Summary
細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。
Abstract
競争力のある指標は、細菌の適合性および/またはウイルス性を評価するために使用される一般的な方法です。このアプローチの有用性は、野生型生物に多くの株の適合性を標準化するその容易さと能力によって例示される。しかし、この技術は、利用可能なプチピックマーカーと同時に評価できる株の数によって制限され、多数の反復実験の必要性を生み出す。多数の実験と並行して、フェノティピックマーカーに基づいて細菌を定量するための労力および材料コストは重要ではない。これらの負の側面を克服しつつ、細菌染色体に遺伝子マーカーをエンジニアリングした後、微生物を直接定量化する分子ベースのアプローチを開発しました。ユニークな、25塩基対DNAバーコードは、サルモネラ菌の野生型および変異株の染色体上の無害な遺伝子座に挿入された。インビトロ競技実験は、プールされた株からなるイノキュラを用いて行った。競争の後、各株の絶対数はデジタルPCRを使用して定量化され、各株の競合指数はそれらの値から計算された。我々のデータは、サルモネラ菌を定量化するこのアプローチは、非常に豊富な(高い適合性)微生物と希少な(低フィットネス)微生物の両方を検出するための非常に敏感で正確で正確であることを示しています。さらに、この技術は、改変が可能な染色体を持つほぼすべての生物や、微生物の絶対定量を必要とする様々な実験計画に容易に適応可能です。
Introduction
病原性生物の適合性とウイルス性を評価することは、微生物学研究の基本的な側面である。これは、株間または変異生物間の比較を可能にし、研究者が特定の条件下で特定の遺伝子の重要性を決定することを可能にします。伝統的に、ウイルス評価は、異なる細菌株を使用して感染の動物モデルを利用し、感染した動物の結果を観察する(例えば、感染性線量50、致死用量50、死亡時間、症状重症度、欠如症状など)。この手順は、ウイルスの貴重な説明を提供しますが、野生のタイプからの変化を検出するために結果にかなりの違いを引き起こす株が必要です。さらに、疾患の進行と症状の重症度は時間の経過とともに主観的に定量化することができるが、野生型に比べてウイルスの解釈はより質的である(すなわち、より多く、より少ない、または同様に悪性である)ので、結果は半定量的である。動物感染性アッセイを行う一般的な代替手段は、競合指数(CI)を生成する、混合感染1における野生型の対応する株の適合性またはウイルス性を直接比較する値を生成する。この技術は、野生型株に対するウイルス性を標準化し、減衰の程度を反映する定量化可能な値を決定することにより、感染の従来の動物モデルに対して多くの利点を有する。この技術はまた、取り消された競争指数(COI)2を決定することにより、細菌における遺伝子相互作用を分析するために適応することができる。変異した生物のグループのCOIを計算することで、研究者は2つの遺伝子が独立して病因に寄与しているのか、それとも同じウイルス経路に関与し、互いに依存しているのかを判断することができます。さらに、CIを計算するには、生物の病因に関する貴重な洞察を提供できる細菌の列挙が必要です。また、CIとCOIは、臨床疾患を引き起こさないが、まだフィットネスの違いを持っているアビリント株をアセスすることを可能にします。この技術は、株を同定するために従来の抗生物質耐性マーカーを使用することによって制限され、それによって入力株の数を一度に1つまたは2つだけに制限する。この制限により、大量の実験グループと反復が必要となり、人件費や材料費の増大に加えて、実験条件の変動や不正確な結果の機会も増加します。(ウイルス、フィットネス、遺伝子相互作用を研究するために混合感染症を使用することの利点とアプリケーションの徹底的なレビューについては、C.R.BeuzónとD.W.ホールデン1を参照してください)
フローサイトメトリー3、4、5を介して定量した蛍光標識細胞の使用など、この限界を克服する試みがなされている。この技術は、1)標識抗体をプノーティピックマーカーまたは2)内因性に産生した蛍光タンパク質を用いて細胞を定量する。標識抗体の使用は、1,000細胞/mLの検出の限界を有するため、3を分析するために多数の細胞を必要とする。蛍光タンパク質を発現する細胞は生理学を変化させ、高タンパク質発現に起因するフィットネス変化の影響を受けやすい6.いずれの方法も、フローサイトメトリーを用いて検出可能な蛍光マーカーの数によって制限される。分子定量の進歩は、マウスモデル7における1,000株以上の初期混合感染から120株の減衰を検出するマイクロアレイ技術の開発によって達成された。この技術は、変異株からのRNAのマイクロアレイ分析を利用し、結果にかなりのばらつきをもたらす。 それにもかかわらず、混合感染症の大きなプールは有用なツールであり、敏感な検出技術を利用することによって、細菌のウイルス性の違いを同定できることを確立しました。次世代シーケンシングの開発により、Tn-seqはトランスポゾン変異の有用性を拡大し、ランダムに変異した細菌を定量する強力な方法を可能にし、8、9、10、 11.トランスポゾンの必要性を排除し、代わりにDNAバーコードを使用してゲノムの変化とフィットネス12への影響をより簡単に特定および追跡する代替プロトコルが最近開発されました。この技術は大きな進歩ですが、ゲノムバーコードの挿入はまだランダムなプロセスです。これまでの実験のランダム性を克服するために、ユンらは細菌13の染色体上の正確な位置に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いてサルモネラ菌株のCIを計算する方法を開発した。ユニークなバーコード株は、各一意のバーコードに固有のSYBRグリーンおよびプライマーを用いたqPCRベースの方法を用いて検出された。この技術は、プライマー効率の違いや感度の低さなど、qPCRによって課される制約によって制限され、qPCRの前に入れ子になったPCRの必要性が証明された。それにもかかわらず、このアプローチは、標的ゲノム修飾が複数の細菌株のプールを検出し、潜在的に定量化するために利用できることを実証した。
以下のプロトコルでは、高感度なデジタルPCR技術を用いて正確な定量を行い、混合無分病の大きなプールで細菌競合実験を行う新しい方法論を説明する。このプロトコルは、染色体の無害な領域に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いた細菌株を遺伝的に標識することを含む。この改変により、従来のシリアル希釈、レプリカめっき、および表現力マーカーに依存するコロニー形成ユニット(すなわち抗生物質耐性)の代わりに、現代の分子技術を使用して迅速かつ正確に定量することができます。).この修飾により、単一のプールされた接種における多くの株の同時評価が可能であり、すべての株が全く同じ条件にさらされるため、実験的変動の可能性を実質的に減少させる。さらに、この技術はサルモネラ・エンテリカ・セロバー・タイフィムリウムで開発されましたが、遺伝的に可鍛性の高い生物や、正確な細菌数が必要なほぼすべての実験計画に非常に適応性が高く、新しい以前の方法によって課された制約なしで微生物学の実験室の正確さおよび効率を高めるための用具。
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Protocol
1. アレリック交換に必要な成分を含むプラスミドに独自のDNAバーコードを組み込む
注:pSKAPという名前の新しいプラスミドは、既存のpKD13アリル交換プラスミドと比較してコピー数が多く、変換効率が向上しました。これは手順 1.1~1.12 (図1) で説明します。ユニークなDNAバーコードとアレル交換のための成分を含む確定プラスミドは、プラスミドリポジトリ(材料の表)を介して利用可能です。
- 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、ルリア・ベルタニ(LB)で栽培された一晩の細菌培養物からpKD1314およびpPCRスクリプトカムSK+を精製し、50μg/mLカナマイシンまたは25μg/mLクロラムフェニコール(pKD13およびpPCRスクリプトカム用)SK+(それぞれ) (表1)
- 製造元の仕様に従って、市販の制限酵素HindIIIとBamHIを使用して、両方のプラスミドに対して制限消化を行います。
- pPCRスクリプトカムSK+反応から制限酵素および切除DNAを除去し、メーカーの仕様に従って市販のDNAクリーンアップキットを使用して3,370塩基対(bp)プラスミドバックボーンを精製します。
- 電気泳動室を使用して1%アガロースゲルのpKD13制限消化から断片を分離します。
- 青色光トランジルミネーションを用いてバンドを可視化し、ゲルから1,333 bpフラグメントを取り除きます(図1C)。
注:この断片には、染色体アレリン置換に必要なFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子が含まれています。 - 市販のゲル抽出キットを使用して、ステップ1.5から取り除かれたDNAを精製します。
- pSKAPを作成するには、pKD13(ステップ1.6から)からpPCRスクリプトカムSK+(ステップ1.3から)に精製された断片を、製造元の仕様に従って市販のT4 DNAリガーゼを使用してリゲートします。
- 化学的に有能なDH5α細胞を、製造業者のプロトコルに従ってリゲテッドpSKAPプラスミドで形質転換する(表1)。
- LB寒天プレートに転向した形質転換剤を50μg/mLカナマイシンで補い、一晩37°Cでインキュベートする。
- プレートからコロニーを選び、50 μg/mLカナマイシンを補充した新しいLB寒天プレートにストリークし、一晩37°Cでインキュベートします。このプレートからコロニーを選び、50 μg/mLカナマイシンを補充したLBスープを接種するために使用します。一定の攪拌で37°Cで一晩培養します。
