут быть легко заменены небольшими изменениями в этом протоколе. Шаг 6.4 может потребовать более одной пластины 96 колодцев для проверки всех наборов грунтовки. В отличие от qPCR, отдельные пластины, анализируемые цифровыми ПЦР, можно легко сравнить без необходимости в стандартизированных эталонных скважинах между пластинами. - Создавайте капли для каждого состояния реакции с помощью генератора капель в соответствии с инструкциями производителя.
- Перенесите вновь созданные капли в соответствующую 96-ну хорошую пластину. Используйте 200 наконечников пипетки на многоканальной трубе 5-50 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда труба капли, пипетка медленно и плавно! Производитель цифрового оборудования ПЦР рекомендует использовать только пипетки и пипетки от конкретного производителя (например, Ranin). Эти пипетки советы имеют гладкое отверстие без микроскопических пластиковых фрагментов, которые могут уничтожить капли или повредить микрофлюики считывателя капель. Многочисленные бренды советы были рассмотрены и наблюдается, чтобы иметь спектр качества производства. Эквивалентные результаты были достигнуты с помощью pipette отзыв альтернативы; однако при отклонении от рекомендаций производителя следует соблюдать осторожность. - После того, как все капли были сгенерированы и переданы, запечатать пластину с фольгой пластины герметик.
- Используйте рекомендованный производителем термоциклер для выполнения следующих условий езды на велосипеде: 1) 94 кв. м в течение 10 мин; 2) 94 КК в течение 1 мин, скорость рампы установлена на уровне 1 кв/с; 3) 55 кк с течением 2 мин, скорость рампы, установленная на уровне 1 кв.к/с; 4) повторные шаги 2 и 3 49 раз; 5) 98 кВ за 10 мин; 6) удерживайте при 4 градусах По цельсию до 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой перенос в реакции капли не то же самое, что стандартный ПЦР. Условия реакции могут потребовать изменения. - В то время как термоцикл выполняется, программа анализа данных программного обеспечения с информацией установки пластины, таких как название образца, тип эксперимента (абсолютная количественная), супермикс используется, целевой 1 имя (FAM штрих-код имя), целевой 1 тип (NTC, положительный контроль, отрицательный контроль, или неизвестно), целевой 2 имя (HEX штрих-код имя), целевой тип 2 (пустой, положительный контроль, отрицательный контроль, или неизвестно). Окончательная информация о настройке пластины отображается на рисунке 5.
- После того, как термоцикл завершен, передача завершенных реакций на считыватель капель и начать процесс чтения в соответствии с инструкциями производителя.
7. Количественная оценка количества бактерий в конкурентном эксперименте индекса
- Разбавленная гДНК изолирована и количественно от раздела 4 до соответствующей концентрации, как описано выше.
- Подготовьте реакции на цифровой ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя по использованию соответствующего супермикса. Используйте ДНК со ступени 7.1 в качестве шаблона. Используйте один 20x грунтового зонда мастер-микс, который содержит зонд (или зонды при обнаружении как FAM и HEX) для возможных штрих-кодов, присутствующих в эксперименте.
- Подготовьте дополнительные цифровые реакции ПЦР, как в шаге 7.2 с использованием различных 20x грунтового зонда мастер смеси, пока все штрих-коды, используемые в экспериментальной конструкции могут быть обнаружены.
- Включите элементы управления для каждого состояния, описанного в 6.3. Это включает в себя 1) не шаблон управления (NTCs), 2) отрицательные элементы управления, и 3) положительные элементы управления.
- Продолжить с протоколом, как описано в шагах 6.5-6.10.
8. Анализ цифровых данных ПЦР и вычислить абсолютные номера копий
- Когда все скважины будут прочитаны и запуск завершен, откройте файл данных .qlp с помощью программного обеспечения для анализа данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь типы файлов и процедуры анализа данных специфичны для одного цифрового производителя ПЦР. При использовании альтернативных цифровых платформ ПЦР типы файлов и процедуры анализа данных будут специфичны для используемой платформы и должны выполняться в соответствии с рекомендуемыми спецификациями производителя. - Выберите все скважины, которые используют тот же грунтовка-зонд мастер смеси.
- На вкладке капли, изучить количество капель, проанализированных в каждом колодце (как положительные, так и отрицательные капли). Исключить из анализа любой скважины, которая имеет менее 10000 всего капель.
- Перейдите на вкладку 1D Amplitude и изучите амплитуда положительных и отрицательных капель. Убедитесь, что они состоят из двух различных популяций.
- В рамках программного обеспечения, использовать функцию порога, чтобы сделать отсечение между положительными и отрицательными каплями для каждого зонда, который был использован (Рисунок 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все скважины, которые используют тот же грунтовка-зонд мастер смесь от шага 5.3 должны иметь те же пороги. - После того, как соответствующие пороги были применены ко всем скважинам, программное обеспечение будет вычислять количество копий ДНК в каждой реакции. Экспорт данных в электронную таблицу для облегчения дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа данных использует количество положительных и отрицательных капель, которые подходят для распределения Пуассона, чтобы определить номер копии. - Используя значения со ступени 8.6, вычислите исходное число копий каждого уникального геномного штрих-кода в образце. Определите средний ложноположительный показатель от отрицательных реакций контроля и вычесть это значение из значений, полученных в экспериментальных реакциях. Умножьте значения по мере необходимости на основе разбавлений, которые были выполнены при настройке каждого эксперимента(таблица 3).
