Summary
세균 적합성을 결정하기 위한 이 분자 기반 접근법은 디지털 PCR을 통해 정량화되는 독특한 게놈 DNA 바코드를 사용하여 미생물을 정확하고 정확하게 검출할 수 있도록 합니다. 프로토콜은 살모넬라 균주에 대한 경쟁 지수를 계산하는 것을 설명합니다. 그러나 이 기술은 유전적으로 가단성 유기체의 절대 정량화를 요구하는 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있습니다.
Abstract
경쟁 지수는 세균적 적합성 및/또는 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 접근법의 유용성은 수행하기 쉽고 야생 형 유기체에 많은 균주의 적합성을 표준화하는 능력에 의해 예시됩니다. 이 기술은 그러나, 유효한 자형표 마커 및 동시에 평가될 수 있는 긴장의 수에 의해, 복제 실험의 큰 숫자에 대한 필요를 만드는 제한됩니다. 많은 수의 실험과 동시에, 자형표 마커에 기초한 박테리아를 정량화하기 위한 인건비 및 재료 비용은 중요하지 않다. 긍정적인 양상을 유지하면서 이러한 부정적인 측면을 극복하기 위해, 우리는 세균 염색체에 유전 마커를 엔지니어링 한 후 미생물을 직접 정량화하는 분자 기반 접근법을 개발했습니다. 독특한, 25 염기 쌍 DNA 바코드는 살모넬라의야생 형 및 돌연변이 균주의 염색체에 무해한 궤적에 삽입되었다. 시험관내 경쟁 실험은 풀링된 균주로 구성된 이노큘라를 사용하여 수행하였다. 경쟁 후, 각 스트레인의 절대 숫자는 디지털 PCR을 사용하여 정량화하고 각 변형에 대한 경쟁 지수는 그 값에서 계산되었다. 우리의 데이터는 살모넬라정량화에 대한 이 접근법이 매우 풍부하고 정확하며, 매우 풍부하고(높은 체력) 및 희귀(낮은 피트니스) 미생물을 모두 검출하는 데 매우 민감하고 정확하며 정확하다는 것을 나타냅니다. 또한,이 기술은 미생물의 절대 정량화를 필요로하는 다양한 실험 설계뿐만 아니라 수정 할 수있는 염색체를 가진 거의 모든 유기체에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
Introduction
병원성 유기체의 적합성 과 독성을 평가하는 것은 미생물학 연구의 근본적인 양상입니다. 그것은 균주 사이 또는 돌연변이된 유기체 사이 비교를 가능하게 합니다, 이는 연구원이 특정 조건의 밑에 특정 유전자의 중요성을 결정하는 것을 허용합니다. 전통적으로, 독성 평가는 다른 세균성 긴장을 사용하여 감염된 동물의 결과를 관찰하는 감염의 동물 모형을 이용합니다 (예를 들면 감염성 복용량50,치명적인 복용량50,죽음에 시간, 현상 엄격, 부족의 증상 등) 이 절차는 독성에 대한 귀중한 설명을 제공하지만 야생 형의 변화를 감지하기 위해 결과에 상당한 차이를 일으키기 위해 균주가 필요합니다. 더욱이, 결과는 질병 진행및 현상 엄격이 시간이 지남에 따라 주관적으로 정량화될 수 있기 때문에, 야생 형에 비교된 독성의 해석은 더 질적입니다 (즉, 더, 더 적게, 또는 동등하게 악성). 동물 감염 성 검사를 수행하는 일반적인 대안은 경쟁 지수 (CIs)를 생성하는 것입니다, 직접 혼합 감염에서 야생 형 대응에균주의 적합성 또는 독성을 비교값 1. 이 기술은 야생 형 균주에 독성을 표준화하고 감쇠정도를 반영하는 정량적 값을 결정함으로써 감염의 전통적인 동물 모델에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 취소된 경쟁 지수(COI) 2를 결정함으로써 박테리아에서의유전자 상호작용을 분석하기 위해 적응될 수 있다. 