Summary
Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella; tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.
Abstract
Un indice competitivo è un metodo comune utilizzato per valutare la forma fisica batterica e/o la virulenza. L'utilità di questo approccio è esemplificata dalla sua facilità di esecuzione e dalla sua capacità di standardizzare la forma fisica di molti ceppi per un organismo di tipo selvaggio. La tecnica è limitata, tuttavia, dai marcatori fenotipici disponibili e dal numero di ceppi che possono essere valutati simultaneamente, creando la necessità di un gran numero di esperimenti di replica. In concomitanso con un gran numero di esperimenti, i costi di lavoro e materiali per quantificare i batteri basati su marcatori fenotipici non sono insignificanti. Per superare questi aspetti negativi pur mantenendo gli aspetti positivi, abbiamo sviluppato un approccio molecolare per quantificare direttamente i microrganismi dopo aver progettato marcatori genetici su cromosomi batterici. Unico, 25 coppia di base codici a barre DNA sono stati inseriti in un locus innocuo sul cromosoma di ceppi selvatici e mutanti di Salmonella. Gli esperimenti di competizione in vitro sono stati eseguiti utilizzando inocula costituiti da ceppi in pool. In seguito alla competizione, il numero assoluto di ogni ceppo è stato quantificato utilizzando la PCR digitale e gli indici competitivi per ogni ceppo sono stati calcolati in base a tali valori. I nostri dati indicano che questo approccio alla quantificazione della Salmonella è estremamente sensibile, preciso e preciso per rilevare sia i microrganismi altamente abbondanti (alta forma fisica) che rari (bassa forma fisica). Inoltre, questa tecnica è facilmente adattabile a quasi tutti gli organismi con cromosomi in grado di modificarsi, nonché a vari progetti sperimentali che richiedono la quantificazione assoluta dei microrganismi.
Introduction
Valutare la forma fisica e la virulenza degli organismi patogeni è un aspetto fondamentale della ricerca microbiologica. Consente di confrontare tra ceppi o tra organismi mutati, il che consente ai ricercatori di determinare l'importanza di determinati geni in condizioni specifiche. Tradizionalmente, la valutazione della virulenza utilizza un modello animale di infezione utilizzando diversi ceppi batterici e osservando l'esito dell'animale infetto (ad esempio Contagiosa50, Dose letale50, tempo a morte, gravità dei sintomi, mancanza di sintomi, ecc.). Questa procedura fornisce preziose descrizioni della virulenza, ma richiede che i ceppi causino notevoli differenze nei risultati al fine di rilevare variazioni da wild-type. Inoltre, i risultati sono semi-quantitativi perché mentre la progressione della malattia e la gravità dei sintomi possono essere soggettivamente quantificate nel tempo, l'interpretazione della virulenza rispetto al tipo selvaggio è più qualitativa (cioè più, meno o ugualmente virulenzia). Un'alternativa comune ai saggi di infettività degli animali per animali di esecuzione consiste nel generare indici competitivi (CI), valori che confrontano direttamente la forma fisica o la virulenza di un ceppo con una controparte di tipo selvatico in un'infezione mista1. Questa tecnica ha numerosi vantaggi rispetto a un modello animale tradizionale di infezione standardizzando la virulenza su un ceppo di tipo selvatico e determinando un valore quantificabile per riflettere il grado di attenuazione. Questa tecnica può anche essere adattata per analizzare le interazioni geniche nei batteri determinando un indice competitivo cancellato (COI)2. Il calcolo di un COI per un gruppo di organismi mutati consente ai ricercatori di determinare se due geni contribuiscono in modo indipendente alla patogenesi o se sono coinvolti nella stessa via di virulenza e dipendono l'uno dall'altro. Inoltre, il calcolo di una CI richiede l'enumerazione di batteri che possono fornire preziose informazioni sulla patogenesi degli organismi. Cite e COI consentono inoltre ai ricercatori di valutare ceppi avirulenti che non causano malattie cliniche ma hanno ancora differenze di forma fisica. Questa tecnica è limitata dall'uso di marcatori di resistenza agli antibiotici tradizionali per identificare i ceppi, limitando così il numero di ceppi di ingresso a uno o due alla volta. A causa di questa limitazione, è necessario un gran numero di gruppi sperimentali e repliche, che oltre ad aumentare i costi di manodopera e materiali, aumenta anche le opportunità di variabilità in condizioni sperimentali e risultati imprecisi. (Per un esame approfondito dei benefici e delle applicazioni dell'uso di infezioni miste per studiare la virulenza, la forma fisica e le interazioni geniche, vedere C.R. Beuzàn e D.W. Holden 1)
Si è cercato di superare questa limitazione, come l'uso di cellule fluorescenti quantificate tramite citometria di flusso3,4,5. Questa tecnica quantifica le cellule utilizzando 1) etichettate anticorpi contro i marcatori fenotipici o 2) prodotte endogenamente proteine fluorescenti. L'uso di anticorpi etichettati ha un limite di rilevamento di 1.000 cellule /mL, e quindi richiede un numero elevato di cellule per analizzare3. Le cellule che esprimono proteine fluorescenti hanno una fisiologia alterata e sono suscettibili ai cambiamenti di fitness derivanti dall'espressione ad alte proteine6. Entrambi i metodi sono limitati dal numero di marcatori fluorescenti rilevabili utilizzando la citometria di flusso. Un progresso nella quantificazione molecolare è stato raggiunto attraverso lo sviluppo di una tecnica di microarray che ha rilevato l'attenuazione in 120 ceppi da un'infezione mista iniziale di oltre 1.000 ceppi in un modello murino7. Questa tecnica ha utilizzato un'analisi microarray dell'RNA da ceppi mutati, che portano a una notevole variabilità nel risultato. Tuttavia, ha stabilito che grandi pool di infezioni miste possono essere uno strumento utile e che utilizzando tecniche di rilevamento sensibili, possono essere identificate differenze nella virulenza batterica. Con lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione, Tn-seq ha ampliato l'utilità delle mutazioni trasposoni, consentendo un potente metodo per quantificare i batteri che sono stati mutati casualmente8,9,10, 11. Recentemente è stato sviluppato un protocollo alternativo che elimina la necessità di trasposoni e utilizza invece i codici a barre del DNA per identificare e monitorare più facilmente i cambiamenti genomici e il loro impatto sulla forma fisica12. Questa tecnologia è un importante progresso, ma l'inserimento dei codici a barre genomici è ancora un processo casuale. Per superare la casualità degli esperimenti precedenti, Yoon e altri hanno sviluppato un metodo per calcolare i ceppi di Codi di Salmonella utilizzando codici a barre specifici del DNA inseriti in posizioni precise sui cromosomi dei batteri13. Sono stati rilevati ceppi in codice a barre unici utilizzando un metodo basato su qPCR con verde SYBR e primer specifici per ogni codice a barre univoco. La tecnica era limitata da vincoli imposti da qPCR, comprese le differenze nell'efficienza dei primer e dalla bassa sensibilità, evidenziate dalla necessità di pcR nidificati prima di qPCR. Tuttavia, questo approccio ha dimostrato che le modifiche genomiche mirate potrebbero essere sfruttate per rilevare e potenzialmente quantificare pool di ceppi batterici multipli.
Nel seguente protocollo, descriviamo una nuova metodologia per eseguire esperimenti di competizione batterica con grandi pool di inocua misti seguiti da una quantificazione accurata utilizzando una tecnica PCR digitale altamente sensibile. Il protocollo prevede ceppi batterici geneticamente etichettanti con un codice a barre DNA unico inserito su una regione innocua del cromosoma. Questa modifica consente di quantificare rapidamente e con precisione i ceppi utilizzando la moderna tecnologia molecolare invece delle tradizionali diluizioni seriali, la placcatura delle repliche e il conteggio delle unità formanti della colonia che si basano su marcatori fenotipici (cioè la resistenza agli antibiotici ). Le modifiche consentono la valutazione simultanea di molti ceppi in un unico inoculo raggruppato, riducendo sostanzialmente la possibilità di variabilità sperimentale perché tutti i ceppi sono esposti alle stesse condizioni esatte. Inoltre, mentre questa tecnica è stata sviluppata in Salmonella enterica sierovar Typhimurium, è altamente adattabile a qualsiasi organismo geneticamente malleabile e quasi qualsiasi progetto sperimentale in cui sono necessari conteggi batterici accurati, fornendo un nuovo strumento per aumentare la precisione e la produttività nei laboratori di microbiologia senza i vincoli imposti dai metodi precedenti.
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Protocol
1. Incorporare codici a barre unici del DNA su un plasmide contenente i componenti necessari per lo scambio allelico
NOT: È stato creato un nuovo plasmide, denominato pSKAP, con un numero di copie elevato e una maggiore efficienza di trasformazione rispetto al plasmide di scambio allelico pKD13 esistente. Questa operazione è descritta nei passaggi 1.1-1.12 (Figura 1). I plasmidi finalizzati contenenti codici a barre e componenti specifici del DNA per lo scambio allelico sono disponibili attraverso un deposito plasmico (Tabella dei materiali).
- Utilizzando un kit di miniprep plasmida commerciale, purificare pKD1314 e pPCR Script Cam SK- da colture batteriche overnight coltivate in luria-Bertani (LB) brodo integrato con 50g/mL kanamycin o 25 g /mL chloramphenicol (per pKD13 e pPCR Cam Script Rispettivamente la Chiave MAIUSCOLA) (Tabella 1).