- 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、一晩の細菌培養からpSKAPを精製します。
- メーカーの仕様に従って、ヒンドIIIとBam HIを使用してステップ1.11からプラスミドの診断制限消化を行います。ステップ1.4-1.5のように1%アガロースゲルの断片を視覚化します。
注:pSKAP の合計サイズは、ステップ 1.12 の後のフラグメントは 4,703 bp. 3,370 および 1,333 bp である必要があります。 - pSKAPの位置725にユニークな25塩基対DNA配列を挿入するような方法で挿入部位指向変異体(SDM)(表2およびS1)のためのPCRプライマーを設計する(図2)。
注:バーコードDNAはFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子のすぐ外側のプラスミドに挿入され、その後のカナマイシン耐性カセットの除去時にバーコードが失われることはありません。新しいバーコード配列を生成する場合は、オンラインツールを使用して、蛍光標識された標的特異的PCRプローブ(以下、単に「プローブ」と呼ばれる)が新しい配列に効率的に結合することを保証します。現在までに設計された挿入シーケンスと、それらを作成するために必要なプライマーと共に、表 2およびS1に記載されています。 - 市販の高忠実度DNAポリメラーゼ、所望のプライマーペア(表2)、およびpSKAPテンプレートを用いてSDM反応を調製する。サーモサイクラーを設定して、1) 98 °C を 30 s、2) 98 °C を 10 s、56 °C (15 s)、72 °C (2 分) 繰り返しステップ 2、24 回、4) 72 °C を 5 分間、5 分間保持します。
- PCRの完了後、反応に制限酵素DpnIを添加してpSKAPテンプレートを枯渇させる。37 °Cで20分間インキュベートします。
注:PCRの製品をアガロースゲル上で可視化し、製品の大きさと純度を確認する必要があります。未改変されたpSKAPテンプレートからなるコントロールDpn I消化を実行し、テンプレートDNAが完全に消化されるように、後続の手順で使用することができます。 - 工程1.15から製品の5 μLを使用して、メーカーの推奨に従って、市販の化学的に有能なDH5α細胞の100 μLを変換します。
- LB寒天プレートに形質転換剤を25μg/mLクロラムフェニコールを添加し、一晩37°Cでインキュベートする。
- 一晩プレートからコロニー(またはコロニー)を選択し、25 μg/mLクロラムフェニコールを補充した個々のLB寒天プレートにストリークし、一晩37°Cでインキュベートします。一晩プレートからコロニーを選択し、25 μg/mLクロラムフェニコールを補充したLBスープの5 mLを接種するために使用します。一定の撹拌で37°Cで一晩培養する。
- 市販のプラスミドミニプレップキットを使用して、一晩培養物からプラスミドを精製します。
- M13フォワードシーケンシングプライマー(表2)を用いてサンガー配列精製プラスミド。変異した領域を元のプラスミドと比較し、SDM挿入精度を評価します。
- バーコードの挿入と精度を確認した後、各バーコードとプラスミドに名前を割り当てます。
注:現在までに生成されたバーコードには、AA、AB、AC、...、BA、BB、BCなどの2文字の指定が割り当てられています。バーコードプラスミドは、pSKAP_AA、pSKAP_AB、pSKAP_AC、...、pSKAP_BA、pSKAP_BB、pSKAP_BCなどとして表されます。 - 手順 1.14-1.21 を繰り返し、所望の数の DNA バーコードを生成します。
2. Sの染色体にDNAバーコードを導入する。ティフィムリウム
注:DNAバーコードをSに挿入する。タイフィムリウム染色体は、Sで使用するために改変されたダッセンコおよびワナー14によって記述されたアリル交換法を用いて達成される。ティフィムリウム
- Sの軌跡を決定します。DNAバーコードを挿入するチフィムリウムゲノム(図3)。
注:染色体の大きな、相互領域を選択します。非コーディング RNA を生成する領域は避けてください。本研究は、残基1,213,840と1,213,861(ゲノムアセンブリGCA_000022165.1から決定)の間に入れPの下流に置かれた遺伝子を利用した。この領域は、以前に遺伝子15のトランス補体のために遺伝的に操作されている。あるいは、目的の遺伝子を破壊しながらDNAバーコードを導入することもできる。これを行うには、このプロトコルへの最小限の変更が必要になり、ミュータントの作成が合理化されます。 - ステップ1.21(表2)から所望のpSKAPバーコード含有プラスミドからユニークなバーコードおよびFRTフランクカナマイシン耐性遺伝子を増幅するPCRプライマーを設計する。ステップ 2.1 で選択した領域に相同である 40-ヌクレオチド拡張を各プライマーの 5' 末端に追加します (表2)。
- 市販の高忠実度ポリメラーゼ、ステップ2.2からのプライマー、および所望のpSKAPバーコード含有プラスミドをテンプレートとして用いて増幅を行う。サーモサイクラーを設定して、1) 98 °C を 30 s、2) 98 °C を 10 s、3) 56 °C (15 s 用、4) 72 °C 60 s、繰り返しステップ 2-4 29 回、5 分間 72 °C、6) 4 °C で保持します。
- PCRの完了後、ステップ1.15で説明するようにDpnIを用いてテンプレートDNAを枯渇させる。製造元の仕様に従って市販のDNAクリーンアップキットを使用してDNAを精製し、濃縮します。
- Sで変異体を生成するための以前に公開されたプロトコルを参照してください。PCR製品14、16、17、18からタイプムリウム株14028s。
注:カナマイシン耐性遺伝子が染色体から取り除かれては必須ではない。しかし、遺伝子の切除は、潜在的な下流遺伝子をフレーム内に残す129 bpの瘢痕をもたらすので、細菌染色体に最小限の破壊をもたらす。カナマイシン耐性遺伝子を含む株は、P22媒介トランスダクションを介して株間バーコードを移動するために使用することができるので保持することをお勧めします。 - 手順 2.3 ~ 2.5 を繰り返し、適切なバーコードで目的のひずみを作成します。
注:バーコードはワイルドタイプSに導入できます。その後、さらなる遺伝子操作を受けることができるタイプムリウム、またはバーコードは、以前に遺伝子改変された株に導入することができる。
3. 細菌の成長条件とインビトロコンペティションアッセイ
- 細菌ストックから、ストリーク所望のS.それぞれがLB寒天プレート上にユニークなDNAバーコードを持つタイプムリウム株。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
- 各株から単一のコロニーを選択し、LBスープの5 mLを接種します。一定の撹拌で37°Cで20時間インキュベートします。
注:一晩培養を使用して、ステップ3.5に進み、各バーコード株から純粋なゲノムDNA(gDNA)を収集する。これは、セクション 6 の後続の検証および制御実験に必要です。 - 各競技アッセイについて、各一晩培養量を適切なサイズの無菌チューブに転送します。少なくとも5秒間激しく渦を混ぜることによって、株を完全に混ぜます。
注:転送する各一晩培養の量は、各条件および反復に対して十分であり、また、入力を定量化するためにgDNAを分離するために十分である必要があります。入力微生物の絶対数はデジタルPCRを使用して定量されるため、培養物の光学密度を測定する必要は完全ではありませんが、各菌株の入力細菌数は、ボトルネックを回避するためにほぼ等しくする必要があります。実験の早い段階で不平等な競争をした。このプロトコルにおける代表的な競争アッセイは、8株の成長率を同時に比較した。個々の実験計画には、追加または少ない株が必要な場合があります。 - 混合イヌキュラムの100 μLを4.9 mL無菌LBブロスに移す。所望の時間または所望の光学密度のために37 °Cでインキュベートする。
- 遠心分離による接種の500 μLを1分間>12,000 x gで収穫し、上清を取り除いて廃棄する。セルを使用してセクション 4 に直ちに進みます。
- 所望の時点で、培養物の500 μLアリコートを取り出し、1分間>12,000 x gで遠心分離により細胞を収穫します。
注:アリコートを複数のタイムポイントで収集する場合は、-20 °Cでペレットを凍結するか、各収集後すぐにステップ4.1に進みます。
4. Sから gDNA を収集および定量する。タイフィムリウム (ステップ 3.5 および 3.6 から)
- 市販のgDNA精製キットを用いて細胞からgDNAを収穫する。使用可能な場合は、オプションの RNA 枯渇ステップを実行します。
注:RNA の枯渇は必要ありません。しかし、RNAの存在は人工的にDNA濃度を増加させ、その後のステップで異常な計算につながります。市販のgDNA精製キットを使用する場合は、製造元の推奨事項に従って、カラムにDNAが過負荷にならないようにしてください。サンプルが後続のステップで定量可能である場合、必要な最小DNA濃度はありません。 - 分光光度計を使用して、各サンプルのDNAを定量します。
注:DNAは、任意の信頼性の高い方法を使用して定量することができる。 - 次の式を使用して細菌ゲノムサイズに基づいてgDNAコピー数を計算します:XはngのDNAの量であり、Nは二本鎖DNA分子の長さ(ゲノムサイズ)です。
注:660g/モルは、1 DNA bpの平均質量として使用され、生物のヌクレオチド組成に応じて小さな変動が存在してもよい。計算を実行するために、多数の電卓がオンラインで利用可能です。
5. dDigital PCRによるDNAバーコードの定量的検出のためのプライマーとプローブの設計
- Sのバーコード領域を増幅するプライマーを設計します。putPの下流のチフィムリウム染色体(図3Cおよび表2)。