9. Определить относительную пригодность организма путем вычисления CI или COI от цифровой ПЦР основе количественной оценки штрихкодированных штаммов
- Рассчитайте CI штрих-кодированного штамма, используя следующие формулы, где:Выход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма в данный момент времени, WTВыход является абсолютной количественной оценки штрихкодированных диких бактерий в то же время тайм-пойнт,Вход является абсолютным количественное значение входных inoculum штрих-кодированного штамма, WTвход является абсолютной количественной ввода ввода ввода ввода штрих-кодированных бактерий дикого типа, XВыход является суммирование всех штаммов на в то же время, XВвод является суммирование общего ввода inoculum всех штрихкодированных штаммов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ознакомьтесь с тем, что в ней рассматриваются преимущества, недостатки и наиболее подходящее использование каждой формулы.
- Повторите шаг 9.1 для каждого штрих-кода штамма во всех временных точках.
- Если это применимо, вычислить COI, используя следующие формулы, где:Выход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма с мутировавшим геном А в данный момент времени, ABВыход является абсолютной количественной оценки штрихкодированного штамма с мутировавшими генами A и B в то же время,Вход является абсолютной количественной входной инокум штрих-кода штамма с мутировавшим геном A, ABВход является абсолютной количественной входной ввода inoculum штрих-кодированного штамма с мутировавшими генами A и B,BВыход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма с мутировавшим геном B в заданную точку времени, и Ввход является абсолютной количественной оценки ввода инокулум штрих-кода штамма с мутировавшим геном B.
И/ИЛИ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование этой методологии требует, чтобы соответствующие контрольные реакции выполнялись для проверки чувствительности и специфичности каждого зонда, используемого для определения целевой ДНК. В этом репрезентативном эксперименте мы проверили восемь уникальных штрих-кодов ДНК с восемью соответствующими зондами для идентификации. Все восемь зондов имели низкую скорость ложных срабатываний как в NTC, так и в отрицательных контрольных реакциях(таблица3), подчеркивая их специфику даже среди очень похожих последовательностей ДНК. Для оценки чувствительности каждого состояния, gDNA, содержащий уникальный штрих-код, был последовательно разбавлен на постоянном фоне гДНК, содержащей каждую из семи оставшихся последовательностей штрих-кода. При подходе, изложенном выше, цифровой ПЦР может различать всего лишь 2 копии гДНК на фоне почти 2,000,000 аналогичных последовательностей ДНК (Таблица 3).
В дополнение к определению чувствительности и специфичности каждого зонда и последовательности штрих-кодов ДНК, разбавления, выполненные в исследовании проверки, позволили нам вычислить смоделированный конкурентный индекс из полученных данных. Хотя в этом эксперименте не было достоверного ввода или вывода, данные можно проанализировать так, как будто был проведен эксперимент по конкуренции. Для этого мы рассматриваем каждую смесь в последовательном разбавлении как выход (выход) для разбавленногоштрих-кода, в то время как общий выход (XВыход),вход (входный вход), и общий вход (XВвод) каждого штамма рассчитывается от количественная оценка в положительных элементах управления, где включены все штрих-коды. Используя фактор разбавления для каждой смеси, теоретический CI был определен и сообщается в таблице 3. В каждой из серий разбавления, которая была выполнена для каждого штрих-кода, сообщается о среднем моделируемом CI наряду со стандартными отклонениями для каждой серии дубликата. Во всех случаях вычисленный СИ похож на теоретический CI. Большинство расчетных CIs отклоняются от теоретических CIs менее чем на 25%. В случаях более низких теоретических CIs отклонение расчетного значения было свыше 2 раза. Например, это представляло собой изменение от теоретической CI 0.000625 к расчетливому CI 0.001220. Эти данные подчеркивают, что описанный метод является высокоточным и высокоточным. Сочетание высокой чувствительности, специфичности, точности и точности позволяет этой системе надежно обнаруживать различия в пригодности, которые в противном случае могут остаться незамеченными.
После проверки, что геномные штрих-коды могут быть точно обнаружены и количественно, мы выполнили эксперименты в пробирке конкуренции (Таблица 4). В первом соревновательном эксперименте было использовано восемь диких S. Typhimurium штаммов, каждый из которых содержал уникальный штрих-код ДНК. Каждый штамм был выращен в одночасье, и восемь культур были смешаны вместе в равных количествах. 100 зЛ этого смешанного инокулума был использован для прививки 4,9 мл стерильного бульона LB и в результате культуры был инкубирован при 37 градусов по Цельсию с постоянным возбуждением. gDNA был собран из инокулума для расчета точного ввода каждого штамма. Рост культуры контролировался путем измерения абсорбции на уровне 600 нм (OD600). При OD600 и 0,5 (логарифмическая фаза) был собран образец из каждой культуры и гДНК был собран. Оставшаяся культура была возвращена до 37 градусов с постоянным возбуждением до 8 часов после прививки, когда окончательный образец был собран и gDNA собраны (стационарные). Результаты были рассчитаны с использованием формулы CI, измененной для объединенных инфекций. Как и ожидалось, все штаммы дикого типа имели значения CI, почти равные 1(таблица 4). Аналогичный конкурсный эксперимент был проведен с использованием восьми мутантов S. Typhimurium штаммов, что каждый из них имел уникальные штрих-коды в дополнение к одной-, двойной, или тройной транскетолазы дефицит18. Как показано ранее, штаммы все выросли аналогичным образом в бульоне LB, с небольшим отставанием наблюдается в тройной транскетолазы дефицит штамма. Однако, когда рост каждого штамма был оценен путем анализа CI, гораздо более глубокий дефект наблюдался для транскетолазы дефицит штамма (CI был по сравнению с кривыми роста в Шоу и др.18). Кроме того, этот эксперимент позволил нам присвоить количественную ценность характеристикам роста каждого штамма, а не просто качественно описывать модели роста. ИК для каждого штамма были рассчитаны как с использованием традиционной формулы, где каждый штамм был только по сравнению с диким типом и измененной формулы, где все входные штаммы были рассмотрены. Хотя изменения были небольшими, CI тройной транскетолазы дефицит штамма был искусственно низким в традиционной формуле, поскольку он не учитывает другие шесть конкурирующих штаммов, которые все выставлены почти дикий тип фитнеса.