- Eseguire digestione di restrizione su entrambi i plasmidi utilizzando enzimi di restrizione commerciale HindIII e BamHI secondo le specifiche del produttore.
- Rimuovere gli enzimi di restrizione e il DNA asciso dalla reazione pPCR Script Cam SK e purificare la spina dorsale plasmid della coppia di 3.370 basi (bp) utilizzando un kit di pulizia del DNA disponibile in commercio secondo le specifiche del produttore.
- Separare i frammenti dalla digestione di restrizione pKD13 su un gel di agarose 1% utilizzando una camera di elettroforesi.
- Visualizzare le bande utilizzando un transilluminatore di luce blu e accisare il frammento di 1.333 bp dal gel (Figura 1C).
NOT: Questo frammento contiene il gene di resistenza alla kanamicina fiancheggiato da FRT necessario per la sostituzione allelica cromosomica. - Purificare il DNA asciso dal punto 1.5 utilizzando un kit di estrazione gel commerciale.
- Per creare pSKAP, legarsi il frammento purificato da pKD13 (dal punto 1.6) a pPCR Script Cam SK (dal punto 1.3) utilizzando una legature commerciali del DNA T4 secondo le specifiche del produttore.
- Trasformare le cellule DH5 chimicamente competenti con il plasmid pSKAP ligate seguendo il protocollo del produttore (Tabella1).
- Stendere i trasformativi su piastre di agar LB completate con 50 g/mL di kanamycin e incubare a 37 gradi durante la notte.
- Scegli una colonia dal piatto e striscia su una nuova piastra di agar LB integrato con 50 g / mL kanamycin e incubare a 37 gradi durante la notte. Scegli una colonia da questo piatto e usa per inoculare il brodo LB integrato con 50 g/mL di kanamicicina. Incubare la coltura durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
- Utilizzare un kit commerciale di miniprep plasmico per purificare pSKAP dalla coltura batterica durante la notte.
- Eseguire una digestione diagnostica della restrizione del plasmide dal passaggio 1.11 utilizzando Hind III e Bam HI in base alle specifiche del produttore. Visualizza i frammenti su un gel di agarose dell'1% come nei passi 1.4-1.5.
NOT: La dimensione totale del pSKAP deve essere 4.703 bp. Frammenti dopo il passaggio 1.12 deve essere 3.370 e 1.333 bp. - Progettare i primer PCR per la mutagenesi indirizzata al sito di inserimento (SDM) (Tabella 2 e S1) in modo da inserire una sequenza di DNA unica di 25 coppie di basi nella posizione 725 di pSKAP (Figura 2).
NOT: Il DNA del codice a barre viene inserito nel plasmide appena fuori dal gene di resistenza alla kanamica, quindi il codice a barre non viene perso durante la successiva rimozione della cassetta di resistenza alla kanamica. Se si generano nuove sequenze di codici a barre, utilizzare strumenti online per garantire che le sonde PCR specifiche del bersaglio con etichetta fluorescente (in seguito denominate semplicemente "probe") si leghino in modo efficiente alla nuova sequenza. Le sequenze di inserimento progettate in data, insieme ai primer necessari per crearle, sono disponibili nelle tabelle 2 e S1. - Preparare le reazioni SDM utilizzando una polimerasi di DNA adalta fedeltà commerciale, le coppie di primer desiderate (Tabella 2) e il modello pSKAP. Impostare il termociclore in modo che esegua le seguenti operazioni: 1) 98 Gradi centigradi per 30 s, 2) 98 S per 10 s, 56 S per 15 s, 72 gradi centigradi per 2 min, 3) ripetere i passaggi 2, 24, 4) 72 Gradi centigradi per 5 min, 5) tenere a 4 gradi centigradi.
- Dopo il completamento della PCR, esaurisci il modello pSKAP aggiungendo l'enzima di restrizione Dpn I alla reazione. Incubare a 37 gradi centigradi per 20 min.
NOT: I prodotti PCR devono essere visualizzati su un gel di agarose per verificare la dimensione e la purezza del prodotto. Un controllo Dpn I digestione costituito dal modello pSKAP non modificato può essere eseguito e utilizzato nei passaggi successivi per garantire che il DNA del modello sia completamente digerito. - Utilizzare 5 l del prodotto a partire da 1,15 per trasformare 100 -L di cellule Commerciali chimicamente competenti DH5, secondo le raccomandazioni del produttore.
- Stendere i trasformativi su placche di agar LB completate con 25 g/mL di cloramramernico e incubare a 37 gradi durante la notte.
- Selezionare una colonia (o colonie) da piatti notturni e striscia su singole piastre di agar LB completate con 25 g/mL cloramhenicl e incubare a 37 gradi durante la notte. Selezionare una colonia da piatti notturni e utilizzare per inoculare 5 mL di brodo LB integrato con 25 g/mL di cloramfenicolo. Incubare colture durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
- Utilizzare un kit commerciale di miniprep plasmicono per purificare i plasmidi dalla cultura o dalle culture notturne.
- Plasmidi purificati della sequenza di sanger utilizzando il primer di sequenza in avanti M13 (tabella 2). Confrontare l'area mutata con il plasmide originale e valutare la precisione di inserimento SDM.
- Dopo aver confermato l'inserimento e la precisione del codice a barre, assegnare un nome a ciascun codice a barre e plasmid.
NOT: Ai codici a barre generati fino ad oggi è stata assegnata una designazione di due lettere: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, ecc. Plasmids con codice a barre sono indicati come pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC e così via. - Ripetere i passaggi da 1,14 a 1,21 per generare il numero desiderato di codici a barre del DNA.
2. Introdurre il codice a barre del DNA sul cromosoma di S. Typhimurium
NOT: Inserimento di codici a barre del DNA sulla S. Il cromosoma di Typhimurium si ottiene utilizzando un metodo di scambio allelico descritto da Datsenko e Wanner14 che è stato modificato per l'uso in S. Typhimurium.
- Determinare il locus sulla S. Genoma del ghimuro in cui inserire il codice a barre del DNA (Figura 3).
NOT: Selezionare una grande regione intergenica del cromosoma. Evitare le regioni che producono RNA non codificante. Questo studio ha utilizzato un locus a valle del mettere P tra i residui 1.213.840 e 1.213.861 (determinato dall'assemblaggio del genoma GCA_000022165.1). Questa regione è stata precedentemente geneticamente manipolata nella traduzione dei geni15. In alternativa, un codice a barre del DNA potrebbe essere introdotto mentre contemporaneamente disturba un gene di interesse. Ciò richiederebbe modifiche minime a questo protocollo e semplificherebbe la creazione di mutanti. - Progettare i primer PCR per amplificare l'esclusivo codice a barre e il gene di resistenza alla kanamica fiancheggiato da FRT dal plasmide contenente il pSKAP desiderato del punto 1.21 (Tabella 2). Aggiungete le estensioni da 40 nucleotidi omologhe alla regione selezionata nel passaggio 2.1 fino alla fine 5' di ogni primer (tabella 2).
- Eseguire l'amplificazione utilizzando una polimerasi commerciale ad alta fedeltà, i primer del passaggio 2.2 e il plasmide contenente il codice a barre pSKAP desiderato come modello. Impostare il termociclore in modo che esegua le seguenti operazioni: 1) 98 S per 30 s, 2) 98 S per 10 s, 3) 56 C per 15 s, 4) 72 C per 60 s, ripetere i passaggi 2-4 29, 5) 72 s C per 5 min, 6) tenere a 4 gradi centigradi.
- Dopo il completamento della PCR, esaurire il DNA del modello utilizzando DpnI come descritto nel passaggio 1.15. Purificare e concentrare il DNA utilizzando un kit di pulizia del DNA commerciale secondo le specifiche del produttore.
- Fare riferimento al protocollo pubblicato in precedenza per la generazione di mutanti in S. Ceppo di Typhimurium 14028s da prodotti PCR14,16,17,18.
NOT: Non è essenziale che il gene della resistenza alla kanamicicina venga assolto dal cromosoma. Tuttavia, l'escissione del gene è minimamente dirompente per il cromosoma batterico in quanto si traduce in una cicatrice di 129 bp che lascerebbe potenziali geni a valle nel telaio. Si raccomanda che il ceppo contenente il gene di resistenza alla kanamicina sia mantenuto in quanto può essere utilizzato per spostare i codici a barre tra i ceppi tramite la trasduzione mediata da P22. - Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.5 per creare i ceppi desiderati con i codici a barre appropriati.
NOT: I codici a barre possono essere introdotti in un tipo selvaggio S. Il typhimurium che può poi essere sottoposto a ulteriore manipolazione genetica, o codici a barre possono essere introdotti in ceppi che sono stati precedentemente geneticamente modificati.
3. Condizioni di crescita batterica e analisi della concorrenza in vitro
- Da batteri stock, striscia desiderata S. Ceppi di typhimurium che ospitano ciascuno un codice a barre unico di DNA sulle piastre di agar LB. Incubare le piastre durante la notte a 37 .
- Selezionare una singola colonia da ogni ceppo e inoculare 5 mL di brodo LB. Incubare per 20 h a 37 gradi centigradi con agitazione costante.
NOT: Utilizzando la coltura durante la notte, procedere al passaggio 3.5 per raccogliere il DNA genomico puro (gDNA) da ogni ceppo con codice a barre. Ciò è necessario per i successivi esperimenti di convalida e controllo nella sezione 6. - Per ogni analisi della concorrenza, trasferire un volume uguale di ogni coltura durante la notte in un tubo sterile di dimensioni adeguate. Mescolare accuratamente i ceppi vortice vigorosamente per almeno 5 s.