注:プライマーとプローブの設計は、多数のオンラインプログラム(材料の表)によって促進することができます。バーコードがすべて同じ遺伝子座に挿入されている場合、増幅プライマーの単一のセットはすべてのバーコードに対して普遍的です。 - 各バーコードに固有の6-カルボキシフルオレセイン(FAM)ベースおよび/またはヘキサクロロフルオレセイン(HEX)ベースのプローブを設計します(表2およびS1)。
注:この実験で使用される液滴リーダーは、多重反応でFAMおよびHEXベースのプローブの両方を同時に検出することができる。FAMを利用するプローブの1/2を設計し、HEXを利用する場合は1/2を設計します。これは必要なステップではありませんが、実装すれば試薬の使用と実験コストを削減できます。 - 各前方および逆増幅プライマーの20 mM、2)単一のFAMプローブの10 mM、および3)単一のHEXプローブの10 mM(多重化の場合)を含む20倍プライマープローブマスターミックスを作成します。
6. デジタルPCRを使用して、各ゲノムバーコードの各Pprimerプローブセットの感度と特異性を検証する
注:このプロトコルでは、例として 8 つの一意のプローブを使用して 8 つの一意のバーコードを検証します。使用されるバーコードの数は、さまざまな実験設計に対応するために増減することができる。
- 1 つを除くすべてのバーコードを含む gDNA のプールを作成します。このプールを希釈剤として使用して、残りのバーコードを含むgDNAを含む希釈系列を実行します(サンプル希釈スキームは図4に示されています)。
注:プールされたgDNAを希釈剤として使用すると、感度を確認しながら一貫した背景を確保できます。ステップ 4.3 で決定したコピー番号を使用して、推奨されるデジタル PCR 範囲内のコピー番号に gDNA を希釈します (20 μL 反応あたり 1-100,000 コピー)。範囲は、gDNAの合計ではなく、一意のターゲット(バーコード)ごとに設定されます。 - プローブベースの化学用に設計されたデジタルPCRスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、重複してデジタルPCRの反応を準備します。ステップ 6.1 の混合物をテンプレート DNA として使用します。ステップ 6.1 で希釈バーコードのプローブを含むステップ 5.3 の 20x プライマー プローブ マスター ミックスを使用します。
- プローブベースの化学用に設計されたデジタルPCRスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、デジタルPCRの反復制御反応を準備します。各プローブミックスの制御反応は、1)テンプレートコントロール(NTC)、2)負のコントロール、および3)正のコントロールで構成されなければなりません。
注:反復対照反応の最小数は2です。この例のプロトコルでは、各バーコードに対して 4 つの NTC、6 つの負のコントロール、および 6 つの正のコントロールを使用します。負のコントロールには、テスト対象のプローブに対応するバーコードを除き、各バーコードに gDNA を含める必要があります。これにより、各プローブの特異性が検証されます。 - 手順 6.1-6.3 を繰り返し、バーコードされた gDNA サンプルごとにデジタル PCR 反応を作成します。サンプルプレートの配置を図5に示します。
注:この手順とその後の手順は、液滴とフローベースの技術を利用する特定のデジタル PCR プラットフォームに基づいて説明されます。チップベースの技術を利用する代替デジタルPCRプラットフォームは、このプロトコルにわずかな変更を加えて簡単に置き換えることができます。ステップ 6.4 では、すべてのプライマー セットを検証するために、複数の 96 ウェル プレートが必要になる場合があります。qPCRとは対照的に、デジタルPCRによって分析された別々のプレートは、プレート間の標準化された参照ウェルを必要とせずに容易に比較することができる。 - 製造元の指示に従って液滴発生器を使用して、各反応条件の液滴を生成します。
- 新しく作成した液滴を適切な96ウェルプレートに移します。5-50 μL マルチチャンネルピペットに 200 μL ピペット チップを使用します。
注:液滴をピペットにすると、ピペットがゆっくりとスムーズに!デジタル PCR 機器の製造元では、特定の製造元 (Ranin など) のピペットとピペット チップのみを使用することをお勧めします。これらのピペットの先端に液滴を破壊したり、液滴の読者のマイクロ流体を損傷させることができる顕微鏡のプラスチック断片なしで滑らかな開口部を持っています。数多くのブランドのヒントが調べられ、製造品質のスペクトルを持つことが観察されました。同等の結果は、ピペットチップの代替を使用して達成されています;ただし、製造元の推奨事項から逸脱する場合は注意が必要です。 - すべての液滴が生成され、転送された後、ホイルプレートシーラーでプレートをシールします。
- 次のサイクリング条件を実行するには、メーカー推奨のサーモサイクラーを使用してください: 1) 94 °C 10分;2) 94 °C 1分、ランプレートを1 °C/sに設定。3) 55 °C 2 分、ランプレートは 1 °C/s に設定されています。4)ステップ2と3 49回を繰り返します。5) 98 °C 10分;6)24時間まで4°Cで保持します。
注:液滴反応における熱伝達は、標準PCRと同じではない。反応条件は、修正を必要とする場合があります。 - サーモサイクリングが行われている間、サンプル名、実験タイプ(絶対定量)、スーパーミックス使用、ターゲット1名(FAMバーコード名)、ターゲット1タイプ(NTC、陽性制御、正対照、等のプレート設定情報を含むデータ解析ソフトウェアをプログラムする)マイナスコントロール、または不明)、ターゲット2名(HEXバーコード名)、ターゲット2タイプ(ブランク、ポジティブコントロール、負の制御、または不明)。最後のプレート設定情報を図5に示します。
- サーモサイクリングが完了したら、完了した反応を液滴リーダーに移し、製造元の指示に従って読み取りプロセスを開始します。
7. 競合指数実験における細菌数の定量化
- 希釈gDNAをセクション4から定量し、上述したように適切な濃度に定量した。
- 適切なスーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、デジタルPCRの反応を準備します。テンプレートとしてステップ 7.1 の DNA を使用します。実験に存在する可能性のあるバーコードについては、プローブを含む20倍プライマープローブマスターミックス(FAMとHEXの両方を検出する場合はプローブ)を1つ使用します。
- 実験設計で使用されるすべてのバーコードが検出されるまで、異なる20倍プライマープローブマスターミックスを使用して、ステップ7.2のように追加のデジタルPCR反応を準備します。
- 6.3 で説明されているように、各条件のコントロールを含めます。これには、1) テンプレート コントロール (NTC)、2) 負のコントロール、および 3) 正のコントロールが含まれます。
- 手順 6.5~ 6.10 に説明するように、プロトコルを続行します。
8. デジタルPCRデータを分析し、絶対コピー数を計算する
- すべてのウェルが読み取られ、実行が完了したら、データ分析ソフトウェアを使用して .qlp データ ファイルを開きます。
注:ここで説明するファイルの種類とデータ分析手順は、1 つのデジタル PCR 製造元に固有のものです。代替デジタル PCR プラットフォームを使用する場合、ファイルの種類とデータ分析手順は使用するプラットフォームに固有であり、製造元の推奨仕様に従って実行する必要があります。 - 同じプライマープローブマスターミックスを使用するすべてのウェルを選択します。
- [液滴]タブで、各ウェルで分析された液滴の数(正と負の液滴の両方)を調べます。総液滴が10,000未満の井戸を分析から除外します。
- [1D 振幅]タブに移動し、正と負の液滴の振幅を調べます。2 つの異なる母集団で構成されていることを確認します。
- ソフトウェア内で、しきい値機能を使用して、使用された各プローブの正と負の液滴の間のカットオフを行います (図6)。
注:ステップ 5.3 から同じプライマー プローブ マスター ミックスを使用するすべてのウェルは、同じしきい値を持つ必要があります。 - 適切なしきい値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピーの数を計算します。データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析を容易にします。
注:データ分析ソフトウェアは、ポアソン分布に適合する正と負の液滴の数を使用して、コピー番号を決定します。 - ステップ 8.6 の値を使用して、サンプル内の各固有のゲノムバーコードの初期コピー数を計算します。負の対照反応からの平均偽陽性率を決定し、実験反応で得られた値からこの値を減算します。各実験の設定時に行われた希釈に基づいて、必要に応じて値を乗算します (表3)。
9. バーコード株のデジタルPCRベースの定量からCIまたはCOIを計算することにより、生物の相対適合性を決定する
- 次の式を使用してバーコード株のCIを計算します:出力は、特定の時点でのバーコード株の絶対定量であり、WT出力は同じでバーコードされた野生型細菌の絶対定量ですタイムポイント、A入力はバーコード株の入力接種の絶対定量であり、WT入力はバーコードされた野生型細菌の入力接種の絶対定量であり、X出力は、すべての株の合計である同じタイムポイント、X入力は、すべてのバーコードされた株の入力接種の合計です。
注:各数式の利点、欠点、および最も適切な使用方法については、説明を参照してください。
- すべてのタイムポイントでバーコードされたひずみごとにステップ 9.1 を繰り返します。