| Штаммов | Генотип | Источник или ссылка |
| С. Типимуриум ATCC 14028s | дикий тип | АТС |
| TT22236 | LT2 Сальмонелла проведения pTP2223 | (27) |
| DH5 " | F- 80лакаNoM15 (лак ЗаА-арг F)U169 recA1 конецA1 hsdR17 (rK-, мK) phoA supE44-thi-1 gyrA96 relA1 | (28) |
| JAS18077 | putP::AA::FRT | Это исследование |
| JAS18080 | putP::AD::FRT | Это исследование |
| JAS18083 | putP::AG::FRT | Это исследование |
| JAS18088 | putP::AL::FRT | Это исследование |
| JAS18091 | putP::АО::FRT | Это исследование |
| JAS18096 | putP::AT::FRT | Это исследование |
| JAS18099 | putP::AW::FRT | Это исследование |
| JAS18100 | putP::AX::FRT | Это исследование |
| JAS18122 | tktA::FRT putP::AD::FRT | Это исследование |
| JAS18130 | tktB::FRT putP::AL::FRT | Это исследование |
| JAS18138 | tktC::FRT putP::AT::FRT | Это исследование |
| JAS18125 | tktA::FRTи tktB::FRT putP::AG::FRT | Это исследование |
| JAS18133 | tktA::FRT -tktC::FRT putP::AO::FRT | Это исследование |
| JAS18141 | tktB::FRT йtktC::FRT putP::AW::FRT | Это исследование |
| JAS18142 | tktA::FRT -tktB::FRT -tktC::FRT putP::AX::FRT | Это исследование |
| Плазмиды | ||
| pKD13 | бла FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) |
| pPCR Скрипт Кэм СКЗ | ColE1 ori; CmR | Стратаген/Алиджент |
| pTP2223 | Plac lam ставка экзо тетR | (16) |
| pCP20 | bla cat cI857 PRflp pSC101 oriTS | (29) (29) |
| pSKAP | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT | Это исследование |
| pSKAP-AA | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; А. А. | Это исследование |
| пСКАПЗАД | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; АД | Это исследование |
| пСКАПЗАГ | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; AG | Это исследование |
| пСКАП-АЛ | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; AL | Это исследование |
| pSKAP-AO | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; АО | Это исследование |
| pSKAP-AT | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; В | Это исследование |
| pSKAP-AW | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; AW | Это исследование |
| pSKAP-AX | ColE1 ori; CmR; бла FRT ahp FRT; ТОПОР | Это исследование |
Таблица 1: Штаммы и плазмиды, используемые в данном исследовании.
| Имя | Последовательность (5' - 3')1,2,3 |
| pSKAP SDM AA - F | АГААГТЦТКТГТГТТТГАГТ CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AA - R | ACTCAAGCAGCAGGAGACTTCT CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AD - F | ААГАГКЭГГГАГТАГАГАГАГАГАГАГАГАГХАГЕГгАГ CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AD - R | ККТАКАТТАЦКККККККГТКТКТКТКТТТТТТТТ CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AG - F | АГТАГТГТЦТГАГГАГКАТГГА CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AG - R | TCACATGCTCCTCCAGGACACT CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - F | ACCACACATCGAAGGКАКККККТ CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - R | АГАГКТГКККГКАТГГГГГГГГГГГТГТГТ CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AO - F | ГТКАКАКАККАКТАГТАСТГАТАКТ CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AO - R | АГТАТТАКАКТАГТГГТГТГГГГГГГГГАКК CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AT - F | ACCAGTGTGTGTGACATGGGGCTAGAC CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AT - R | GTCTAGCCATGTКАКАКЕФКАКТГГТ CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AW - F | АКГАКТАГГАТГГГГГГГГГАКГГКГКГ CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AW - R | CGTCACATCCACATCACTCAGTCGCGT CTCAAGGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AX - F | ACTATCGTGGTAACGACAGGCTG CGATTGTGTAGGGGAGC |
| pSKAP SDM AX - R | CAGCCTCGTTACACCGATAGT CTCAAGGTGTAATGCTG |
| M13 - F | GTAAACGACGGCCAG |
| putP Рекомбинация - F |
ТАГГГАТГАГАГАГАГАГАГАГАКАТТАТТАТТЦТАТТАТАТА TGCAGCATTACACGTC |
| putP Рекомбинация - R |
TACTGCGTATTAATGCGAACATCCATAACCCATTG CCTGCAGTTCGAGTTCC |
| QPCR Баркод Региона Усиление - F1 | TGCAGCATTACACGTCTTG |
| Увлажняй область штрих-кодов qPCR - R2 | ТАГГААКТТКГААГКАГКК |
| Зонд Barcode AA - FAM | 6-FAM/AGAAGTCTC/ЗЕН/КТГКТГАГТГАГТХТХТХТХТХТХТХТХТХТХТХТХТЧо/IBF |
| Зонд штрих-кода AD - FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/ЗЕН/ГтгагтГАТАГАГАГАГАГАГГАГК/IBF |
| Зонд Barcode AG - FAM | 6-ФАМ/АГТАГТГТКТК/ЗЕН/КТГгАГАГАККАТГГАКК/ИБФЗ |
| Баркод AL зонд - FAM | 6-FAM/AGAGCTAGT/ЗЕН/ГККТКГГГТГТГТГТГТТЦТЦ/ИБФЗ |
| Зонд AO штрих-код - HEX | HEX/AGTATCACT/ЗЕН/ГАГТГТГТГТГТАКГТАК/IBF |
| Баркод AT зонд - HEX | HEX/ACCAGTGTC/ЗЕН/КГТГАКАТГГТАГАГАК/IBF |
| Зонд штрих-кодов AW - HEX | HEX/ACGACTGAG/ЗЕН/ТГАТГТГГГАТГГАКГККККК/ИБФЗ |
| Зонд BARcode AX - HEX | HEX/ACTATCGTG/ЗЕН/ГТГТААКАКАКАГГКГГГГГГГГ/ИБФЗ |
|
1 Подчеркнутые нуклеотиды указывают на дополнительные последовательности для каждого штрих-кода ДНК, который вставляется на pSKAP после SDM. 2 Двойные подчеркнутые нуклеотиды указывают на взаимодополняемую область на S. Тифимурийная хромосома, используемая для аллелевой замены. 3 PrimeTime qPCR зонды гибридизации олиго с маркировкой 5' флуоресцентный краситель, либо 6-carboxyfluorescein (6-FAM) или hexachlorofluorescein (HEX), внутреннее утоление (ЗЕН), и 3' утоки Айова Черный® F (IBF). |
|
Таблица 2: Праймеры и зонды, используемые в данном исследовании.