NOT: Il volume di ogni coltura overnight da trasferire dovrebbe essere sufficiente per ogni condizione e replicare, così come per isolare gDNA per quantificare l'input. Sebbene non sia del tutto necessario misurare la densità ottica delle colture perché il numero assoluto di microrganismi di input sarà quantificato utilizzando la PCR digitale, il numero di batteri di input per ogni ceppo dovrebbe essere approssimativamente uguale per evitare colli di bottiglia o concorrenza diseguale all'inizio dell'esperimento. I saggi rappresentativi della concorrenza in questo protocollo hanno confrontato simultaneamente tassi di crescita di 8 tensioni. Per i singoli progetti sperimentali possono essere necessari ulteriori o meno ceppi. - Trasferire 100 l'inoculum misto nel brodo LB sterile da 4,9 mL. Incubare a 37 gradi centigradi per il tempo desiderato o ad una densità ottica desiderata.
- Raccogliere 500 l dell'inoculum mediante centrifugazione a >12.000 x g per 1 min. Rimuovere e scartare il supernatante. Procedere immediatamente alla sezione 4 con le celle.
- Nei punti temporali desiderati, rimuovere 500 lldi di coltura e raccogliere le cellule per centrifugazione a >12.000 x g per 1 min. Rimuovere e scartare il sovrnatale.
NOT: Se si raccolgono aliquote in più momenti, congelare i pellet a -20 gradi centigradi o procedere immediatamente al passaggio 4.1 dopo ogni raccolta.
4. Raccolta e quantificazione gDNA da S. Typhimurium (da passaggi 3.5 e 3.6)
- Raccogliere gDNA da cellule utilizzando un kit di purificazione gDNA commerciale. Se disponibile, eseguire la fase opzionale di esaurimento dell'RNA.
NOT: L'esaurimento dell'RNA non è necessario; tuttavia, la presenza di RNA aumenterà artificialmente la concentrazione di DNA, portando a calcoli aberranti nelle fasi successive. Se si utilizza un kit di purificazione gDNA commerciale, seguire le raccomandazioni del produttore per assicurarsi che la colonna non sia sovraccarica di DNA. Non è richiesta alcuna concentrazione minima di DNA se il campione è quantificabile nelle fasi successive. - Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA in ogni campione.
NOT: Il DNA può essere quantificato utilizzando qualsiasi metodo affidabile. - Calcolare il numero di copia gDNA in base alla dimensione del genoma batterico utilizzando la seguente equazione in cui: X è la quantità di DNA in ng e N è la lunghezza di una molecola di DNA a doppio filamento (la dimensione del genoma).
NOTA: 660 g/mole viene utilizzato come massa media di 1 DNA bp. Piccole variazioni possono esistere a seconda della composizione nucleotide dell'organismo. Numerosi calcolatori sono disponibili online per eseguire il calcolo.
5. Progettare Primer e sonde per il rilevamento quantitativo dei codici a barre del DNA tramite dDigital PCR
- Progettare primer per amplificare la regione con codice a barre della S. Typhimurium cromosoma a valle di putP (Figura 3C e Tabella 2).
NOT: I progetti di Primer e sonda possono essere facilitati da numerosi programmi online (Tabella dei Materiali). Se i codici a barre sono tutti inseriti nello stesso loci, un singolo set di primer di amplificazione è universale per tutti i codici a barre. - Progettare sonde basate su 6 carboxyfluorescein (FAM) e/o basate su hexachlorofluorescein (HEX) specifiche per ogni codice a barre (Tabella 2 e S1).
NOT: Il lettore di goccioline utilizzato in questo esperimento è in grado di rilevare simultaneamente sonde basate su FAM e HEX in una reazione multiplex. Progettare 1/2 delle sonde per utilizzare FAM e 1/2 per utilizzare HEX. Questo non è un passo necessario, ma ridurrà l'uso del reagente e i costi sperimentali se attuati. - Crea 20 x miscele master primer-probe contenenti 1) 20 mM di ogni primer di amplificazione in avanti e inversa, 2) 10 mM di una singola sonda FAM e 3) 10 mM di una singola sonda HEX (se multiplexing).
6. Convalidare la sensibilità e la specificità di ogni set di sonde Pprimer per ogni codice a barre genomico utilizzando la PCR digitale
NOT: Questo protocollo utilizza la convalida di otto codici a barre univoci con otto sonde uniche come esempio. Il numero di codici a barre utilizzati può essere aumentato o diminuito per ospitare vari progetti sperimentali.
- Creare un pool di gDNA che contiene tutti i codici a barre ad eccezione di uno. Utilizzare questo pool come diluente per eseguire una serie di diluizione con gDNA contenente il singolo codice a barre rimanente (lo schema di diluizione del campione è disponibile nella Figura4).
NOT: L'utilizzo di gDNA raggruppato come diluente garantisce uno sfondo coerente, accertando al contempo la sensibilità. Utilizzando i numeri di copia determinati nel passaggio 4.3, diluire gDNA in un numero di copia compreso nell'intervallo PCR digitale consigliato (1-100.000 copie per 20 reazione l). Tenere presente che l'intervallo è impostato per ogni destinazione univoca (codice a barre), non per il gDNA totale. - Preparare le reazioni per la PCR digitale in duplicato secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Utilizzare le miscele del passaggio 6.1 come modello DNA. Utilizzare il mix master 20x primer-probe del passaggio 5.3 che contiene la sonda per il codice a barre diluito nel passaggio 6.1.
- Preparare replicare le reazioni di controllo per la PCR digitale secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Le reazioni di controllo per ogni combinazione di probe devono essere costituite da 1) nessun controllo modello (NTC), 2) controlli negativi e 3) controlli positivi.
NOT: Il numero minimo di reazioni di controllo di replica è due. In questo protocollo di esempio vengono utilizzati quattro NTC, sei controlli negativi e sei controlli positivi per ogni codice a barre. I controlli negativi devono contenere gDNA con ogni codice a barre, ad eccezione del codice a barre corrispondente alla sonda sottoposta a test. Questo convaliderà la specificità di ogni probe. - Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.3 per creare reazioni PCR digitali per ogni campione di gDNA con codice a barre. Nella figura 5è presente una disposizione della piastra di esempio.
NOT: Questo e i passaggi successivi sono descritti sulla base di una specifica piattaforma PCR digitale che utilizza droplet e tecnologia flow-based. Le piattaforme PCR digitali alternative che utilizzano la tecnologia basata su chip possono essere facilmente sostituite con lievi modifiche a questo protocollo. Passo 6.4 può richiedere più di una piastra 96-po per convalidare tutti i set di primer. A differenza di qPCR, le piastre separate analizzate dalla PCR digitale possono essere facilmente confrontate senza la necessità di pozze di riferimento standardizzate tra piastre. - Generare goccioline per ogni condizione di reazione utilizzando un generatore di goccioline secondo le istruzioni del produttore.
- Trasferire le goccioline appena create nella piastra appropriata di 96 pozzi. Utilizzare 200 punte di pipetta su una pipetta multicanale da 5 a 50 ll.
NOT: Quando si pipettano le goccioline, pipetta lentamente e senza intoppi! Il produttore di apparecchiature PCR digitali consiglia di utilizzare solo pipette e punte di pipette di un particolare produttore (ad esempio, Ranin). Queste punte pipette hanno un'apertura liscia senza frammenti microscopici di plastica che possono distruggere le goccioline o danneggiare la microfluidica del lettore di goccioline. Numerosi marchi di punte sono stati esaminati e osservati per avere uno spettro di qualità di produzione. Risultati equivalenti sono stati ottenuti utilizzando alternative alla punta pipetta; tuttavia, è necessario prestare attenzione quando si discosta dalle raccomandazioni del produttore. - Dopo che tutte le goccioline sono state generate e trasferite, sigillare la piastra con un sigillante piastra stagnola.
- Utilizzare il termociclista raccomandato dal produttore per eseguire le seguenti condizioni di ciclismo: 1) 94 gradi centigradi per 10 min; 2) 94 gradi centigradi per 1 min, velocità di rampa impostata a 1 c/s; 3) 55 gradi centigradi per 2 min, velocità di rampa impostata a 1 gradi centigradi; 4) ripetere i passaggi 2 e 3 49 volte; 5) 98 gradi centigradi per 10 min; 6) tenere a 4 gradi centigradi fino a 24 h.
NOT: Il trasferimento termico in una reazione di gocciolina non è lo stesso della PCR standard. Le condizioni di reazione possono richiedere modifiche. - Durante l'esecuzione del termociclo, programmare il software di analisi dei dati con le informazioni di impostazione della piastra, ad esempio il nome del campione, il tipo di esperimento (quantificazione assoluta), il supermix utilizzato, il nome del codice di destinazione 1 (nome del codice a barre FAM), il tipo target 1 (NTC, controllo positivo, controllo negativo, o sconosciuto), il nome del codice di destinazione 2 (nome del codice a barre HEX), il tipo di destinazione 2 (vuoto, controllo positivo, controllo negativo o sconosciuto). Le informazioni di configurazione della piastra finale sono mostrate nella Figura 5.
- Al termine del termociclismo, trasferire le reazioni completate al lettore di goccioline e avviare il processo di lettura secondo le istruzioni del produttore.
7. Quantificare il numero di batteri in un esperimento sugli indici competitivi
- Diluire gDNA isolato e quantificato dal paragrafo 4 ad una concentrazione appropriata come descritto sopra.