돌연변이 된 유기체의 그룹에 대한 COI를 계산하면 연구원은 두 유전자가 독립적으로 발병 기전에 기여하는지 또는 동일한 독성 경로에 관여하고 서로 의존하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 추가적으로, CI를 계산하는 것은 유기체의 병인에 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 박테리아의 열거를 요구합니다. C와 COIs는 또한 연구원이 임상 질병을 일으키지 않지만 여전히 체력에 차이가있는 avirulent 균주를 어지러이로 할 수 있습니다. 이 기술은 긴장을 확인하기 위하여 전통적인 항생 저항 마커의 사용에 의해 제한되고, 따라서 입력 긴장의 수를 한 번에 하나 또는 두개로 제한합니다. 이러한 제한으로 인해 많은 수의 실험 그룹과 복제가 필요하며, 이는 인건비와 재료 비용을 추가하는 것 외에도 실험 조건의 가변성과 부정확한 결과의 변동성을 증가시킵니다. (독성, 피트니스 및 유전자 상호 작용을 연구하기 위해 혼합 감염을 사용하는 이점과 응용 프로그램에 대한 철저한 검토는 C.R. Beuzón 및 D.W. Holden 1참조)
이러한 한계를 극복하기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 형광 표지세포의 사용이 유세포분석3,4,5를통해 정량화되었다. 이 기술은 1) 표지된 항체를 사용하여 세포에 자형표 또는 2) 내인성 형광 단백질을 생성하여 정량화합니다. 표지된 항체의 사용은 1,000 개의 세포 / mL의 검출한계를 가지고 있으며,따라서 3을 분석하기 위해 많은 수의 세포가 필요합니다. 형광 성 단백질을 발현하는 세포는 변형된 생리학을 가지며 고단백 발현으로 인한 체력 변화에 취약하다6. 두 방법 모두 유세포측정법을 사용하여 검출가능한 형광 마커의 수에 의해 제한된다. 분자 정량화의 발전은 뮤린 모델7에서1,000 개 이상의 균주의 초기 혼합 감염에서 120 개의 균주에서 감쇠를 감지하는 마이크로 어레이 기술의 개발을 통해 달성되었습니다. 이 기술은 결과에 있는 상당한 가변성으로 이끌어 내는 돌연변이된 긴장에서 RNA의 마이크로어레이 분석을 이용했습니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 혼합 된 감염의 큰 풀이 유용한 도구가 될 수 있으며 민감한 검출 기술을 활용하여 세균 독성의 차이를 식별 할 수 있음을 확립했습니다. 차세대 염기서열 분석의 발달로 Tn-seq는 트랜스포종 돌연변이의 유용성을 확장하여 무작위로 돌연변이된 박테리아를 정량화하는강력한 방법을 8,9,10, 11. 트랜스포손의 필요성을 제거하고 대신 DNA 바코드를 사용하여 게놈 변화와 피트니스에 미치는 영향을 보다 쉽게 식별하고 추적하는 대체 프로토콜이 최근에 개발되었습니다12. 이 기술은 중요한 발전이지만 게놈 바코드의 삽입은 여전히 임의의 과정입니다. 이전 실험의 무작위성을 극복하기 위해, Yoon et al.은 박테리아13의염색체 상에서 정확한 위치에 삽입된 독특한 DNA 바코드를 사용하여 살모넬라 균주의 CI를 계산하는 방법을 개발하였다. 고유한 바코드 균주는 각 고유 바코드에 특적인 SYBR 녹색 및 프라이머를 사용한 qPCR 기반 방법을 사용하여 검출되었습니다. 이 기술은 프라이머 효율성의 차이와 낮은 감도를 포함하여 qPCR에 의해 부과된 제약 조건에 의해 제한되었으며, qPCR 이전에 중첩-PCR의 필요성이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근은 표적으로 한 게놈 수정이 다중 세균성 긴장의 풀을 검출하고 잠재적으로 정량화하기 위해 이용될 수 있었다는 것을 보여주었습니다.