- 該当する場合は、次の式を使用してCOIを計算します:出力は、所定の時点で変異した遺伝子Aを有するバーコード株の絶対定量であり、AB出力はバーコード株の絶対定量です。変異遺伝子AとBを同時に持つA入力は、変異遺伝子Aを用いたバーコード株の入力接種の絶対定量であり、AB入力は入力イヌキュラムの絶対定量である変異遺伝子AとBを持つバーコード株のB出力は、所定の時点における変異遺伝子Bを持つバーコード株の絶対定量であり、B入力は入力の絶対定量である変異遺伝子Bを伴うバーコード株の接種
や
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Representative Results
この方法論を使用するには、ターゲットDNAを同定するために使用される各プローブの感度と特異性を検証するために適切な制御反応が実行される必要があります。この代表的な実験では、8つの固有のDNAバーコードを同定するための8つの対応するプローブで検証した。8つのプローブはすべて、NTCと陰性対照反応の両方で偽陽性の割合が低かった(表3)。各条件の感度を評価するために、一意のバーコードを含むgDNAを、残りの7つのバーコード配列のそれぞれを含むgDNAの一定の背景で連続的に希釈した。上記のアプローチでは、デジタルPCRは、ほぼ200万の類似DNA配列の背景にgDNAのコピーを2部も区別することができました(表3)。
各プローブとDNAバーコード配列の感度と特異性を決定することに加えて、検証研究で行われた希釈により、結果のデータからシミュレートされた競合指数を計算することができました。この実験には真の入力や出力はありませんでしたが、競技実験が行われたかのようにデータを分析することができます。これを行うには、シリアル希釈中の各混合物を希釈バーコードの出力(A出力)として考慮し、各歪みの合計出力(X出力)、入力(A入力)、および各歪みの合計入力(X入力)を計算します。すべてのバーコードが含まれている正のコントロールで定量化します。各混合物の希釈係数を用いて、理論CIを決定し、表3に報告する。各バーコードに対して実行された各希釈系列では、平均シミュレートされた CI が、重複する希釈系列ごとに標準偏差とともに報告されます。いずれの場合も、計算されたシミュレートされた CI は理論 CI に似ています。計算された C の大部分は、理論上の C から 25% 未満離しています。理論上の低いCの場合、計算値の偏差は2倍上向きであった。たとえば、これは理論 CI 0.000625 から計算された CI 0.001220 への変化を表します。これらのデータは、記述された方法が非常に正確かつ高精度であることを強調しています。高感度、特異性、精度、精度の組み合わせにより、このシステムは、それ以外の場合は気付かれない可能性のあるフィットネスの違いを確実に検出することができます。
ゲノムバーコードを正確に検出して定量できることを検証した後、インビトロ競技実験を行いました(表4)。最初の競技実験では、8つの野生型Sを利用した。それぞれが一意のDNAバーコードを含んでいたタイプムリウム株。各株は一晩で成長し、8つの培養物を同じ量で混合した。この混合接種の100 μLを用いて無菌LBブロスの4.9mLを接種し、得られた培養物を一定の攪拌で37°Cでインキュベートした。gDNAは、各株の正確な入力を計算するために接種から採取した。培養の成長は、600nm(OD 600)で吸光度を測定することによって監視した。OD600 = 0.5(対数相)で、各培養からサンプルを採取し、gDNAを採取した。残りの培養は、最終試料を採取してgDNA採取(静止)した8時間後まで一定の撹拌で37°Cに戻した。結果は、プールされた感染のために変更されたCI式を使用して計算された。予想通り、すべての野生型株は、CI値が1(表4)とほぼ等しかった。同様の競争実験は8つの変異体Sを用いて行った。単一、二重、またはトリプルトランスケトラーゼ欠乏に加えて、それぞれがユニークなバーコードを持っていたタイプムリウム株18.前に示したように、株はすべてLBブロスで同様に成長し、トリプルトランスケトラーゼ欠損株でわずかの遅れしか認められなかった。しかし、CIを分析して各株の増殖を評価したところ、トランスケトラーゼ欠損株に対してより深い欠陥が認められた(CIはShaw etal.18の成長曲線と比較した)。さらに、この実験では、単に成長パターンを定性的に記述するのではなく、各株の成長特性に定量化可能な値を割り当てることができました。各株のCIは、各株が野生型と比較された従来の式と、すべての入力株が考慮された修正式の両方を使用して計算されました。変化は小さかったが、トリプルトランスケトラゼ欠損株のCIは、すべてがほぼ野生型のフィットネスを示した他の6つの競合株を考慮していないため、従来の式では人工的に低かった。
| 株 | 遺伝子 | ソースまたは参照 |
| S.タイフィムリウム ATCC 14028s | ワイルドタイプ | ATCC |
| TT22236 | LT2サルモネラを運ぶ pTP2223 | (27) |
| DH5α | F– φ80lacZΔM15 Δ(lac ZYA-arg F)U169 recA1エンドA1 hsdR17(rK–,mK+) phoA upE44 λ–thi-1 gyrA96レルA1 | (28) |
| JAS18077 | putP::AA::FRT | この研究 |
| JAS18080 | putP::AD::FRT | この研究 |
| JAS18083 | putP::AG::FRT | この研究 |
| JAS18088 | putP::AL::FRT | この研究 |
| JAS18091 | putP::AO::FRT | この研究 |
| JAS18096 | putP::AT::FRT | この研究 |
| JAS18099 | putP::AW::FRT | この研究 |
| JAS18100 | putP::AX::FRT | この研究 |
| JAS18122 | ΔtktA::FRTプットP::AD::FRT | この研究 |
| JAS18130 | ΔtktB::FRTプットP::AL::FRT | この研究 |
| JAS18138 | ΔtktC::FRTプットP::AT::FRT | この研究 |
| JAS18125 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRTプットP::AG::FRT | この研究 |
| JAS18133 | ΔtktA::FRT ΔtktC::FRTプットP::AO::FRT | この研究 |
| JAS18141 | ΔtktB::FRT ΔtktC::FRTプットP::AW::FRT | この研究 |
| JAS18142 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRT ΔtktC::FRTプットP::AX::FRT | この研究 |
| プラスミド | ||
| pKD13 | ブラFRTアhp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) |
| pPCR スクリプト カム SK+ | ColE1 オリ;センチR | ストラタジーン/アリジェント |
| pTP2223 | プラムベットエキソテットR | (16) |
| pCP20 | bla 猫 cI857 PRflp pSC101 oriTS | (29) |
| pSKAP | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT | この研究 |
| pSKAP_AA | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;AA | この研究 |
| pSKAP_AD | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;広告 | この研究 |
| pSKAP_AG | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;AG | この研究 |
| pSKAP_AL | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;アル | この研究 |
| pSKAP_AO | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;AO | この研究 |
| pSKAP_AT | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;で | この研究 |
| pSKAP_AW | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;AW | この研究 |
| pSKAP_AX | ColE1 オリ;センチR;ブラFRTアhp FRT;アックス | この研究 |
表1:本研究で用いられる菌株及びプラスミド。
| 名前 | シーケンス (5' - 3')1,2,3 |