| Количественная оценка (копия/реакция 20 л) | ||||||||
| Описание | Аа | Объявление | Ag | Аль | Ао | В | Aww | Ax |
| Ntc | N/A | 0.000 | 0.000 | 3.510 | N/A | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.600 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.510 | 0.000 | 1.280 | 1.180 | 2.340 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 2.290 | 0.000 | 0.000 | 1.200 | 1.150 | 1.160 | 0.000 | 0.000 |
| Означает | 3.133 | 0.000 | 0,320 | 1.473 | 1.163 | 0,290 | 0.000 | 0.000 |
| Отрицательные | 5.130 | 1.156 | 0.000 | 1.124 | 3,745 | 1.281 | 7.354 | 7.142 |
| Отрицательные | 5.270 | 0.000 | 0.000 | 1.087 | 1.666 | 1.643 | 7,746 | 2.269 |
| Отрицательные | 2.660 | 0.000 | 1.361 | 1.451 | 8.974 | 0.000 | N/A | 0.000 |
| Отрицательные | 6.090 | 0.000 | 0.000 | 2.251 | 0.000 | 2.531 | 8.700 | 3.495 |
| Отрицательные | 1.740 | 0.000 | 1.086 | 2.130 | 4.171 | 0.000 | 7.113 | 5.522 |
| Отрицательные | 6.220 Г. | 3.581 | 0.000 | 4.022 | 1.175 | 1.341 | N/A | 5.950 |
| Означает | 4.518 | 0,789 | 0,408 | 2.011 | 3.288 | 1.133 | 7.728 | 4.063 |
| Положительные | 22281.540 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
| Положительные | 23989.676 | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660 | 47456.973 | 15096.601 | 47929.840 | 22455.234 |
| Положительные | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820 | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270 | 21467.840 |
| Положительные | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473 |
| Положительные | 20218.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.938 |
| Положительные | 18531.740 | 41620.801 | N/A | 48082.313 | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992 | 21117.559 |
| Означает | 20652.601 | 42116.824 | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827 | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
| Пустое вычитание | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
| Неразбавленный A | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305 | 62844.068 | 27567.828 |
| Неразбавленный B | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
| 1/50 А | 521.670 | 755.035 | 1066.898 | 1287.187 | 1053.339 | 181.324 | 1278.336 | 580.961 |
| 1/50 B | 435.326 | 634.215 | 1168.087 | 1383.537 | 991.040 | 165.443 | 1180.445 | 596.461 |
| 1/100 A | 228.028 | 598.848 | 603.911 | 631.116 | 507.956 | 258.405 | 665.647 | 331.590 |
| 1/100 B | 256.330 | 585.834 | 583.325 | 670.875 | 459.325 | 289.207 | 638.916 | 307.948 |
| 1/200 А | 121.283 | 305.293 | 258.247 | 346.965 | 234.774 | 114.163 | 169.055 | 172.553 |
| 1/200 B | 114.638 | 313.040 | 253.685 | 297.216 | 191.637 | 179.895 | 280.989 | 147.297 |
| 1/400 А | 42.829 | 141.343 | 127.337 | 163.605 | N/A | 71.241 | 157.697 | 85.976 |
| 1/400 B | 59.544 | 180.543 | 162.080 | 162.108 | 115.508 | 104.682 | 151.141 | 87.804 |
| 1/800 А | 34.304 | 67.934 | 65.939 | 83.857 | 66.134 | 31.784 | 82.722 | 45.616 Г. |
| 1/800 B | 20.390 | 80.222 | 81.453 | 85.325 | 53.102 Год | 38.034 | 55.460 | 29.660 |
| 1/1600 A | 15.405 | 44.505 Год | 47.672 | 39.613 | 33.027 | 18.006 | 37.655 | 20.988 |
| 1/1600 B | 22.091 | 48.828 | 46.781 | 37.388 | 30.245 Для | 30.138 | 34.553 | 19.795 |
| 1/3200 А | 12.333 | 22.104 | 16.850 | 18.403 | 11.460 | 10.535 | 21.245 | 9.218 |
| 1/3200 B | 6.796 | 32.555 | 15.742 | 26.249 Г. | 15.111 | 9.908 | 23.393 | 10.175 |
| Пустое вычитание | ||||||||
| Неразбавленный A | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
| Неразбавленный B | 18273.655 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860 | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
| 1/50 А | 517.152 | 754.246 | 1066.490 | 1285.176 | 1050.051 | 180.192 | 1270.607 | 576.898 |
| 1/50 B | 430.808 | 633.426 | 1167.679 | 1381.526 | 987.751 | 164.311 | 1172.717 | 592.398 |
| 1/100 A | 223.509 | 598.059 | 603.503 | 629.105 | 504.668 | 257.272 | 657.918 | 327.527 |
| 1/100 B | 251.812 | 585.044 | 582.918 | 668.864 | 456.036 | 288.074 | 631.187 | 303.885 |
| 1/200 А | 116.765 | 304.503 | 257.840 | 344.954 | 231.486 | 113.030 | 161.327 | 168.490 |
| 1/200 B | 110.120 | 312.251 | 253.277 | 295.205 Г. | 188.348 | 178.762 | 273.261 | 143.234 |