다음 프로토콜에서, 우리는 매우 민감한 디지털 PCR 기술을 사용하여 정확한 정량화 뒤에 혼합 inocula의 큰 풀과 세균 경쟁 실험을 수행하는 새로운 방법론을 설명합니다. 프로토콜은 염색체의 무해한 지구에 삽입된 유일한 DNA 바코드를 가진 유전으로 표지하는 세균성 긴장을 관련시킵니다. 이 수정을 통해 기존 직렬 희석, 복제 도금 및 표현형 마커(즉, 항생제 내성)에 의존하는 식민지 형성 단위 를 계산하는 대신 현대 분자 기술을 사용하여 균주를 빠르고 정확하게 정량화할 수 있습니다. ). 수정은 모든 균주가 정확한 동일한 조건에 노출되기 때문에 단일 풀화 접종에서 많은 균주의 동시 평가를 허용, 실질적으로 실험 가변성의 가능성을 감소. 또한, 이 기술은 살모넬라 장테리카 혈청염에서 개발되었지만, 모든 유전적으로 가단성 유기체및 정확한 세균 수가 필요한 거의 모든 실험 설계에 매우 적응력이 있어 새로운 이전 방법에 의해 부과 된 제약없이 미생물학 실험실의 정확성과 처리량을 높이기 위한 도구입니다.
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Protocol
1. 고유 DNA 바코드를 플라스미드에 통합하여 전기 교환에 필요한 구성 요소를 포함
참고: 기존 pKD13 알릴릭 교환 플라스미드에 비해 카피 수가 높고 변환 효율이 향상된 pSKAP라는 새로운 플라스미드가 만들어졌습니다. 이는 단계 1.1-1.12(도1)에 기재되어 있다. 독특한 DNA 바코드와 알레르산화 를 위한 성분을 포함하는 최종 화된 플라스미드는 플라스미드 저장소(재료 표)를 통해 사용할 수 있습니다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 pKD1314 및 pPCR 스크립트 캠 SK+를 루리아-베르타니 (LB) 국물에서 재배한 밤새 세균 배양물에서 50 μg/mL 카나마이신 또는 25 μg/mL 클로람페니콜(pKD13 및 pPCR 스크립트 캠용)으로 보충 SK+, 각각)(표 1).
- 제조 업체의 사양에 따라 상업적 제한 효소 힌드 III와 BamHI를 사용 하 여 두 플라스미드에 제한 소화를 수행 합니다.
- pPCR 스크립트캠 SK+반응에서 제한 효소 및 절제된 DNA를 제거하고 제조사의 사양에 따라 시판되는 DNA 클린업 키트를 사용하여 3,370염기 쌍(bp) 플라스미드 백본을 정화한다.
- pKD13 제한 소화로부터 단편을 전기 동공 챔버를 사용하여 1% 아가로즈 겔상에서 분리한다.
- 청색광 트랜지칠레이터를 사용하여 밴드를 시각화하고 겔로부터 1,333 bp 의단편을 절제한다(도 1C).
참고: 이 단편은 염색체 말투모 대체를 위해 요구되는 FRT 측면 카나마이신 저항 유전자를 포함합니다. - 상용 겔 추출 키트를 사용하여 1.5단계에서 절제된 DNA를 정제한다.
- pSKAP를 생성하려면, pKD13(1.6단계)으로부터 정제된 단편을 pPCR 스크립트 캠 SK+(1.3단계에서)로 리게이트하여 제조사의 사양에 따라 상용 T4 DNA 리가아를 사용한다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 결찰된 pSKAP 플라스미드로 화학적으로 유능한DH5α 세포를 변형시킨다(표 1).
- LB 한천 플레이트에 50 μg/mL 카나마이신을 보충하고 밤새 37°C에서 배양하여 형질전환제를 퍼뜨입니다.
- 접시에서 식민지를 선택하고 50 μg / mL 카나마이신으로 보충 된 새로운 LB 한천 접시에 줄무늬를 하고 37 °C에서 밤새 배양합니다. 이 접시에서 식민지를 골라 LB 국물을 50 μg/mL 카나마이신으로 보충한 접종에 사용하십시오. 일정한 교반으로 37°C에서 밤새 배양한다.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 밤새 세균 배양으로부터 pSKAP를 정화합니다.