| pSKAP SDM AA - F | アガアグトクツットットットCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AA - R | アクカアカッカッカガガガクタクトCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AD - F | アガグカッグタグガッタグタッグCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AD - R | CCTACTATCACCTCCTCTCTCTTCTTCTTCTTCTTTTTTTTTCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AG - F | アグタグットグガグガグガグガCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AG - R | TCACATGCTCCCCCCACTCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AL - F | アッカカカスカッカグカッタクトCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AL - R | アガグタグットグットグトグツグツグツグトッグCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AO - F | GTCCACAACACCAACTCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AO - R | アグタッカクトガクトGTTGGGGCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AT - F | アッカグググトグトガッカタガタックCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AT - R | GTCTAGCCATGTGGGACACTGGTCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AW - F | アグダクトガットガットガCGCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AW - R | CGTCACCCCカキャキャットカクトカグトCGTCTCAAGAGGTAATTG |
| pSKAP SDM AX - F | アクタッグットグッタアガッカッカッグCGATTGTAGGGG |
| pSKAP SDM AX - R | カグクトグトグッタカカガタGTCTCAAGAGGTAATTG |
| M13 - F | GTAAAACGACGGCCAG |
| プットP組み換え - F |
タグッガッガガガッカッカッタッタッタッタッタッタッタッタッタッタッタッタッタ TGCAGCATTACACC |
| プットP組み換え - R |
タクグググッタッタットガアアカタッカッカッカッツェ CCTGCAGTTCGAAGTCC |
| qPCR バーコード領域増幅 - F1 | TGCAGCATTACACGTTTG |
| qPCR バーコード領域増幅 - R2 | タガアクトCGAAGCAGC |
| バーコード AA プローブ - FAM | 6-ファム/アガアグトク/禅/CTGCTTTTTGTGAGTC/IBFQ |
| バーコード AD プローブ - FAM | 6-ファム/アガグカッグ/禅/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ |
| バーコード AG プローブ - FAM | 6-ファム/アグタグGTC/禅/CTGGAGGAGCATGGGC/IBFQ |
| バーコード AL プローブ - FAM | 6-ファム/アガグタグ/禅/GCCTTCGATGTGTTC/IBFQ |
| バーコード AO プローブ - HEX | ヘックス/アグタツク/禅/ギャグGTGTTTGGGGGGGACC/IBFQ |
| バーコード AT プローブ - HEX | HEX/ACCAGTTC/禅/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
| バーコード AW プローブ - HEX | ヘックス/アグダクタグ/禅/TGATGTGGGTGACGC/IBFQ |
| バーコード AX プローブ - HEX | ヘックス/アクタCGTG/禅/GTGTAACGAGGGC/IBFQ |
|
1下線付きヌクレオチドは、SDM後にpSKAPに挿入される各DNAバーコードの相補配列を示す。 2二重下線付きヌクレオチドは、S上の相補的な領域を示す。アリル置換に使用されるタイプムリウム染色体。 3PrimeTime qPCRプローブは、5'蛍光色素(6-FAM)またはヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、内部クエンチャー(ZEN)、および3'クエンサーアイオワブラック®FQ(IBFQ)のいずれかで標識されたハイブリダイゼーションオリゴです。 |
|
表 2: 本研究で使用するプライマーとプローブ。
| 定量(コピー/20μL反応) | ||||||||
| 説明 | Aa | 広告 | Ag | アル | Ao | で | Aw | 斧 |
| Ntc | N/a | 0.000 | 0.000 | 3.510 | N/a | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.600 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.510 | 0.000 | 1.280円 | 1.180円 | 2.340の | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 2.290件 | 0.000 | 0.000 | 1.200の | 1.150の | 1.160分 | 0.000 | 0.000 |
| 意味 | 3.133 | 0.000 | 0.320 | 1.473の | 1.163の | 0.29000 | 0.000 | 0.000 |
| 負 | 5.130 | 1.156の | 0.000 | 1.124分 | 3.745から | 1.281件 | 7.354の | 7.142 |
| 負 | 5.270 | 0.000 | 0.000 | 1.087の | 1.666の | 1.643の | 7.746の | 2.269件 |
| 負 | 2.660の | 0.000 | 1.361の | 1.451の | 8.974件 | 0.000 | N/a | 0.000 |
| 負 | 6.090 | 0.000 | 0.000 | 2.251 | 0.000 | 2.531の | 8.700 | 3.495件 |
| 負 | 1.740の | 0.000 | 1.086円 | 2.130 | 4.171 | 0.000 | 7.113 | 5.522 |
| 負 | 6.220 | 3.581件 | 0.000 | 4.022 | 1.175の | 1.341の | N/a | 5.950件 |
| 意味 | 4.518件 | 0.789円 | 0.408円 | 2.011年 | 3.288件 | 1.133の | 7.728件 | 4.063から |
| 正 | 22281.540 22281 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
| 正 | 23989.676の | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660の | 47456.973の | 15096.601 | 47929.840の | 22455.234 |
| 正 | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820の | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270の | 21467.8402 |
| 正 | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473年 |
| 正 | 20218.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.9382 |
| 正 | 18531.740年 | 41620.801 | N/a | 48082.313から | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992から | 21117.559 |
| 意味 | 20652.601 | 42116.824の | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827から | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
| 空白の減算 | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
| 希釈されていない A | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305年 | 62844.068 | 27567.828 |
| 未希釈B | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
| 1/50 A | 521.670の | 755.035の | 1066.898 1066.898 | 1287.187 | 1053.339年 | 181.324年 | 1278.336年 | 580.961の |
| 1/50 B | 435.326の | 634.215 | 1168.087 | 1383.537年 | 991.040年 | 165.443の | 1180.445年 | 596.461の |
| 1/100 A | 228.028円 | 598.848の | 603.911 | 631.116 | 507.956の | 258.405の | 665.647 | 331.590台 |
| 1/100 B | 256.330の | 585.834の | 583.325の | 670.875の | 459.325台 | 289.207の | 638.916 | 307.948円 |
| 1/200 A | 121.283の | 305.293から | 258.247の | 346.965の | 234.774の | 114.163年 | 169.055年 | 172.553年 |
| 1/200 B | 114.638円 | 313.040 | 253.685の | 297.216の | 191.637年 | 179.895年 | 280.989の | 147.297年 |