- Preparare le reazioni per la PCR digitale secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo del supermix appropriato. Utilizzare il DNA del passaggio 7.1 come modello. Utilizzare un master mix 20x primer-probe che contiene la sonda (o sonde se rilevano sia FAM che HEX) per i possibili codici a barre presenti nell'esperimento.
- Preparare ulteriori reazioni PCR digitali come nel passaggio 7.2 utilizzando diverse 20x primer-probe master mixes fino a quando tutti i codici a barre utilizzati nel progetto sperimentale possono essere rilevati.
- Includere i controlli per ogni condizione come descritto in 6.3. Sono inclusi 1) nessun controllo modello (NTC), 2) controlli negativi e 3) controlli positivi.
- Continuare con il protocollo come descritto nei passaggi 6.5-6.10.
8. Analizzare i dati PCR digitali e calcolare i numeri di copia assoluti
- Quando tutti i pozzi sono stati letti e l'esecuzione è completa, aprire il file di dati .qlp utilizzando il software di analisi dei dati.
NOT: I tipi di file e le procedure di analisi dei dati qui descritti sono specifici di un produttore digitale di PCR. Se si utilizzano piattaforme PCR digitali alternative, i tipi di file e le procedure di analisi dei dati saranno specifici della piattaforma utilizzata e devono essere eseguite in base alle specifiche consigliate dal produttore. - Selezionare tutti i pozzi che utilizzano lo stesso mix master primer-probe.
- Nella scheda Goccioline, esaminare il numero di goccioline analizzate in ogni pozzo (sia goccioline positive che negative). Escludere dall'analisi qualsiasi pozzo con meno di 10.000 goccioline totali.
- Passare alla scheda Ampiezza 1D ed esaminare le ampiezze delle goccioline positive e negative. Assicurarsi che comprendano due popolazioni distinte.
- All'interno del software, utilizzare la funzione di soglia per effettuare un taglio tra goccioline positive e negative per ogni probe utilizzato (Figura 6).
NOT: Tutti i pozzi che utilizzano lo stesso mix master primer-probe dal passaggio 5.3 devono avere le stesse soglie. - Una volta applicate le soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione. Esportare i dati in un foglio di calcolo per facilitare un'ulteriore analisi.
NOT: Il software di analisi dei dati utilizza il numero di goccioline positive e negative che si adattano a una distribuzione di Poisson per determinare il numero di copie. - Utilizzando i valori del passaggio 8.6, calcolare il numero di copia iniziale di ogni codice a barre genomico univoco nell'esempio. Determinare il tasso medio di falsi positivi dalle reazioni di controllo negativo e sottrarre questo valore dai valori ottenuti nelle reazioni sperimentali. Moltiplicare i valori in base alle diluizioni eseguite durante l'impostazione di ogni esperimento (tabella3).
9. Determinare l'idoneità relativa di un organismo calcolando il CI o il COI dalla quantificazione digitale basata su PCR dei ceppi codificati a barre
- Calcolare il CI di una deformazione con codice a barre utilizzando le seguenti formule in cui: AOutput è la quantificazione assoluta della deformazione con codice a barre in un determinato momento, WTOutput è la quantificazione assoluta dei batteri di tipo selvatico con codice a barre allo stesso timepoint, AInput è la quantificazione assoluta dell'inoculum di ingresso della deformazione con codice a barre, WTInput è la quantificazione assoluta dell'inoculo di ingresso dei batteri di tipo selvatico con codice a barre, XOutput è la somma di tutti i ceppi lo stesso timepoint, XInput è la somma dell'inoculum di input totale di tutti i ceppi con codice a barre.
NOT: Vedere la discussione per vantaggi, svantaggi e l'uso più appropriato di ogni formula.
- Ripetere il passaggio 9.1 per ogni deformazione con codice a barre in tutti i punti temporali.
- Se applicabile, calcolare il COI utilizzando le seguenti formule in cui: AOutput è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con gene mutato A in un determinato momento, ABOutput è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con geni mutati A e B allo stesso tempo, AInput è la quantificazione assoluta dell'inoculum di input del ceppo codificato a barre con gene mutato A, ABInput è la quantificazione assoluta dell'inoculum di ingresso di ceppo codificato a barre con geni mutati A e B, BOutput è la quantificazione assoluta di un ceppo con codice a barre con gene mutato B in un dato momento, e BInput è la quantificazione assoluta dell'input inoculo del ceppo con codice a barre con gene mutato B.
O
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Representative Results
L'uso di questa metodologia richiede che vengano eseguite reazioni di controllo appropriate per convalidare la sensibilità e la specificità di ogni sonda utilizzata per identificare il DNA bersaglio. In questo esperimento rappresentativo, abbiamo convalidato otto codici a barre di DNA unici con le otto sonde corrispondenti per l'identificazione. Tutte e otto le sonde avevano un basso tasso di falsi positivi sia nella NTC che nelle reazioni di controllo negative (Tabella3), evidenziandone la specificità anche tra sequenze di DNA molto simili. Per valutare la sensibilità di ogni condizione, gDNA contenente un codice a barre univoco è stato diluito in serie in uno sfondo costante di gDNA contenente ciascuna delle sette sequenze di codici a barre rimanenti. Con l'approccio descritto in precedenza, la PCR digitale poteva distinguere fino a 2 copie di gDNA inuno sfondo di quasi 2.000.000 di sequenze di DNA simili (tabella 3).
Oltre a determinare la sensibilità e la specificità di ogni sonda e sequenza di codici a barre del DNA, le diluizioni eseguite nello studio di convalida ci hanno permesso di calcolare un indice competitivo simulato dai dati risultanti. Anche se non c'era alcun input o output reale per questo esperimento, i dati possono essere analizzati come se fosse stato eseguito un esperimento di competizione. A tale scopo, consideriamo ogni miscela nella diluizione seriale come output (AOutput) per il codice a barre diluito, mentre l'output totale (XOutput), l'input (AInput) e l'input totale (XInput) di ogni deformazione viene calcolato dal quantificazione nei controlli positivi in cui sono inclusi tutti i codici a barre. Utilizzando il fattore di diluizione per ogni miscela, il CI teorico è stato determinato ed è riportato nella tabella 3. In ciascuna delle serie di diluizione eseguita per ogni codice a barre, viene riportata la CI simulata media insieme alle deviazioni standard per ogni serie di diluizione duplicata. In tutti i casi, il CI simulato calcolato è simile al CI teorico. La maggior parte degli IC calcolati si discostano dalle IC theoretical di meno del 25%. Nei casi di IC teorici inferiori, la deviazione del valore calcolato era verso l'alto di 2 volte. Ad esempio, questo rappresentava una modifica da un CI teorico di 0,000625 a un CI calcolato di 0,001220. Questi dati evidenziano che il metodo descritto è sia altamente preciso e altamente preciso. La combinazione di alta sensibilità, specificità, precisione e precisione consente a questo sistema di rilevare in modo affidabile le differenze di forma fisica che altrimenti potrebbero passare inosservate.
Dopo aver convalidato che i codici a barre genomici potevano essere rilevati e quantificati con precisione, abbiamo eseguito esperimenti di competizione in vitro (Tabella4). Il primo esperimento di concorso ha utilizzato otto wild-type S. Ceppi di Typhimurium che contenevano un codice a barre unico del DNA. Ogni ceppo è stato coltivato durante la notte, e le otto culture sono state mescolate insieme in quantità uguali. 100 -L di questo inoculo misto è stato utilizzato per inoculare 4,9 mL di brodo LB sterile e la coltura risultante è stata incubata a 37 gradi centigradi con agitazione costante. gDNA è stato raccolto dall'inoculo per calcolare l'esatto ingresso di ogni ceppo. La crescita della coltura è stata monitorata misurando l'assorbimento a 600 nm (OD600). All'OD600 x 0,5 (fase logaritmica), è stato raccolto un campione per ogni coltura e gDNA è stato raccolto. La coltura rimanente è stata riportata a 37 gradi centigradi con agitazione costante fino a 8 ore dopo l'inoculazione quando un campione finale è stato raccolto e gDNA raccolto (stazionario). I risultati sono stati calcolati utilizzando la formula CI modificata per le infezioni raggruppate. Come previsto, tutti i ceppi di tipo selvaggio avevano valori CI quasi uguali a 1 (tabella4). Un esperimento di competizione simile è stato eseguito utilizzando otto Smutanti . Ceppi di Typhimurium che avevano codici a barre unici in aggiunta a una carenza di una carenza a singola, doppia o tripla transketolasi18. Come mostrato in precedenza, tutti i ceppi sono cresciuti allo stesso modo nel brodo LB, con solo un leggero ritardo osservato nel ceppo triplo-transketolase-carente. Tuttavia, quando la crescita di ogni ceppo è stata valutata analizzando il CI, è stato osservato un difetto molto più profondo per la varietà trastradita (CI è stato confrontato con le curve di crescita in Shaw et al.18). Inoltre, questo esperimento ci ha permesso di assegnare un valore quantificabile alle caratteristiche di crescita di ogni ceppo invece di limitarci a descrivere qualitativamente i modelli di crescita. Gli IC per ogni ceppo sono stati calcolati utilizzando sia la formula tradizionale in cui ogni ceppo è stato confrontato solo con wild-type e la formula modificata in cui tutti i ceppi di input sono stati considerati. Mentre i cambiamenti erano piccoli, la CI del ceppo a tripla transketolasia-deficiente era artificialmente bassa nella formula tradizionale perché non spiega gli altri sei ceppi concorrenti che mostravano tutti fitness di tipo quasi selvaggio.