- 제조업체의 사양에 따라 Hind III 및 Bam HI를 사용하여 1.11 단계에서 플라스미드의 진단 제한 소화를 수행합니다. 단계 1.4-1.5에서와 같이 1% 아가로즈 겔에 단편을 시각화합니다.
참고: pSKAP 총 크기는 4,703 bp여야 합니다. - PSKAP의 위치(725)에서 독특한 25-염기쌍 DNA 서열을 삽입하는 방식으로 삽입 부위 지시 돌연변이 발생(SDM)(표2 및 S1)을위한 PCR 프라이머를 설계한다(도 2).
참고: 바코드 DNA는 FRT 측면 카나마이신 내성 유전자 바로 바깥쪽에 플라스미드에 삽입되므로 가나마이신 저항 성 카세트를 후속 제거하는 동안 바코드가 손실되지 않습니다. 새로운 바코드 시퀀스를 생성하는 경우 온라인 도구를 사용하여 형광 표지된 표적 별 PCR 프로브(이하 "프로브"라고 함)가 새 시퀀스에 효율적으로 바인딩되도록 합니다. 현재까지 설계된 삽입 시퀀스와 이를 만드는 데 필요한 프라이머가 표 2 및 S1에제공됩니다. - 상업적이고 고충실도 DNA 폴리머라제, 원하는 프라이머 쌍(표2)및 pSKAP 템플릿을 사용하여 SDM 반응을 준비한다. 열사이클러를 설정하여 30초동안 98°C, 2) 10s의 경우 98°C, 15초동안 56°C, 2분 동안 72°C, 3) 반복단계 2, 24회, 4) 5분 동안 72°C, 5) 4°C에서 유지한다.
- PCR이 완료된 후, 반응에 제한 효소 Dpn I를 첨가하여 pSKAP 템플릿을 고갈시. 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
참고: PCR에서 제품 크기와 제품의 순도를 확인 하기 위해 아가로즈 젤에 시각화 해야 합니다. 수정되지 않은 pSKAP 템플릿으로 구성된 대조군 Dpn I 소화를 수행하고 템플릿 DNA가 완전히 소화되도록 하기 위해 후속 단계에서 사용될 수 있다. - 1.15단계에서 제품의 5 μL을 사용하여 제조업체의 권고에 따라 상업적으로 유능한 DH5α 세포의 100 μL을 변형시킵니다.
- LB 한천 플레이트에 25 μg/mL 클로람페니콜을 보충하고 밤새 37°C에서 배양하여 형질전환제를 발라주시킵니다.
- 하룻밤 접시에서 콜로니 (또는 콜로니)를 선택하고 25 μg / mL 클로람페니콜로 보충 된 개별 LB 한천 플레이트에 줄무늬를 하고 37 °C에서 밤새 배양하십시오. 하룻밤 접시에서 식민지를 선택하고 25 μg / mL 클로람페니콜로 보충 된 LB 국물 5 mL을 접종하는 데 사용합니다. 일정한 교반을 가진 37°C에서 밤새 배양 배양체.
- 상업용 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 야간 배양물로부터 플라스미드를 정화합니다.
- Sanger 서열정제는 M13 전방 염기서열 분석 프라이머를 사용하여 플라스미드를 정제하였다(표 2). 돌연변이 된 영역을 원래 플라스미드와 비교하고 SDM 삽입 정확도를 평가합니다.
- 바코드 삽입 및 정확성을 확인한 후 각 바코드와 플라스미드이름을 지정합니다.
참고: 현재까지 생성된 바코드에는 AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC 등 두 글자로 지정되어 있습니다. 바코드 플라스미드는 pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC 등으로 표시됩니다. - 1.14-1.21 단계를 반복하여 원하는 DNA 바코드 수를 생성합니다.
2. S의 염색체에 DNA 바코드를 소개합니다. 티피무리움
참고: S에 DNA 바코드 삽입. 티피무륨 염색체는 Datsenko 및 Wanner14에 의해 기술된 말조 교환 방법을 사용하여 S에서 사용하기 위해 수정된 것을 달성한다. 티피무리움.
- S의 궤적을 결정합니다. DNA 바코드를 삽입하는 티피무륨 게놈(도 3).