| 1/400 A | 42.829の | 141.343年 | 127.337年 | 163.605年 | N/a | 71.241の | 157.697の | 85.976の |
| 1/400 B | 59.544の | 180.543年 | 162.080円 | 162.108年 | 115.508円 | 104.682円 | 151.141 | 87.804円 |
| 1/800 A | 34.304 | 67.934の | 65.939 | 83.857の | 66.134 | 31.784の | 82.722の | 45.616の |
| 1/800 B | 20.390年 | 80.222円 | 81.453円 | 85.325円 | 53.102 | 38.034円 | 55.460の | 29.660の |
| 1/1600 A | 15.405年 | 44.505 | 47.672の | 39.613の | 33.027 | 18.006円 | 37.655の | 20.988円 |
| 1/1600 B | 22.091の | 48.828円 | 46.781円 | 37.388円 | 30.245の | 30.138円 | 34.553の | 19.795年 |
| 1/3200 A | 12.333年 | 22.104年 | 16.850円 | 18.403年 | 11.460の | 10.535年 | 21.245の | 9.218件 |
| 1/3200 B | 6.796件 | 32.555の | 15.742年 | 26.249の | 15.111年 | 9.908件 | 23.393の | 10.175年 |
| 空白の減算 | ||||||||
| 希釈されていない A | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
| 未希釈B | 18273.655年 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860の | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
| 1/50 A | 517.152の | 754.246の | 1066.490の | 1285.176 | 1050.051 | 180.192年 | 1270.607年 | 576.898の |
| 1/50 B | 430.808円 | 633.426 | 1167.679年 | 1381.526年 | 987.751で | 164.311年 | 1172.717 | 592.398の |
| 1/100 A | 223.509の | 598.059の | 603.503 | 629.105 | 504.668円 | 257.272の | 657.918 | 327.527の |
| 1/100 B | 251.812の | 585.044の | 582.918の | 668.864 | 456.036の | 288.074円 | 631.187 | 303.885円 |
| 1/200 A | 116.765年 | 304.503 | 257.840の | 344.954の | 231.486の | 113.030年 | 161.327年 | 168.490年 |
| 1/200 B | 110.120年 | 312.251 | 253.277の | 295.205 | 188.348円 | 178.762円 | 273.261 | 143.234年 |
| 1/400 A | 38.310円 | 140.554の | 126.929年 | 161.594の | N/a | 70.108円 | 149.968円 | 81.913の |
| 1/400 B | 55.026の | 179.753の | 161.672の | 160.097年 | 112.219年 | 103.549 | 143.413年 | 83.741の |
| 1/800 A | 29.786円 | 67.145 | 65.531 | 81.847の | 62.846の | 30.651の | 74.994の | 41.553の |
| 1/800 B | 15.872円 | 79.433の | 81.045円 | 83.314円 | 49.813の | 36.901 | 47.732の | 25.596の |
| 1/1600 A | 10.886円 | 43.716の | 47.264の | 37.602の | 29.739の | 16.874円 | 29.927の | 16.925年 |
| 1/1600 B | 17.573年 | 48.039円 | 46.373の | 35.377の | 26.957の | 29.005の | 26.825の | 15.732年 |
| 1/3200 A | 7.815件 | 21.314の | 16.442の | 16.392年 | 8.172件 | 9.402件 | 13.517年 | 5.155 |
| 1/3200 B | 2.278件 | 31.765の | 15.334年 | 24.238円 | 11.822円 | 8.776件 | 15.664の | 6.112 |
| シミュレートされた CI | ||||||||
| 希釈されていない A | 1.114895 | 1.055372 | 1.321619 | 1.114419 | 1.285650 | 1.176251 | 1.316329 | 1.294932 |
| 未希釈B | 0.885005 | 0.837016 | 1.220911 | 1.439279 | 0.999312 | 1.019279 | 1.272698 | 1.248618 |
| 1/50 A | 0.025046 | 0.017909 | 0.023931 | 0.028018 | 0.024348 | 0.011675 | 0.026617 | 0.027102 |
| 1/50 B | 0.020864 | 0.015040 | 0.026202 | 0.030118 | 0.022903 | 0.010646 | 0.024567 | 0.027831 |
| 1/100 A | 0.010825 | 0.014200 | 0.013542 | 0.013715 | 0.011702 | 0.016669 | 0.013782 | 0.015387 |
| 1/100 B | 0.012195 | 0.013891 | 0.013080 | 0.014582 | 0.010574 | 0.018665 | 0.013222 | 0.014276 |
| 1/200 A | 0.005655 | 0.007230 | 0.005786 | 0.007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
| 1/200 B | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0.011582 | 0.005724 | 0.006729 |
| 1/400 A | 0.001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | N/a | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
| 1/400 B | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
| 1/800 A | 0.001443 | 0.001594 | 0.001470 | 0.001784 | 0.001457 | 0.001986 | 0.001571 | 0.001952 |
| 1/800 B | 0.000769 | 0.001886 | 0.001819 | 0.001816 | 0.001155 | 0.002391 | 0.001000 | 0.001203 |
| 1/1,600 A | 0.000527 | 0.001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
| 1/1,600 B | 0.000851 | 0.001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0.001879 | 0.000562 | 0.000739 |
| 1/3,200 A | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 |
| 1/3,200 B | 0.000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
| 平均CI(理論) | ||||||||
| 未希釈 (1) | 0.999950 | 0.946194 | 1.271265 | 1.276849 | 1.142481 | 1.097765年 | 1.294514 | 1.271775 |
| 1/50 (0.02) | 0.022955 | 0.016474 | 0.025067 | 0.029068 | 0.023625 | 0.011161 | 0.025592 | 0.027466 |
| 1/100 (0.01) | 0.011510 | 0.014046 | 0.013311 | 0.014148 | 0.011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0.014832 |
| 1/200 (0.005) | 0.005494 | 0.007322 | 0.005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
| 1/400 (0.0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0.00260* | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