| 1/400 А | 38.310 Для | 140.554 | 126.929 | 161.594 | N/A | 70.108 | 149.968 | 81.913 |
| 1/400 B | 55.026 | 179.753 | 161.672 | 160.097 | 112.219 | 103.549 | 143.413 | 83.741 |
| 1/800 А | 29.786 | 67.145 | 65.531 | 81.847 | 62.846 | 30.651 | 74.994 | 41.553 |
| 1/800 B | 15.872 | 79.433 | 81.045 | 83.314 | 49.813 | 36.901 | 47.732 | 25.596 |
| 1/1600 A | 10.886 | 43.716 Г. | 47.264 | 37.602 | 29.739 | 16.874 | 29.927 | 16.925 |
| 1/1600 B | 17.573 | 48.039 | 46.373 | 35.377 | 26.957 | 29.005 | 26.825 | 15.732 |
| 1/3200 А | 7,815 | 21.314 Год | 16.442 | 16.392 | 8.172 | 9.402 | 13.517 | 5.155 |
| 1/3200 B | 2.278 | 31.765 | 15.334 | 24.238 | 11.822 | 8.776 | 15.664 | 6.112 |
| Имитированный КИ | ||||||||
| Неразбавленный A | 1.114895 | 1.055372 | 1.321619 | 1.114419 | 1.285650 | 1.176251 | 1.316329 | 1.294932 |
| Неразбавленный B | 0.885005 | 0.837016 | 1.220911 | 1.439279 | 0.999312 | 1.019279 | 1.272698 | 1.248618 |
| 1/50 А | 0.025046 | 0.017909 | 0.023931 | 0.028018 | 0.024348 | 0,011675 | 0.026617 | 0.027102 |
| 1/50 B | 0.020864 | 0.015040 | 0.026202 | 0.030118 | 0.022903 | 0.010646 | 0.024567 | 0.027831 |
| 1/100 A | 0.010825 | 0,014200 | 0.013542 | 0.013715 | 0.011702 | 0.016669 | 0.013782 | 0.015387 |
| 1/100 B | 0.012195 | 0.013891 | 0.013080 | 0.014582 | 0.010574 | 0.018665 | 0.013222 | 0.014276 |
| 1/200 А | 0.005655 | 0.007230 | 0.005786 | 0.007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
| 1/200 B | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0,011582 | 0.005724 | 0.006729 |
| 1/400 А | 0,001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | N/A | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
| 1/400 B | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
| 1/800 А | 0.001443 | 0.001594 | 0.001470 | 0.001784 | 0.001457 | 0.001986 | 0.001571 | 0.001952 |
| 1/800 B | 0.000769 | 0.001886 | 0.001819 | 0.001816 | 0,001155 | 0.002391 | 0,001000 | 0.001203 |
| 1/1,600 А | 0.000527 | 0.001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
| 1/1,600 B | 0.000851 | 0.001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0.001879 | 0.000562 | 0.000739 |
| 1/3,200 А | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 |
| 1/3,200 B | 0.000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
| Средний CI (теоретический) | ||||||||
| Неразбавленный (1) | 0.999950 | 0.946194 | 1.271265 | 1.276849 | 1.142481 | 1.097765 | 1.294514 | 1.271775 |
| 1/50 (0.02) | 0.022955 | 0.016474 | 0.025067 | 0.029068 | 0.023625 | 0,011161 | 0.025592 | 0.027466 |
| 1/100 (0.01) | 0,011510 | 0.014046 | 0.013311 | 0.014148 | 0,011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0.014832 |
| 1/200 (0.005) | 0.005494 | 0.007322 | 0.005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
| 1/400 (0.0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0,00260 | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
| 1/800 (0.00125) | 0.001106 | 0.001740 | 0.001645 | 0.001800 | 0.001306 | 0.002188 | 0.001285 | 0.001577 |
| 1/1,600 (0.000625) | 0.000689 | 0.001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0.001486 | 0.000594 | 0.000767 |
| 1/3,200 (0.000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
| Стандартное отклонение | ||||||||
| Неразбавленном | 0.11494 | 0.10918 | 0,05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0.02182 | 0,02316 |
| 1/50 | 0.00209 | 0,00143 | 0,00114 | 0,00105 | 0.00072 | 0.00051 | 0,00103 | 0.00036 |
| 1/100 | 0.00069 | 0.00015 | 0.00023 | 0.00043 | 0.00056 | 0,00100 | 0.00028 | 0.00056 |
| 1/200 | 0.00016 | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0,00213 | 0,00117 | 0.00059 |
| 1/400 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 | 0.00002 | 0 " | 0.00108 | 0.00007 | 0.00004 |
| 1/800 | 0.00034 | 0.00015 | 0.00017 | 0.00002 | 0.00015 | 0.00020 | 0.00029 | 0.00037 |
| 1/1,600 | 0.00016 | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 | 0.00003 | 0.00039 | 0.00003 | 0.00003 |
| 1/3,200 | 0.00013 | 0.00012 | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 | 0.00002 | 0.00002 |
| «Представляет результаты одного эксперимента. | ||||||||
Таблица 3: Абсолютная количественная и смоделированная расчет ы CI.