| Ceppi | genotipo | Origine o riferimento |
| S. Typhimurium ATCC 14028s | wild-type | Atcc |
| TT22236 | LT2 Salmonella che trasporta pTP2223 | (27) Il 2010 il |
| DH5 | F– 80lac- M15 - - - (lacyA-argF)U169 recA1 fineA1 hsdR17(rK–, mK) phoA supE44–thi-1 gyrA96 relA1 | (28) Il 2010 |
| JAS18077 | putP::AA::FRT | Questo studio |
| JAS18080 | putP::AD::FRT | Questo studio |
| JAS18083 | putP::AG::FRT | Questo studio |
| JAS18088 | putP::AL::FRT | Questo studio |
| JAS18091 | putP::AO::FRT | Questo studio |
| JAS18096 | putP::AT::FRT | Questo studio |
| JAS18099 | putP::AW::FRT | Questo studio |
| JAS18100 | putP::AX::FRT | Questo studio |
| JAS18122 | TktA::FRT putP::AD:: FRT | Questo studio |
| JAS18130 | TktB::FRT putP::AL:: FRT | Questo studio |
| JAS18138 | TktC::FRT putP::AT::FRT | Questo studio |
| JAS18125 | TktA:: FRT -tktB::FRT putP::AG::FRT | Questo studio |
| JAS18133 | TktA:: FRT :tktC::FRT putP::AO::FRT | Questo studio |
| JAS18141 | TktB::FRT :tktC::FRT ::FRT putP::AW:: FRT | Questo studio |
| JAS18142 | -tktA:: FRT -tktB::FRT :tktC::FRT putP::AX::FRT | Questo studio |
| Plasmidi | ||
| pKD13 | bla FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) Il 2010 l'elenco dei |
| PPCR Script Cam SK | ColE1 ori; CmR | Stratagene/Aligent |
| pTP2223 | Plac lam scommessa exo tetR | (16) Il 2003 |
| pCP20 (informazioni in base al tall. | bla gatto cI857 PRflp pSC101 oriTS | (29) Il 220, il |
| pSKAP (in questo | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT | Questo studio |
| pSKAP_AA | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AA | Questo studio |
| pSKAP_AD | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AD (AD) | Questo studio |
| pSKAP_AG | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AG | Questo studio |
| pSKAP_AL | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AL | Questo studio |
| pSKAP_AO | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AO | Questo studio |
| PSKAP_AT | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AT A | Questo studio |
| pSKAP_AW | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AW | Questo studio |
| pSKAP_AX | ColE1 ori; CmR; bla FRT ahp FRT; AX (ASCIA) | Questo studio |
Tabella 1: Ceppi e plasmidi utilizzati in questo studio.
| nome | Sequenza (5' - 3')1,2,3 |
| pSKAP SDM AA - F | AGAAGTCTCTCCTGGGTTTGAGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AA - R | ACTCAAGCACCAGCAGAGACTCTCT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AD - F | AAGAGCACGGGAGTTAGTAGTAG CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AD - R | CCTACTATCACCTGCCTCTCTCTCTCT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AG - F | AGTAGTGTCCTGGAGGAGA CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AG - R | TCACATGCTCCAGGAGGACACTACT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - F | ACCACACATCGAAGGCACTCT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - R | AGAGCTAGTGCCTCTGGTGGTGGT CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AO - F | GTCCACAACCACACTCAGTGATACT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AO - R | AGTATCACTGAGTGTGGTTGGGGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AT - F | ACCAGTGTGAGTGAGGCTAGAC CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AT - R | GTCTAGCCATGTCACGGACACTGGT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AW - F | ACGACTGAGTGTGGGTGACG CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AW - R | CGTCACATCCACATCACTCAGTCGT CTCAAGACGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AX - F | ACTATCGTGTGTGTAACGACAGGGGGGG CGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pSKAP SDM AX - R | CAGCCTGTCGTTACACCACGATAGT CTCAAGACGTAATGCTG |
| M13 - F | GTAAAACGACGGCCAG |
| putP Ricombinazione - F |
TAGCGATGGGAGAGAGAGACGTTAATTATTCCATTTTAA TGCAGCATTACACGTC |
| putP Ricombinazione - R |
TACTGCGGGTATTAGCTGAAAACATCCATAACCTG CCTGCAGTTCGAAGTTCC |
| QPCR Area codice a barre Amplifica - F1 | TGCAGCATTACACGTCTTG |
| QPCR Area codice a barre Amplifica - R2 | TAGGAACTTCGAAGCAGC |
| Codice a barre AA Sonda - FAM | 6-FAM/AGAAGTCTC/E-EN/CTGCTGGCTTGAGTC/IBFQ |
| Codice a barre AD Sonda - FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/'EAN/GTGAGGTGATAGC/IBFQ |
| Sonda AG con codice a barre - FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/E-E/CTGGAGGAGGAGAGAGAC/IBFQ |
| Codice a barre AL Sonda - FAM | 6-FAM/AGAGCTAGT/'E/GCCTTCGATGTGGTGGTC/IBFQ |
| Sonda AO codice a barre - HEX | HEX/AGTATCACT//GAGTGTGGtTGTGGACC/IBFQ |
| Codice a barre AT Sonda - HEX | HEX/ACCAGTGTC/E/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
| Sonda AW con codice a barre - HEX | HEX/ACGACTGAG/'E/TGATGTGGATGTGACGC/IBFQ |
| Codice a barre AX Sonda - HEX | HEX/ACTATCGTG/-E/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ |
|
1 : il nome del I nucleotidi sottolineati indicano sequenze complementari per ogni codice a barre del DNA inserito in pSKAP dopo SDM. 2 Il nome del sistema I due nucleotidi sottolineati indicano una regione complementare sulla S. Cromosoma di typhimurium utilizzato per la sostituzione allelica. 3 (COM del nome Le sonde primeTime qPCR sono oligos di ibridazione etichettate con un colorante fluorescente a 5', 6 carboxyfluorescein (6-FAM) o hexchlorofluorescein (HEX), un quencher interno (EN) e il 3' quencer Iowa Black® FQ (IBFQ). |
|
Tabella 2: Primer e sonde utilizzate in questo studio.
| Quantificazione (copie/20 - Reazione lunatiche) | ||||||||
| descrizione | Aa | pubblicità | Ag | AL | Ao | a | Aw | Ax |
| Ntc | non pertinente | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 3.510 (in linguaggio 3080) | non pertinente | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di |
| Ntc | 3.600 | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di |
| Ntc | 3.510 (in linguaggio 3080) | 0.000 (in via di | 1.280 (in questo da 280) | 1.180 (in linguaggio 180) | 2.340 (in linguaggio 240) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di |
| Ntc | 2.290 (in questo 240) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 1.200 (in linguaggio 200) | 1.150 (in linguaggio 150) | 1.160 (in inglese) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di |
| Significare | 3.133 | 0.000 (in via di | 0,320 (in linguaggio calibro 320) | 1.473 (in linguaggio 13) | 1.163 (in inglese) | 0.290 (290) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di |
| negativo | 5.130 (in questo 130) | 1.156 (in inglese) | 0.000 (in via di | 1.124 (in linguaggio 124) | 3.745 | 1.281 (in via del documento in stato di | 7.354 (354) | 7.142 (in linguaggio 742) |
| negativo | 5.270 (270) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 1.087 (in linguaggio 1,087) | 1.666 (in inglese) | 1.643 (in inglese) | 7.746 (in inglese) | 2.269 |
| negativo | 2.660 (in inglese) | 0.000 (in via di | 1.361 (in inglese) | 1.451 (in linguaggio 1334) | 8.974 (in questo | 0.000 (in via di | non pertinente | 0.000 (in via di |
| negativo | 6.090 (in inglese) | 0.000 (in via di | 0.000 (in via di | 2.251 | 0.000 (in via di | 2.531 (in questo stato del documento) | 8.700 | 3.495 |
| negativo | 1.740 (in questo da 240 anni) | 0.000 (in via di | 1.086 (in inglese) | 2.130 (in questo 230) | 4.171 | 0.000 (in via di | 7.113 (in linguaggio 73) | 5.522 (in questo 522) |
| negativo | 6.220 (220) | 3.581 | 0.000 (in via di | 4.022 (in via 44) | 1.175 (in linguaggio 1,175) | 1.341 (in questo 1331) | non pertinente | 5.950 (in questo calibro) |
| Significare | 4.518 (in questo 518) | 0,789 (in questo 09) | 0.408 | 2.011 (in questo 201): | 3.288 | 1.133 (in via del documento) | 7.728 (in via 728) | 4.063 |
| costruttivo | 22281.540 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
| costruttivo | 23989.676 | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660 | 47456.973 | 15096.601 | 47929.840 | 22455.234 |
| costruttivo | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820 | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270 | 21467.840 |
| costruttivo | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473 |
| costruttivo | 20218.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.938 |
| costruttivo | 18531.740 | 41620.801 | non pertinente | 48082.313 | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992 | 21117.559 |
| Significare | 20652.601 | 42116.824 | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827 | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