| 1/800 (0.00125) | 0.001106 | 0.001740 | 0.001645 | 0.001800 | 0.001306 | 0.002188 | 0.001285 | 0.001577 |
| 1/1,600 (0.000625) | 0.000689 | 0.001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0.001486 | 0.000594 | 0.000767 |
| 1/3,200 (0.000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
| 標準偏差 | ||||||||
| 原液 | 0.11494 | 0.109180円 | 0.05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0.02182 | 0.02316 |
| 1/50 | 0.00209 | 0.00143 | 0.00114 | 0.00105 | 0.00072 | 0.00051 | 0.00103 | 0.00036 |
| 1/100 | 0.00069 | 0.00015 | 0.00023 | 0.00043 | 0.00056 | 0.00100 | 0.00028 | 0.00056 |
| 200/1 | 0.00016 | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0.00213 | 0.00117 | 0.00059 |
| 400/1 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 | 0.00002 | 0* | 0.00108 | 0.000077 | 0.00004 |
| 800/1 | 0.00034 | 0.00015 | 0.00017 | 0.00002 | 0.00015 | 0.00020 | 0.00029 | 0.00037 |
| 1/1,600 | 0.00016 | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 | 0.00003 | 0.00039 | 0.00003 | 0.00003 |
| 1/3,200 | 0.00013 | 0.00012 | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 | 0.00002 | 0.00002 |
| *単一の実験の結果を表します。 | ||||||||
表 3: 絶対定量とシミュレートされた CI 計算。
| 条件 | 競争指数1 | |||||||
| 実験 1 | ||||||||
| WTAA | WT広告 | WTAG | WTAL | WTAO | WTアット | WTAW | WTAX | |
| 対数 | 0.927 ± 0.033 | 0.992 ± 0.031 | 1.068 ± 0.025 | 0.921 ± 0.02 | 1.044 ± 0.03 | 1.051 ± 0.057 | 1.094 ± 0.027 | 0.929 ± 0.005 |
| 静止 | 1.1 ± 0.021 | 1.071 ± 0.053 | 1.079 ± 0.065 | 0.948 ± 0.02 | 0.98 ± 0.02 | 0.873 ± 0.044 | 0.97 ± 0.056 | 1.021 ± 0.007 |
| 実験2 | ||||||||
| CI (トラディショナル) | WTAA | ΔAAD | ΔBAL | ΔCAT | ΔABAG | ΔACAO | ΔBCAW | ΔABCAX |
| 対数 | 1 ± 0 | 0.802 ± 0.084 | 0.957 ± 0.02 | 0.989 ± 0.073 | 0.581 ± 0.153 | 0.86 ± 0.053 | 0.995 ± 0.011 | 0.695 ± 0.061 |
| 静止 | 1 ± 0 | 0.97 ± 0.063 | 1.043 ± 0.058 | 0.99 ± 0.036 | 1.625 ± 0.589 | 0.835 ± 0.051 | 0.912 ± 0.047 | 0.477 ± 0.049 |
| CI (プールされたイノクシム) | ||||||||
| 対数 | 1.114 ± 0.039 | 0.864 ± 0.074 | 1.073 ± 0.032 | 1.1 ± 0.068 | 0.633 ± 0.152 | 0.938 ± 0.056 | 1.111 ± 0.043 | 0.746 ± 0.06 |
| 静止 | 1.078 ± 0.039 | 1.039 ± 0.049 | 1.166 ± 0.093 | 1.066 ± 0.01 | 1.735 ± 0.613 | 0.876 ± 0.035 | 0.97 ± 0.045 | 0.49 ± 0.047 |
| 1値は、3つまたは4つの反復実験の平均CI±標準偏差を表します。 | ||||||||
表4:S間のインビトロ競争の代表的な結果。チフィムリウム株。
表 S1.追加のバーコード配列およびそれに対応する蛍光プローブを作成するためのオプションのプライマー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図 1.pSKAP の生成。(A)精製pKD13は、HindIII及びBamHIを用いて制限消化を行った。(B, C)FRTフランクカナマイシン耐性遺伝子を含む目的の1,333bp断片を精製した。(D) pPCRスクリプトカムSK+もHindIIIおよびBamHIで消化され、pKD13(B)からの断片をライゲーションして(E)pSKAPを生成した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:pSKAPに対する挿入部位指向変異体症。(A)位置725における25bpDNAバーコードの挿入は、PCRを用いて行った。その位置に特異的な前方および逆プライマーは、相補的な25-ヌクレオチド5'拡張子を用いて設計された(プライマーで小文字「a」として示される)。(B) SDMから生じる一般的なpSKAP_Barcodeプラスミドは、挿入されたDNAバーコードの位置をオレンジ色で強調表示して示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:putPの下流の染色体再配置。(A) λ-Red媒介再組み合わせ後、FRT部位(灰色)によって横たわる選択可能なカナマイシン耐性遺伝子(濃い紫色)が示された遺伝子座間の染色体に挿入される(染色体再結合部位、赤色)。ユニークなDNAバーコード(オレンジ)はFRT部位のすぐ外側に挿入されます。(B)カナマイシン耐性遺伝子はFRT媒介切除によって除去され、DNAバーコードとFRT瘢痕からなる染色体上に挿入されたDNAの残骸(総挿入DNA、青色)を残す。(C)挿入されたDNAを取り巻く改変染色体DNA配列を、デジタルPCRに用いられる増幅プライミング部位(薄紫色)とともに示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:蛍光プローブの感度および特異性を検証するための希釈スキーム。(A)7つのバーコード株から精製されたgDNAを同量に混合し、省略されたバーコードgDNA(上記の例ではAX)を希釈するための希釈剤を作成する。(B) 前述の調製希釈剤を用いて、省略されたバーコードgDNA(上記の例ではAX)のシリアル希釈を行う。次のチューブに移す前に、各チューブの内容物を十分に混ぜます。図 4 は BioRender を使用して作成されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:プライマープローブセット1および2の感度および特異性を分析するためのプレートレイアウト。デジタル PCR 実験には、NTC、正のコントロール、負のコントロール、およびテストされた各バーコードの希釈スキームが含まれます。プライマープローブセット3,4を検証するためのプレートは、適切なバーコードgDNAを用いて同じパターンにレイアウトされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:希釈されたAAバーコードgDNAの代表的なデジタルPCR結果。AAバーコードを含むgDNAは、図4に記載されている他のすべてのバーコードgDNAの背景で希釈された。チャネル 1 は AA バーコード(トップ パネル)の FAM プローブを表し、チャネル 2 は AO バーコード(下部パネル)の HEX プローブを表します。各プローブの結果は、個々の液滴蛍光振幅(左パネル)と、選択されたウェル内のすべての液滴の蛍光強度の頻度を表すヒストグラム(右パネル)の両方として提示される。各条件について、陽性(高蛍光)および陰性(低蛍光)液滴は2つの異なる集団を形成する必要があります。希釈されたAAの場合、ほとんどの液滴が陰性であった場合、ヒストグラム(右上パネル)は単一の母集団のみを描写しているように見える。これは、正の液滴が負の液滴によって実質的に上回っているためです。しかし、左パネルの液滴蛍光振幅を調べることによって、2つの異なる集団が依然として見える。 母集団は、正と負の液滴(ピンクの線で視覚化)を定義するためにしきい値機能を使用して分離する必要があります。しきい値は使用されたプローブによって異なりますが、同じプローブミックスを使用するすべてのウェルは同じしきい値を持つ必要があります。AAバーコードgDNAが希釈されると、陽性(高蛍光)液滴の減少が認められており、陽性AO液滴の数はバックグラウンドで一定のままである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微生物を正確に定量化する能力は微生物学の研究にとって最も重要であり、初期混合集団からユニークな株を列挙する能力は、細菌。しかし、これを実現する技術は、分子生物学の近代的な発展に伴って進歩していません。Sを含む多くの細菌の染色体を容易に改変する技術である。Typhimuriumは、ほぼ二十年14のために利用可能であったが、この能力は、ユニークなDNA配列を有する分子タグ付け株のためにほとんど利用されていない。細菌染色体に挿入されたユニークで最小限に抑えたDNAバーコードに基づいて容易に識別可能な株を作成する能力を利用することにより、これらの分子識別子を検出し、定量する最先端の技術と組み合わせる(すなわち、デジタルPCR)は、細菌の多様な集団内で個々の株を容易に定量するための絶妙な感度、特異性、精度、精度を提供するシステムを作成しました。