| Состояние | Конкурентный индекс1 | |||||||
| Эксперимент 1 | ||||||||
| WTAA | WTAD | WTAG | WTAL | WTАО | WTAT | WTAW | WTAX | |
| Логарифмический | 0,927 и 0,033 | 0,992 и 0,031 | 1,068 и 0,025 | 0,921 и 0,02 | 1,044 и 0,03 | 1,051 и 0,057 | 1,094 и 0,027 | 0,929 и 0,005 |
| Стационарные | 1,1 и 0,021 | 1,071 и 0,053 | 1,079 и 0,065 | 0,948 и 0,02 | 0,98 и 0,02 | 0,873 и 0,044 | 0,97 и 0,056 | 1,021 и 0,007 |
| Эксперимент 2 | ||||||||
| CI (традиционный) | WTAA | ЗААД | ЗБАЛ | ККАТ | ЗАБАГ | ЗакАО | ЗБКAW | ЗАБКТОПОР |
| Логарифмический | 1 и 0 | 0,802 и 0,084 | 0,957 и 0,02 | 0,989 и 0,073 | 0,581 и 0,153 | 0,86 и 0,053 | 0,995 и 0,011 | 0,695 и 0,061 |
| Стационарные | 1 и 0 | 0,97 и 0,063 | 1,043 и 0,058 | 0,99 и 0,036 | 1,625 х 0,589 | 0,835 и 0,051 | 0,912 и 0,047 | 0,477 и 0,049 |
| CI (Бассейн Инокулум) | ||||||||
| Логарифмический | 1,114 и 0,039 | 0,864 и 0,074 | 1,073 и 0,032 | 1,1 и 0,068 | 0,633 и 0,152 | 0,938 и 0,056 | 1,111 и 0,043 | 0,746 и 0,06 |
| Стационарные | 1,078 и 0,039 | 1,039 и 0,049 | 1,166 и 0,093 | 1,066 и 0,01 | 1,735 и 0,613 | 0,876 и 0,035 | 0,97 и 0,045 | 0,49 и 0,047 |
| 1 Значения представляют собой среднее отклонение CI и стандартного для трех или четырех повторных экспериментов. | ||||||||
Таблица 4: Представитель результаты в пробирке конкуренции между S. Типимурий штаммов.
Таблица S1. Дополнительные праймеры для создания дополнительных последовательностей штрих-кодов и соответствующих флуоресцентных зондов для их обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок 1. Поколение pSKAP. (A) Очищенный pKD13 подвергся ограничению пищеварения с HindIII и BamHI. (B, C) 1,333 bp фрагмент интереса, содержащий FRT-фланговый ген сопротивления канамицина был очищен. (D) pPCR Сценарий Cam СКЗ был также переварен с HindIII и BamHI и фрагмент из pKD13 (B) был ligated в генерировать (E) pSKAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Вставка сайт-направленный мутагенез на pSKAP. (A) Вставка 25 bp ДНК штрих-кодов в положении 725 была выполнена с использованием ПЦР. Передние и обратные грунтовки, характерные для этого места, были разработаны с дополнительными 25-нуклеотидными 5 расширениями (обозначенными в грунтовке как нижний регистр "a"). (B) Общий плазмид pSKAP-Barcode в результате SDM показан с расположением вставленного штрих-кода ДНК выделеноранжевый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Хромосомная перестановка вниз по течению putP. (A) После того, как опосредовано рекомбинация, выбираемый ген сопротивления канамицин (темно-фиолетовый) в с боком frT сайтов (серый) вставляется на хромосоме между локусов показано (Хромосомная рекомбинация сайта, красный). Уникальный штрих-код ДНК (оранжевый) вставляется недалеко от сайта FRT. (B) Ген сопротивления канамицина удаляется FRT-опосредованного иссечения, оставляя остатки вставленной ДНК на хромосоме (Всего вставленная ДНК, синий), состоящий из штрих-кода ДНК и FRT шрам. (C) Показана модифицированная хромосомальная последовательность ДНК, окружающая вставленную ДНК, наряду с участками усиления грунтовки (светло-фиолетовый), используемыми для цифрового ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схема разбавления для проверки чувствительности и специфичности флуоресцентного зонда. (A) Очищенная gDNA из семи штрих-кодированных штаммов смешивается в равных количествах, чтобы создать разбавитель для разбавления опущенных штрихкодированных gDNA (AX в примере выше). (B) Выполните серийное разбавление опущенного штрих-кода gDNA (AX в примере выше) с использованием подготовленного разбавителя, описанного ранее. Тщательно смешайте содержимое каждой трубки перед переходом на следующую трубку. Рисунок 4 был создан с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Расположение плиты для анализа чувствительности и специфичности грунтово-зондных наборов 1 и 2. Цифровой эксперимент PCR включает в себя NTCs, положительные элементы управления, отрицательные элементы управления и схемы разбавления для каждого из проверенных штрих-кодов. Пластина для проверки грунтового зонда наборы 3 и 4 выкладывается в том же шаблоне с использованием соответствующих штрихкодированных gDNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Представитель цифровых результатов ПЦР разбавленного AA-штрих-кодированного gDNA. gDNA, содержащий штрих-код АА, был разбавлен на фоне всех других штрих-кодов gDNA, как описано на рисунке 4. Первый канал представляет зонд FAM для штрих-кода АА (верхние панели), в то время как канал 2 представляет зонд HEX для штрих-кода АО (нижние панели). Результаты каждого зонда представлены как как индивидуальная флуоресцентная амплитуда (левые панели), так и гистограмма, представляющая частоту флуоресцентной интенсивности всех капель в выбранных скважинах (правых панелях). Для каждого состояния положительные (высокая флуоресценция) и отрицательные (низкая флуоресценция) капли должны образовывать две различные популяции. В случае АА, который был разбавлен, и большинство капель были отрицательными, гистограмма (верхняя правая панель), как представляется, только изображают одну популяцию. Это объясняется тем, что положительные капли значительно превосходят по численности отрицательные капли; однако, две различные популяции все еще видны, изучая флуоресцентную амплитуда