| Sottrazione vuota | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
| Non diluito A | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305 | 62844.068 | 27567.828 |
| Non diluito B | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
| 1/50 A | 521.670 | 755.035 | 1066.898 | 1287.187 | 1053.339 | 181.324 | 1278.336 | 580.961 |
| 1/50 B | 435.326 | 634.215 | 1168.087 (in inglese) | 1383.537 | 991.040 (inlinguaggio di com> | 165.443 | 1180.445 | 596.461 |
| 1/100 A | Ore 228.028 | 598.848 | 603.911 | 631.116 | 507.956 | Ore 258.405 | 665.647 | 331.590 |
| 1/100 B | 256.330 | 585.834 | 583.325 | 670.875 | 459.325 | 289.207 | 638.916 | 307.948 |
| 1/200 A | 121.283 | 305.293 | 258.247 | 346.965 | Ore 234.774 | 114.163 | 169.055 (in inglese) | 172.553 anni |
| 1/200 B | 114.638 | 313.040 | 253.685 | Ore 297.216 | 191.637 (in inglese) | 179.895 | 280.989 | 147.297 |
| 1/400 A | 42.829 | 141.343 (in via 141.343) | 127.337 | 163.605 | non pertinente | 71.241 | 157.697 | 85.976 |
| 1/400 B | 59.544 (in via 54,544) | 180.543 | 162.080 | 162.108 | 115.508 | 104.682 (in inglese) | 151.141 | 87.804 |
| 1/800 A | 34.304 | 67.934 | 65.939 | 83.857 | 66.134 | 31.784 | 82.722 (in via 82.722) | 45.616 |
| 1/800 B | Ore 20.390 | 80.222 (in questo 202) | 81.453 | 85.325 825 | 53.102 (in linguaggio 53.102) | 38.034 | 55.460 | Ore 29.660 |
| 1/1600 A | 15.405 | 44.505 | 47.672 (in inglese) | 39.613 | Ore 33.027 | Ore 18.006 | 37.655 | Ore 20.988 |
| 1/1600 B | Ore 22.091 | 48.828 | 46.781 | 37.388 | 30.245 | 30.138 | 34.553 | 19.795 (in linguaggio 19.795) |
| 1/3200 A | 12.333 (in linguaggio 12.333) | Ore 22.104 | 16.850 | Ore 18.403 | 11.460 (in inglese) | 10.535 (in linguaggio 10.535) | Ore 21.245 | ore 9.218 |
| 1/3200 B | 6.796 | 32.555 | 15.742 (15.742) | Ore 26.249 | 15.111 | 9.908 (in linguaggio 908) | Ore 23.393 | 10.175 (in linguaggio 18888) |
| Sottrazione vuota | ||||||||
| Non diluito A | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
| Non diluito B | 18273.655 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860 | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
| 1/50 A | 517.152 (in linguaggio 5313) | 754.246 | 1066.490 | 1285.176 | 1050.051 | 180.192 (in linguaggio 180.192) | 1270.607 | 576.898 |
| 1/50 B | 430.808 | 633.426 | 1167.679 | 1381.526 | 987.751 | 164.311 | 1172.717 | 592.398 (in linguaggio 532.398) |
| 1/100 A | Ore 223.509 | Ore 598.059 | 603.503 | 629.105 | 504.668 | 257.272 | 657.918 | 327.527 |
| 1/100 B | 251.812 | 585.044 | 582.918 | 668.864 | 456.036 | Ore 288.074 | 631.187 | 303.885 |
| 1/200 A | 116.765 | 304.503 | 257.840 | 344.954 | 231.486 | Ore 113.030 | 161.327 (in inglese) | 168.490 |
| 1/200 B | 110.120 | 312.251 | 253.277 | Ore 295.205 | 188.348 | 178.762 anni | Ore 273.261 | 143.234 |
| 1/400 A | 38.310 | 140.554 | 126.929 (in inglese) | 161.594 | non pertinente | 70.108 | 149.968 (in inglese) | 81.913 |
| 1/400 B | Ore 55.026 | 179.753 anni | 161.672 (in inglese) | 160.097 (in inglese) | 112.219 | 103.549 | 143.413 | 83.741 |
| 1/800 A | Ore 29.786 | 67.145 | 65.531 | 81.847 | 62.846 | 30.651 | 74.994 | 41.553 |
| 1/800 B | 15.872 (in linguaggio 15.872) | 79.433 | 81.045 (in questo 01.045) | 83.314 | 49.813 | 36.901 | 47.732 (in questo stato del 2488) | Ore 25.596 |
| 1/1600 A | 10.886 | 43.716 | 47.264 (in inglese) | 37.602 (in inglese) | ORe 29.739 | 16.874 | Ore 29.927 (in questo 29.927) | 16.925 (in inglese) |
| 1/1600 B | 17.573 (in linguaggio 17.573) | 48.039 (in questo 04): | 46.373 (in inglese) | 35.377 (in via del | Ore 26.957 | Ore 29.005 | Ore 26.825 | 15.732 (ad esempio, |
| 1/3200 A | 7.815 (in questo | Ore 21.314 | Ore 16.442 | 16.392 (in inglese) | 8.172 (in linguaggio 832) | Ore 9.402 | 13.517 | 5.155 |
| 1/3200 B | 2.278 (in questo 2224) | 31.765 | 15.334 | Ore 24.238 | 11.822 (in questo 11.822) | 8.776 | 15.664 | 6.112 (in inglese) |
| CI simulato | ||||||||
| Non diluito A | 1.114895 | 1.055372 (in questo 055372) | 1.321619 (in inglese) | 1.114419 (in vie t1.14419) | 1.285650 (in inglese) | 1.176251 (in inglese) | 1.316329 (in inglese) | 1.294932 (in 3) |
| Non diluito B | 0,885005 | 0,837016 | 1.220911 (in via del documento in stato di | 1.439279 (in 3: 439279) | 0.999312 | 1.019279 (in3) | 1.272698 (in inglese) | 1.248618 (in inglese) |
| 1/50 A | 0,025046 | 0.017909 | 0,023931 | 0,028018 | 0,024348 | 0,011675 | 0,026617 | 0.027102 |
| 1/50 B | 0.020864 | 0,015040 | 0,026202 (in inglese) | 0,030118 | 0.022903 | 0,010646 (informazioni in inglese) | 0,024567 | 0,027831 |
| 1/100 A | 0,010825 | 0,014200 | 0,013542 (informazioni in due) | 0,013715 | 0,011702 (intito. | 0.016669 | 0,013782 | 0,015387 |
| 1/100 B | 0,012195 | 0.013891 | 0,013080 | 0,014582 | 0,010574 | 0,018665 | 0,013222 | 0,014276 |
| 1/200 A | 0,005655 | 0,007230 | 0.005786 | 0,007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
| 1/200 B | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0,011582 (in questo 011582) | 0.005724 | 0.006729 |
| 1/400 A | 0,001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | non pertinente | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
| 1/400 B | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 (in inglese)002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
| 1/800 A | 0,001443 | 0,001594 | 0,001470 (in3O) | 0,001784 (in3P) | 0,001457 | 0,001986 (informazioni in inglese) | 0,001571 | 0,001952 (in3O) |
| 1/800 B | 0.000769 | 0,001886 (informazioni in inglese) | 0,001819 | 0,001816 | 0,001155 | 0.002391 | 0,001000 | 0,001203 |
| 1/1.600 A | 0.000527 | 0,001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
| 1/1.600 B | 0.000851 | 0,001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0,001879 (in3O) | 0.000562 | 0.000739 |
| 1/3.200 A | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 (invia in stato di inademazione) |
| 1/3.200 B | 0,000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
| 50 C (teorico) | ||||||||
| Non diluito (1) | 0,999950 | 0,946194 | 1.271265 (in inglese) | 1.276849 (in inglese) | 1.142481 (in vietto) | 1.097765 (in inglese) | 1.294514 (in vie tallato) | 1.271775 (in questo 201775) |
| 1/50 (0,02) | 0,022955 | 0,016474 | 0,025067 | 0.029068 | 0,023625 | 0,011161 | 0,025592 | 0,027466 |
| 1/100 (0,01) | 0,011510 (informazioni in questo stati in base all'indirizzo e | 0,014046 | 0,013311 | 0,014148 | 0,011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0,014832 |
| 1/200 (0,05) | 0.005494 | 0.007322 | 0,005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
| 1/400 (0,0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0,00260 | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
| 1/800 (0,00125) | 0,001106 (informazioni in inglese) | 0,001740 | 0,001645 | 0,001800 | 0,001306 (informazioni in inglese) | 0,002188 | 0,001285 | 0,001577 |
| 1/1.600 (0,000625) | 0.000689 | 0,001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0,001486 (in inglese) | 0.000594 | 0.000767 |
| 1/3.200 (0,000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 (in3o) | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
| Deviazione standard | ||||||||
| Concentrata | 0.11494 | 0.10918 | 0,05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0,02182 (in linguaggio<20/0) | 0,02316 (in inglese) |
| 1/50 | 0.00209 (in3O) | 0,00143 (in via del sistema) | 0,00114 (in linguaggio da 20>: | 0,00105 | 0.00072 (in3o) | 0.00051 | 0.00103 | 0.00036 |
| 1/100 | 0.00069 | 0.00015 (intitolato 0015) | 0.00023 (in via del documento di windows) | 0.00043 | 0.00056 | 0,00100 | 0.00028 (intitolato 0028) | 0.00056 |
| 1/200 | 0.00016 (in inglese) | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0.00213 | 0,00117 | 0.00059 |
| 1/400 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 (in3O) | 0.00002 (in3O7) | 0x 0 . | 0.00108 (in3O) | 0.00007 | 0.00004 |
| 1/800 | 0.00034 | 0.00015 (intitolato 0015) | 0.00017 (in3O) | 0.00002 (in3O7) | 0.00015 (intitolato 0015) | 0.00020 (in3P) | 0.00029 (in3O) | 0.00037 |
| 1/1.600 | 0.00016 (in inglese) | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 (in3O7) | 0.00003 | 0.00039 (in3O) | 0.00003 | 0.00003 |
| 1/3.200 | 0.00013 (in3) | 0.00012 (in3o) | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 (in3O7) | 0.00002 (in3O7) | 0.00002 (in3O7) |
| : rappresenta i risultati di un singolo esperimento. | ||||||||
Tabella 3: Quantificazione assoluta e calcolo C simulato.