上記のように、CIとCOIを計算することは、細菌染色体に対して適切な改変を正確に行う能力に依存する。すべての変更は、ランダムな突然変異が発生していないことを確認するために、Sanger シーケンスによって検証する必要があります。高忠実度ポリメラーゼの使用は、これらのエラーを最小限に抑えますが、このような突然変異が起こる場合、このプロトコルのもう一つの重要な側面である株を検出する能力を損ないます。デジタルPCRは、200万近くのバックグラウンドで2つのgDNAコピーを検出できることを実証しましたが、この範囲外の株は、正確な定量のために追加の希釈を必要とする可能性があります。さらに、DNAバーコード配列は、高品質のプローブ配列の使用を容易にするように設計する必要があります。プローブシーケンスは、自己薄暗化、ヘアピンの形成、またはターゲットのバインドを効果的に行う傾向について分析する必要があります。品質シーケンスとプローブを使用することの重要性は、各プローブで実行する必要がある慎重な検証実験によって証明される事実を最小限に抑えることはできません。最適なDNAバーコードを作成する取り組みは、最適なデジタルPCR定量結果を生み出します。
慎重に設計された分子タグは、品質結果を得るために重要ですが、結果を解釈することは、このプロトコルのもう一つの重要な側面です。CIは、出力中の変異株と野生型株との比率を入力1、19、20の2株の比率で割ったものとして定義される。セクション9で提示されるこの伝統的なCIは、混合感染が野生型に対して1株のみで構成されている場合に有用である。しかし、培温または動物を接種するために株の大きなプールを使用する場合、株は野生型に対してだけでなく、接種に存在する他のすべての株に対しても競合しています。複数の感染株を使用して競争実験を行った以前の研究は、彼らの計算7、13でこれを考慮に入れることができなかった。混合感染のこの機能を考慮して、プールされた感染のために変更されたCIを計算する式を導入しました。すべての株が野生型株と同じレベルの競争を提供する可能性は低いです。しかし、ほとんどの細菌遺伝子はウイルスにほとんど影響を与えないため、競合指数実験で使用される菌株の数が増えるにつれて、全体的なウイルスが野生型株に向かう可能性が高くなります。これは、既知のウイルスの欠陥を持つすべての多くの株のプールを使用して、特定の実験計画の場合は必ずしもそうではないかもしれません。ただし、結果の豊富な株 (フィット感が低い) は X出力に対する影響が小さいため、これは修正された方程式で説明されます。特定の実験計画によっては、一方または他方の式が好ましい場合がある。しかし、プール感染を伴うほとんどの場合、混合感染では、すべての株が野生型に対してだけでなく、互いに競合することを考慮することが重要です。結果を分析する際には、各式の背後にある理論的根拠が、歪みフィットネスの最も正確な解釈を行うために十分に理解されていることが重要です。結果を報告する場合、データの分析方法を正確に開示することが同様に重要です。
プロトコルのセクション9には、COIを用いて遺伝子相互作用を決定するのに役立つ式も含まれています。この分析により、2つのウイルス遺伝子が独立して動作するか、一緒に動作するかを予測することができます。COIは、出力中の単一変異株に対する二重変異株の比率を入力1における2株の比率で割ったものとして定義される。式は、遺伝子破壊のフェトチピック付加性を検出するように設計されています。遺伝子がウイルス性を高めるために独立して機能する場合、両方の遺伝子の破壊は、いずれかの遺伝子単独の単一の破壊と比較して、フィットネスの大きな低下を引き起こすはずです。もし遺伝子が一緒に機能してウイルス性を高める(経路内の2つの酵素をコードする遺伝子など)場合、どちらの遺伝子の破壊も、両方の遺伝子を破壊するのと同じ影響を及ぼすはずです。単一の遺伝子によって引き起こされる減衰のレベルが非常に高いか非常に低い場合には、先取り性の付加性を検出することは困難な場合があります。それにもかかわらず、同じ動物系内の株の直接比較は、遺伝子間の機能的関係のより少ない変動性とより信頼性の高いアカウントを提供し、この計算は、より大きな混合集団内の2つの株から行うことができます。
結果を解釈するための最後の重要な側面は、人口動態の影響を考慮することです。複数の株を持ついくつかの混合感染症では、単一の株は、ランダムな集団のドリフトのために、より支配的またはより少ないフィットとして出現することがあります。この現象は、ボトルネック イベントが発生したときに増幅できます。これは、非常に多数の入力株、接種における全細菌の非常に少数、またはその両方の組み合わせを使用して起こることができます。混合感染から生じるもう一つの干渉的な側面は、トランス補体の可能性である。これは、野生型のようなフィット株が人工的にフィット株のウイルス性を高める場合に発生します。この仮定の例は、Sの適合性を比較することです。チフィムリウム病原性島2(SPI2)ノックアウト株は野生型株と共感染した。SPI2 はSを有効にします。チフィムリウムは、マクロファージ内のファゴソームを修飾する宿主サイトゾールにエフェクターを分泌することによって細胞内で生き残る。このシステムの中断は、Sを作る.チフィムリウムは細胞内殺の影響を受けやすい。しかし、マクロファージは一度に2つ以上の細菌を巻き込むことができるので、SPI2ノックアウトは野生型Sと同じマクロファージに存在する場合、フィットネスのかなりの増加を受ける可能性があります。 宿主サイトゾルにエフェクターを分泌するチフィムリウム。ランダムな集団ダイナミクスとトランス補数の可能性は、あらゆる競争実験の限界です。トランス補体が疑われる場合は、適合性を評価するために他の相補的な方法を使用して型を確認する必要があります。ランダムな母集団のダイナミクスを克服するために、反復実験の数を増やすと、結果の外れ値を特定する可能性が高くなります。幸いなことに、上記のプロトコルは、実験条件の数が大幅に減少するため、同一の反復実験の数を増やすことを容易にします。
上記のCI技術の重要な要素は、ほぼすべての生物に適応する能力と微生物の正確な定量を必要とする任意の実験設計です。しかし、染色体にユニークなDNA配列を組み込むためには、生物の遺伝子操作が必要です。この技術の適応性は、種が遺伝的に可鍛性であることを必要とし、ゲノムを改変するための代替プロトコルの生成に依存する(ステップ1および2)。表 2およびS1に記載されている DNA バーコードは、ほとんどの細菌に対して十分です。しかし、すべての定量的なPCR実験と同様に、単純なBLAST分析によってプライマーとプローブのオフターゲット結合の可能性を最小限に抑えるために細菌ゲノムを分析することが適切です。本研究で使用されるDNAバーコード配列は、場合によっては3~4塩基のみで異なり、非特異的結合の可能性を最小限に抑えるプローブの絶妙な特異性を強調しています。蛍光プローブの特異性にかかわらず、すべての新しいバーコード配列は、ステップ6で説明されているように、感度と特異性について適切に検証する必要があります。バーコード株を作成した後、上記のようにインビトロ競合アッセイ以外の多くの種類の実験にこのプロトコルを適応させることが可能である。株は、マウスまたは他の動物モデルシステムにおける生体内競争アッセイに適しています。動物の臓器や組織からgDNAを抽出するために必要な最小限の修飾のみが必要であり、これらの修飾は、そのような目的のためにキットのメーカーによってよく説明されています。さらに、生体内競争のための混合感染の大規模なプールは、以前7をうまく利用され、単一の実験に必要な動物の数を減らす可能性を提供し、それらの実験のコストを削減するだけでなく、動物と動物の変動の可能性も減少します。同様に、バーコード株は、様々な治療条件(例えば、抗生物質、酸感受性、活性酸素または窒素種による死亡など)に対する株の感受性を調べる他のインビトロアッセイに使用することができる。これらの実験では、ステップ3.4で所望の化学物質を増殖培地に添加し、記載されているように進むことで成長阻害を評価することができる。細菌死を評価するために、株の大きなプールを混合することができ、入力は上記のように定量化された。所望の治療にさらされた後、生細胞を選択的に定量することができ、生細胞と死細胞21、22、23を分化するために、生存PCR定量手順を生存率PCRと結合させることによって、選択的に定量することができる,24歳,25名,26.このような実験のスループットは、各株の希釈およびレプリカプレートがより合理化された分子技術に置き換えられるため、劇的に増加するだろう。最後に、進化生物学と集団遺伝学の解析は本論文の範囲を超えていますが、バーコード化された生物は、このような研究に非常に適応性があります。 最終的に、このプロトコルの目的は、多くの多様な種および多くの種類の実験での使用に非常に適応可能な細菌を定量するための強力な技術を開発することであった。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、ジョージ・F・ハディックス学長の教員研究基金と国立衛生研究所(NIH)の賞番号GM103427の下で国立一般医学研究所によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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