капель в левой панели. Популяции должны быть разделены с помощью функции порога для определения положительных и отрицательных капель (визуализированных розовой линией). Пороговые значения будут варьироваться в зависимости от используемых зондов, но все скважины, использующие одну и ту же смесь зонда, должны иметь одинаковые пороги. Поскольку гДНК с штрих-кодом AA была разбавлена, наблюдается уменьшение положительных (высоких флуоресцентных) капель, в то время как количество положительных капель АО остается неизменным на заднем плане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способность точно количественно оценить микроорганизмы имеет первостепенное значение для исследований микробиологии, а способность перечислять уникальные штаммы из первоначальной смешанной популяции оказалась бесценным инструментом для оценки фитнеса и вирулентности в Бактерий. Тем не менее, методы для достижения этой цели не продвинулись в ногу с современными разработками в молекулярной биологии. Технология легко модифицировать хромосомы многих бактерий, в том числе S. Typhimurium, был доступен в течение почти двух десятилетий14, но эта способность редко используется для молекулярно пометки штаммов с уникальными последовательностями ДНК. Используя способность создавать легко идентифицируемые штаммы на основе уникальных, минимально-разрушительных штрих-кодов ДНК, вставленных на бактериальную хромосому, в сочетании с самой современной технологией для обнаружения и количественной оценки этих молекулярных идентификаторов ( т.е. цифровой ПЦР), мы создали систему, которая обеспечивает изысканную чувствительность, специфичность, точность и точность для легкой количественной оценки отдельных штаммов в разнообразной популяции бактерий.
Расчет CIs и COIs, как описано выше, опирается на способность точно вносить соответствующие изменения в бактериальные хромосомы. Все изменения должны быть проверены секвенированием Sanger, чтобы убедиться, что случайных мутаций не произошло. Использование полимеразы высокой точности сведет к минимуму эти ошибки, но любые такие мутации, которые происходят, ухудшит способность обнаруживать штамм, что является еще одним важным аспектом этого протокола. Хотя мы продемонстрировали, что цифровые ПЦР могут обнаружить всего лишь две копии gDNA на фоне почти 2 миллионов, штаммы за пределами этого диапазона могут потребовать дополнительных разбавлений для их точной количественной оценки. Кроме того, последовательности штрих-кодов ДНК должны быть разработаны для облегчения использования высококачественных последовательностей зонда. Последовательности зондов должны быть проанализированы для тенденций к самодимеризации, форме шпильки, или неэффективно связать свои цели. Важность использования качественных последовательностей и зондов не может быть минимизирована, о чем свидетельствуют тщательные эксперименты по проверке, которые должны выполняться с каждым зондом. Усилия по созданию оптимальных штрих-кодов ДНК позволят создать оптимальные цифровые результаты количественной оценки ПЦР.
Хотя тщательно разработанные молекулярные метки важны для получения качественных результатов, интерпретация результатов является еще одним важным аспектом этого протокола. CI определяется как соотношение между штаммом мутантов и деформации дикого типа в выходе делится на соотношение двух штаммов в входе1,19,20. Этот традиционный КИ, представленный в разделе 9, полезен, когда смешанная инфекция состоит только из одного штамма по сравнению с диким типом. Однако, при использовании больших бассейнов штаммов для прививки средств массовой информации или животных, штаммы не только конкурируют с диким типом, но и против любого другого штамма, присутствующего в инокулуме. Предыдущие исследования, которые выполняли конкурсные эксперименты с использованием нескольких зараженных штаммов, не смогли принять это во внимание в своих расчетах7,13. Для учета этой особенности смешанных инфекций, мы ввели формулу для расчета CIs, который был изменен для объединенных инфекций. Маловероятно, что все штаммы обеспечат одинаковый уровень конкуренции, в результате которого штамм дикого типа будет таким же. Однако, поскольку большинство бактериальных генов оказывают незначительное влияние на вирулентность, так как количество штаммов, используемых в конкурентном эксперименте индекс увеличивается, вероятность того, что общая вирулентность будет иметь тенденцию к штамму дикого типа увеличивается. Это не обязательно может быть в случае некоторых экспериментальных конструкций с использованием пулов многих штаммов все с известными дефектами вирулентности. Тем не менее, это учитывается в измененном уравнении, потому что менее обильные штаммы (менее подходят) в результате будет иметь меньшее влияние навыходX . В зависимости от конкретного экспериментального проекта могут быть случаи, когда предпочтение отдает та или иная формула. Однако в большинстве случаев, связанных с объединенными инфекциями, важно учитывать, что при смешанной инфекции все штаммы конкурируют друг с другом, а не только с дикими. При анализе результатов, очень важно, чтобы обоснование каждой формулы хорошо понимал, чтобы сделать наиболее точные интерпретации деформации фитнес. При представлении результатов не менее важно точно раскрывать, как анализировались данные.