| condizione | Indice competitivo1 | |||||||
| Esperimento 1 | ||||||||
| WTAA | Active Directory WT | WTAG | WTAL | WTAO | WTAT | WTAW | AX WT | |
| Logaritmica | 0,927 - 0,033 | 0,992 - 0,031 | 1.068 - 0,025 | 0,921 - 0,02 | 1.044 - 0,03 | 1.051 - 0,057 | 1.094 - 0,027 | 0,929 - 0,005 |
| fermo | 1,1 - 0,021 | 1.071 - 0.053 | 1.079 - 0,065 | 0,948 x 0,02 | 0,98 x 0,02 | 0,873 - 0,044 | 0,97 - 0,056 | 1.021 - 0,007 |
| Esperimento 2 | ||||||||
| CI (tradizionale) | WTAA | AAD | BAL | AAT s.r.l. | AG con sAB | AO (AO) | BCAW | AX ABC |
| Logaritmica | 1 - 0 | 0,802 - 0,084 | 0,957 - 0,02 | 0,989 x 0,073 | 0,581 - 0,153 | 0,86 - 0,053 | 0,995 - 0,011 | 0,695 - 0,061 |
| fermo | 1 - 0 | 0,97 - 0,063 | 1.043 - 0,058 | 0,99 x 0,036 | 1.625 - 0,589 | 0,835 - 0,051 | 0,912 - 0,047 | 0,477 - 0,049 |
| CI (Inoculum raggruppato) | ||||||||
| Logaritmica | 1.114 - 0,039 | 0,864 - 0,074 | 1.073 - 0.032 | 1,1 - 0,068 | 0,633 x 0,152 | 0,938 - 0,056 | 1.111 - 0,043 | 0,746 - 0,06 |
| fermo | 1.078 - 0.039 | 1.039 - 0,049 | 1.166 - 0,093 | 1.066 - 0,01 | 1.735 - 0,613 | 0,876 - 0,035 | 0,97 - 0,045 | 0,49 x 0,047 |
| 1 : il nome del I valori rappresentano la media CI : deviazione standard per tre o quattro esperimenti di replica. | ||||||||
Tabella 4: Risultati rappresentativi della concorrenza in vitro tra S. Ceppi di typhimurium.
Tabella S1. Primer opzionali per la creazione di sequenze di codici a barre aggiuntivi e sonde fluorescenti corrispondenti per il loro rilevamento. Fare clic qui per scaricare questo file.
come illustrato nella Figura 1. Generazione di pSKAP. (A) Il pKD13 purificato è stato sottoposto a digestione delle restrizioni con HindIII e BamHI. (B, C) Il frammento di interesse di 1,333 bp contenente un gene di resistenza alla kanamica fiancheggiato da FRT è stato purificato. Èstato digerito anche con HindIII e BamHI il frammento di pKD13 (B) e il frammento di pKD13 (B) è stato migate per generare (E) pSKAP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: mutagenesi diretta dal sito di inserimento a pSKAP. (A) L'inserimento di codici a barre 25 bp DNA nella posizione 725 è stato eseguito utilizzando PCR. I primer avanti e indietro specifici per quella posizione sono stati progettati con estensioni complementari da 25 nucleotidi 5' (indicati nel primer come "a" minuscoli). (B) Viene visualizzato un plasmid generico pSKAP_Barcode risultante da SDM con la posizione del codice a barre del DNA inserito evidenziato arancione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Riarrangiamento cromosomico a valle di putP. (A) Dopo la ricombinazione mediata da rosso, il gene di resistenza alla kanamicina selezionabile (viola scuro) affiancato ai siti FRT (grigio) viene inserito sul cromosoma tra i loci indicati (Chromosomal Recombination Site, rosso). L'esclusivo codice a barre del DNA (arancione) viene inserito appena fuori dal sito FRT. (B) Il gene di resistenza alla kanamicina viene rimosso dall'escissione mediata da FRT, lasciando un residuo di DNA inserito sul cromosoma (TOTAL Inserted DNA, blue) costituito dal codice a barre del DNA e da una cicatrice FRT. (C) Viene mostrata la sequenza di DNA cromosomico modificata che circonda il DNA inserito, insieme ai siti di innesco dell'amplificazione (viola chiaro) utilizzati per la PCR digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schema di diluizione per la convalida della sensibilità e della specificità della sonda fluorescente. (A) GDNA purificato da sette ceppi con codice a barre viene mescolato insieme in quantità uguali per creare il diluente per diluire il gDNA omesso con codice a barre (AX nell'esempio precedente). (B) Eseguire una diluizione seriale del gDNA con codice a barre omesso (AX nell'esempio precedente) utilizzando il diluente preparato descritto in precedenza. Mescolare accuratamente il contenuto di ogni tubo prima di passare al tubo successivo. Figura 4 è stato creato con BioRender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Layout della piastra per l'analisi della sensibilità e della specificità dei set di sonda primer 1 e 2. L'esperimento PCR digitale include NTC, controlli positivi, controlli negativi e schemi di diluizione per ciascuno dei codici a barre testati. La piastra per la convalida dei set di sonda primer 3 e 4 è strutturata nello stesso modello utilizzando il gDNA con codice a barre appropriato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati PCR digitali rappresentativi di gDNA con codice a barre AA diluito. gDNA contenente il codice a barre AA è stato diluito in uno sfondo di tutti gli altri gDNA con codice a barre come descritto nella Figura 4. Il canale 1 rappresenta la sonda FAM per il codice a barre AA (pannelli superiori), mentre il canale 2 rappresenta la sonda HEX per il codice a barre AO (pannelli inferiori). I risultati di ogni sonda sono presentati sia come singola ampiezza fluorescente gocciolante gocciolante (pannelli di sinistra) che come istogramma che rappresenta la frequenza di intensità fluorescente di tutte le goccioline nei pozzi selezionati (pannelli a destra). Per ogni condizione, le goccioline positive (alta fluorescenza) e negative (bassa fluorescenza) dovrebbero formare due popolazioni distinte. Nel caso di AA che è stato diluito, e la maggior parte delle goccioline erano negative, l'istogramma (pannello in alto a destra) sembra rappresentare solo una singola popolazione. Questo perché le goccioline positive sono sostanzialmente in inferiorità numerica da goccioline negative; tuttavia, due popolazioni distinte sono ancora visibili esaminando l'ampiezza fluorescente delle gocciole nei pannelli di sinistra. Le popolazioni devono essere separate utilizzando la funzione soglia per definire goccioline positive e negative (visualizzate dalla linea rosa). I valori di soglia variano a seconda delle sonde utilizzate, ma tutti i pozzi che utilizzano la stessa combinazione di probe devono avere soglie identiche. Poiché il gDNA con codice a barre AA è stato diluito, c'è una diminuzione delle goccioline positive (alta fluorescente), mentre il numero di goccioline AO positive rimane costante sullo sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La capacità di quantificare con precisione i microrganismi è di fondamentale importanza per la ricerca microbiologica e la capacità di enumerare ceppi unici provenienti da una popolazione mista iniziale si è dimostrata uno strumento inestimabile per valutare i tratti di forma e virulenza batteri. Tuttavia, le tecniche per realizzare questo non sono progredite al passo con gli sviluppi moderni nella biologia molecolare. La tecnologia per modificare facilmente i cromosomi di molti batteri, tra cui S. Typhimurium, è stato disponibile per quasi due decenni14, ma questa capacità è stata raramente utilizzata per ceppi molecolari di marcatura con sequenze di DNA uniche. Sfruttando la capacità di creare ceppi facilmente identificabili basati su codici a barre del DNA univoci e minimamente dirompenti inseriti nel cromosoma batterico, insieme alla tecnologia più all'avanguardia per rilevare e quantificare questi identificatori molecolari ( cioè la PCR digitale), abbiamo creato un sistema che fornisce una sensibilità, specificità, precisione e precisione squisita per quantificare facilmente i singoli ceppi all'interno di una popolazione diversificata di batteri.
Il calcolo di CI e COI come descritto sopra si basa sulla capacità di apportare con precisione le modifiche appropriate ai cromosomi batterici. Tutte le modifiche devono essere verificate da Sanger sequenziamento per garantire che non si siano verificate mutazioni casuali. L'uso di una polimerasi ad alta fedeltà ridurrà al minimo questi errori, ma qualsiasi mutazione che si verificano comprometterà la capacità di rilevare il ceppo, che è un altro aspetto critico di questo protocollo. Anche se abbiamo dimostrato che la PCR digitale è in grado di rilevare fino a due copie gDNA in uno sfondo di quasi 2 milioni, i ceppi al di fuori di questo intervallo possono richiedere ulteriori diluizioni per la loro quantificazione accurata. Inoltre, le sequenze di codici a barre del DNA devono essere progettate per facilitare l'uso di sequenze di sonde di alta qualità. Le sequenze di sonde devono essere analizzate per individuare tendenze a auto-dimerisce, formare forcine o legare in modo inefficace i loro obiettivi. L'importanza di utilizzare sequenze di qualità e sonde non può essere minimizzata, un fatto che è evidenziato dagli esperimenti di convalida attenti che devono essere eseguiti con ogni sonda. Gli sforzi per creare codici a barre ottimali del DNA creeranno risultati ottimali per la quantificazione digitale della PCR.
Sebbene i tag molecolari attentamente progettati siano importanti per ottenere risultati di qualità, interpretare i risultati è un altro aspetto critico di questo protocollo. Il CI è definito come il rapporto tra il ceppo mutante e il ceppo di tipo selvaggio nell'uscita diviso per il rapporto dei due ceppi nell'ingresso1,19,20. Questa CI tradizionale presentata nella sezione 9 è utile quando l'infezione mista è costituita da un solo ceppo rispetto a un tipo selvatico. Tuttavia, quando si utilizzano grandi pozze di ceppi per inoculare i media o gli animali, i ceppi non sono solo in competizione con il tipo selvaggio, ma anche contro ogni altro ceppo presente nell'inoculo. Studi precedenti che hanno effettuato esperimenti di competizione utilizzando più ceppi di infettanti non sono riusciti a tenerne conto nei loro calcoli7,13. Per tenere conto di questa caratteristica delle infezioni miste, abbiamo introdotto una formula per calcolare i CI che è stato modificato per le infezioni raggruppate. È improbabile che tutti i ceppi forniscano lo stesso livello di concorrenza che un ceppo di tipo selvaggio sarebbe. Tuttavia, poiché la maggior parte dei geni batterici ha un impatto minimo sulla virulenza, poiché il numero di ceppi utilizzati nell'esperimento dell'indice competitivo aumenta, aumenta la probabilità che la virulenza complessiva tenderà verso la deformazione di tipo selvaggio. Questo potrebbe non essere necessariamente il caso di alcuni progetti sperimentali che utilizzano pool di molti ceppi tutti con difetti di virulenza noti. Tuttavia, questo è rappresentato nell'equazione modificata perché ceppi meno abbondanti(meno in forma) nel risultato avranno un effetto minore sull'uscita X . A seconda della progettazione sperimentale specifica, ci possono essere casi in cui è preferibile l'una o l'altra formula. Nella maggior parte dei casi che coinvolgono infezioni raggruppate, tuttavia, è importante considerare che in un'infezione mista, tutti i ceppi competono l'uno contro l'altro, non solo contro wild-type. Quando si analizzano i risultati, è fondamentale che la logica alla base di ogni formula sia ben compresa per rendere le interpretazioni più accurate della forma fisica del ceppo. Quando si segnalano i risultati, è altrettanto importante rivelare con precisione come sono stati analizzati i dati.
La sezione 9 del protocollo include anche formule per aiutare a determinare le interazioni geniche utilizzando un COI. Con questa analisi, le previsioni possono essere fatte per determinare se due geni della virulenza operano in modo indipendente o insieme. Il COI è definito come il rapporto tra il doppio mutante e il singolo ceppo mutante nell'output diviso per il rapporto dei due ceppi nell'ingresso1. La formula è progettata per rilevare l'additività fenotipica delle interruzioni genetiche. Se i geni funzionano in modo indipendente per migliorare la virulenza, un'interruzione di entrambi i geni dovrebbe causare una diminuzione maggiore della forma fisica rispetto a una singola interruzione di uno solo geni. Se i geni funzionano insieme per migliorare la virulenza (come i geni che codificano due enzimi in un percorso), un'interruzione di entrambi i geni dovrebbe avere lo stesso effetto sulla virulenza come interrompere entrambi i geni. Rilevare l'additività fenotipica può essere difficile nei casi in cui il livello di attenuazione causato da un singolo gene è molto alto o molto basso. Tuttavia, il confronto diretto dei ceppi all'interno dello stesso sistema animale fornisce meno variabilità e un resoconto più affidabile della relazione funzionale tra i geni, e questo calcolo può essere eseguito da due ceppi all'interno di una popolazione mista più grande.
Un ultimo aspetto critico per l'interpretazione dei risultati consiste nel considerare gli effetti delle dinamiche della popolazione. In alcune infezioni miste che hanno più ceppi, un singolo ceppo può emergere come più dominante o meno in forma a causa della deriva casuale della popolazione. Questo fenomeno può essere amplificato quando si verificano eventi di collo di bottiglia. Questo può essere causato dall'utilizzo di un numero molto elevato di ceppi di input, un numero molto piccolo di batteri totali nell'inoculo, o una combinazione di entrambi. Un altro aspetto interferenti che deriva da infezioni miste è la possibilità di in trans complementazione. Ciò si verifica quando un ceppo di adattamento, come il tipo selvatico, migliora artificialmente la virulenza di un ceppo meno in forma. Un esempio ipotetico di questo sarebbe quello di confrontare l'idoneità di una S. Ceppo di Typhimurium Pathogenicity Island 2 (SPI2)-knockout co-infettato con un ceppo di tipo selvatico. SPI2 abilita S. Typhimurium per sopravvivere intracellulare secernendo gli esefattori nel citosol ospite che modificano il fagosoma all'interno di un macrofago. L'interruzione di questo sistema rende S. Typhimurium suscettibile di uccisione intracellulare. Tuttavia, poiché i macrofagi sono in grado di inghiottire due o più batteri contemporaneamente, lo SPI2-knockout potrebbe ricevere un notevole aumento della forma fisica se risiedono nello stesso macrofagio di un selvaggio tipo S. Typhimurium che sta secernendo gli esecali nel citosol ospite. La dinamica casuale della popolazione e la possibilità di una conversione di conversione è una limitazione di qualsiasi esperimento di concorrenza. Se si sospetta la transcomplementazione, i fenotipi dovrebbero essere confermati utilizzando altri metodi complementari per valutare l'idoneità. Per superare le dinamiche della popolazione casuali, aumentando il numero di esperimenti di replica aumenta la probabilità di identificare gli outlier nei risultati. Fortunatamente, il protocollo descritto sopra rende più facile avere un maggior numero di esperimenti di replica identici perché il numero di condizioni sperimentali è drasticamente ridotto.
Un elemento chiave della tecnica CI descritta in precedenza è la sua capacità di essere adattata a quasi tutti gli organismi e a qualsiasi progetto sperimentale che richieda una quantificazione accurata dei microrganismi. Tuttavia, richiede la manipolazione genetica di un organismo per incorporare una sequenza di DNA unica sul cromosoma. L'adattabilità della tecnica richiede che la specie sia geneticamente malleabile e si baserà sulla generazione di protocolli alternativi per la modifica del genoma (passaggi 1 e 2). I codici a barre del DNA elencati nelle tabelle 2 e S1 dovrebbero essere sufficienti per la maggior parte dei batteri; tuttavia, come in tutti gli esperimenti quantitativi di PCR, è pertinente analizzare il genoma batterico per garantire un potenziale minimo per il legame off-target di primer e sonde mediante una semplice analisi BLAST. Le sequenze di codici a barre del DNA utilizzate in questo studio differiscono solo per 3-4 basi in alcuni casi, evidenziando la squisita specificità delle sonde che riduce al minimo il potenziale di legame non specifico. Indipendentemente dalla specificità delle sonde fluorescenti, tutte le nuove sequenze di codici a barre devono essere opportunamente convalidate per la sensibilità e la specificità, come descritto nel passaggio 6. Dopo aver creato ceppi con codice a barre, è possibile adattare questo protocollo a molti tipi di esperimenti oltre ai saggi in vitro come descritto sopra. I ceppi sono adatti per analisi di concorrenza in vivo in topi o altri sistemi di modelli animali. Solo modifiche minime sono necessarie per estrarre gDNA da organi e tessuti animali, e queste modifiche sono ben descritte dai produttori di kit per tali scopi. Inoltre, grandi pool di infezioni miste per la competizione in vivo sono stati utilizzati con successo in precedenza7, offrendo la possibilità di ridurre il numero di animali necessari per un singolo esperimento, che non solo riduce i costi di tali esperimenti ma diminuisce anche il potenziale di variabilità tra animali. Allo stesso modo, i ceppi con codice a barre potrebbero essere utilizzati in altri saggi in vitro che esaminano la suscettibilità dei ceppi a varie condizioni di trattamento (ad esempio antibiotici, suscettibilità agli acidi, uccisioni da specie reattive di ossigeno o azoto, ecc.). Per questi esperimenti, la valutazione dell'inibizione della crescita potrebbe essere ottenuta aggiungendo la sostanza chimica desiderata al mezzo di crescita nel passaggio 3.4 e procedendo come descritto. Per valutare la morte batterica, un grande pool di ceppi potrebbe essere mescolato, e l'input quantificato come descritto sopra. Dopo l'esposizione al trattamento desiderato, le cellule vive potrebbero essere quantificate selettivamente accoppiando la procedura di quantificazione digitale della PCR con la PCR Viability per distinguere tra cellule vive e morte21,22,23 , 24 Mi lasa' di , 25 mi lato , 26.La produttività per tali esperimenti aumenterebbe drasticamente perché le diluizioni e le piastre di replica per ogni ceppo sono sostituite da tecniche molecolari più snelle. Infine, anche se l'analisi della biologia evolutiva e della genetica della popolazione esula dall'ambito di questo documento, gli organismi codificati a barre sono altamente adattabili per tali studi. In definitiva, lo scopo di questo protocollo era quello di sviluppare una potente tecnica per quantificare i batteri che è altamente adattabile per il suo uso in molte specie diverse e in molti tipi di esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal George F. Haddix President's Faculty Research Fund e dal National Institute of General Medical Science dei National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio GM103427. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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