Раздел 9 протокола также включает формулы, помогая определить взаимодействие генов с помощью COI. С помощью этого анализа можно сделать прогнозы, чтобы определить, действуют ли два вирулентных гена независимо или вместе. COI определяется как отношение двойного мутанта к одиночному штамму мутанта в выходе, разделенном на соотношение двух штаммов в входе1. Формула предназначена для обнаружения фенотипической аддитивности генных нарушений. Если гены функционируют независимо для повышения вирулентности, нарушение обоих генов должно привести к большему снижению пригодности по сравнению с одним нарушением любого гена в одиночку. Если гены функционируют вместе для повышения вирулентности (например, гены, кодируя два фермента в пути), нарушение обоих генов должно иметь такое же влияние на вирулентность, как нарушение обоих генов. Обнаружение фенотипической аддитивности может быть затруднено в тех случаях, когда уровень затухания, вызванный одним геном, либо очень высок, либо очень низок. Тем не менее, прямое сравнение штаммов в одной и той же животной системе обеспечивает меньшую изменчивость и более надежный учет функциональной взаимосвязи между генами, и этот расчет может быть выполнен из двух штаммов в пределах большей смешанной популяции.
Последним критическим аспектом интерпретации результатов является рассмотрение последствий динамики народонаселения. В некоторых смешанных инфекций, которые имеют несколько штаммов, один штамм может возникнуть как либо более доминирующим или менее подходят из-за случайного дрейфа населения. Это явление может быть усилено при возникновении узких мест. Это может быть вызвано использованием очень большого количества входных штаммов, очень небольшое количество бактерий в инокулум, или сочетание обоих. Другим аспектом вмешательства, который возникает в результате смешанных инфекций является возможность транс-дополнения. Это происходит, когда подгонка штамма, таких как дикий тип, искусственно усиливает вирулентность менее подходят штамма. Гипотетический пример этого будет сравнить пригодность S. Typhimurium Pathogenicity Island 2 (SPI2)-нокаут штамм совместно инфицированных дикого типа штамма. SPI2 позволяет S. Тифимурий, чтобы выжить внутриклеточного путем выделения эффекторов в принимающей цитозол, которые модифицируют фагосомы в макрофаге. Нарушение этой системы делает S. Тифимурий подвержен внутриклеточным убийствам. Однако, поскольку макрофаги способны поглотить две или более бактерий одновременно, SPI2-нокаут может получить значительное увеличение в фитнесе, если он находится в том же макрофаге, как дикий тип S. Тифимурий, который выделяет эффекторы в цитозол хозяина. Случайная динамика популяций и возможность транс-дополнения являются ограничением любого эксперимента по конкуренции. Если в транс-дополнения подозревается, фенотипы должны быть подтверждены с помощью других дополнительных методов для оценки пригодности. Для преодоления случайной динамики популяции увеличение числа повторных экспериментов повышает вероятность выявления выбросов в результатах. К счастью, описанный выше протокол облегчает увеличение числа идентичных экспериментов репликации, поскольку количество экспериментальных условий резко сокращается.
Ключевым элементом описанной выше методики КИ является его способность адаптироваться практически к любому организму и любой экспериментальной конструкции, которая требует точной количественной оценки микроорганизмов. Это, однако, требуют генетических манипуляций организма, чтобы включить уникальную последовательность ДНК на хромосоме. Адаптивность методики требует, чтобы вид был генетически-клетным и будет опираться на генерацию альтернативных протоколов для изменения генома (Шаги 1 и 2). Штрих-коды ДНК, перечисленные в таблицах 2 и S1, должны быть достаточными для большинства бактерий; однако, как и во всех количественных экспериментах ПЦР, уместно проанализировать бактериальный геном, чтобы обеспечить минимальный потенциал для нецелевого связывания грунтовки и зондов с помощью простого анализа BLAST. Последовательности штрих-кодов ДНК, используемые в данном исследовании, различаются лишь на 3-4 основания в некоторых случаях, подчеркивая изысканную специфику зондов, которая сводит к минимуму потенциал неспецифической связывания. Независимо от специфичности флуоресцентных зондов, все новые последовательности штрих-кодов должны быть надлежащим образом проверены на чувствительность и специфичность, как описано в шаге 6. После создания штрих-кодированных штаммов, можно адаптировать этот протокол ко многим типам экспериментов, кроме in vitro конкуренции анализы, как описано выше. Штаммы подходят для in vivo конкуренции анализы на мышах или других животных модели систем. Для извлечения гДНК из органов и тканей животных требуются лишь минимальные модификации, и эти модификации хорошо описаны производителями комплектов для этих целей. Кроме того, большие пулы смешанных инфекций для конкуренции in vivo были успешно использованы ранее7, предлагая потенциал для сокращения числа животных, необходимых для одного эксперимента, который не только снижает затраты на эти эксперименты но также снижает потенциал изменчивости животных. Аналогичным образом, штрихкодированные штаммы могут быть использованы в других анализах in vitro, которые исследуют восприимчивость штаммов к различным условиям лечения (например, антибиотики, кислотная восприимчивость, убийство реактивными видами кислорода или азота и т.д.). Для этих экспериментов, оценка ингибирования роста может быть достигнуто путем добавления желаемого химического вещества в среде роста в шаге 3.4 и продолжения, как описано. Для оценки бактериальной смертности можно смешивать большой пул штаммов, а ввод ипог, как описано выше, будет количественно. После воздействия желаемого лечения, живые клетки могут быть выборочно количественно путем объединения цифровой процедуры количественной оценки ПЦР с жизнеспособностью ПЦР, чтобы различать живые и мертвые клетки21,22,23 , 24 , 25 , 26. Пропускная часть для таких экспериментов будет значительно увеличена, потому что разбавления и реплики пластин для каждого штамма заменяются более обтекаемыми молекулярными методами. Наконец, хотя анализ эволюционной биологии и генетики популяций выходит за рамки данной работы, парокодированные организмы хорошо адаптируются к таким исследованиям. В конечном счете, целью этого протокола была разработка мощного метода количественной оценки бактерий, который хорошо адаптируется для его использования во многих различных видах и во многих видах экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования, о которых сообщалось в этой публикации, были поддержаны Фондом исследований факультета Джорджа Ф. Хаддикса и Национальным институтом общей медицинской науки Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии GM103427. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