참고: 염색체의 큰, 간 내성 영역을 선택합니다. 비코딩 RNA를 생성하는 영역은 피하십시오. 본 연구는 잔기 1,213,840과 1,213,861(게놈 어셈블리 GCA_000022165.1로부터 결정)사이에 P를 넣어의 궤적 다운스트림을 이용하였다. 이 지역은 이전에 유전자15의트랜스 보완을 위해 유전으로 조작되었습니다. 양자택일로, DNA 바코드는 동시에 관심의 유전자를 중단하는 동안 소개될 수 있었습니다. 이렇게 하려면 이 프로토콜을 최소한으로 변경하고 돌연변이 생성을 간소화해야 합니다. - 원하는 pSKAP 바코드 함유 플라스미드로부터 독특한 바코드 및 FRT 측면 카나마이신 내성 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를설계1.21단계(표 2). 단계 2.1에서 선택된 영역에 상동되는 40-뉴클레오티드 확장을 각 프라이머의5' 말단에 추가한다(표 2).
- 상용 고충실도 폴리머라제, 단계 2.2로부터의 프라이머, 및 원하는 pSKAP 바코드 함유 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 증폭을 수행한다. 열사이클러를 설정하여 30초동안 98°C, 2) 10s의 경우 98°C, 3) 15s의 경우 56°C, 4) 60초동안 72°C, 반복단계 2-4 29회, 5분 동안 72°C, 6) 4°C에서 유지한다.
- PCR의 완료 후, 단계 1.15에 기재된 바와 같이 DpnI를 사용하여 템플릿 DNA를 고갈시다. 제조업체의 사양에 따라 상업용 DNA 정화 키트를 사용하여 DNA를 정화하고 농축합니다.
- S. PCR 제품 14,16,17,18에서티피무륨 균주14028s.
참고: 카나마이신 내성 유전자가 염색체로부터 절제되는 것은 필수적이지 않습니다. 그러나, 유전자의 절제는 잠재적인 다운스트림 유전자를 프레임에 남겨둘 129 bp 흉터 귀착되는 세균성 염색체에 최소한으로 파괴적입니다. 가나마이신 내성 유전자를 함유하는 균주는 P22 매개 트랜스덕션을 통해 균주 간에 바코드를 이동하는 데 사용될 수 있으므로 유지되는 것이 좋습니다. - 2.3 – 2.5 단계를 반복하여 적절한 바코드로 원하는 균주를 만듭니다.
참고: 바코드는 야생 형 S에 도입 될 수있다. 그 때 추가 유전 조작을 복종될 수 있는 Typhimurium, 또는 바코드는 이전에 유전으로 변경된 긴장으로 소개될 수 있습니다.
3. 세균 성장 조건 및 시험관 내 경쟁 어 세
- 박테리아 스톡, 줄무늬 희망 S. 티피무리움 균주는 각각 LB 한천 플레이트에 독특한 DNA 바코드를 품고 있습니다. 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이트 플레이트.
- 각 균주에서 단일 콜로니를 선택하고 LB 국물의 5 mL을 접종하십시오. 일정한 교반과 37 °C에서 20 시간 동안 배양.
참고: 하룻밤 배양을 사용하여, 각 바코드 균주로부터 순수한 게놈 DNA(gDNA)를 수집하기 위해 3.5단계로 진행한다. 이는 섹션 6의 후속 유효성 검사 및 제어 실험에 필요합니다. - 각 경쟁 분석에 대해, 각 하룻밤 배양물의 동일한 부피를 적절한 크기의 멸균 튜브로 옮김을 옮김. 철저하게 적어도 5 s에 대한 적극적으로 소용돌이에 의해 함께 균주를 혼합.
참고: 전송하는 각 하룻밤 배양의 부피는 입력을 정량화하기 위해 gDNA를 분리할 뿐만 아니라 각 조건에 대해 충분해야 하며 복제되어야 합니다. 절대 입력 미생물이 디지털 PCR을 사용하여 정량화되기 때문에 배양물의 광학 밀도를 측정하는 것이 전적으로 필요한 것은 아니지만, 각 균주에 대한 입력 박테리아의 수는 병목 현상을 피하기 위해 거의 같아야 합니다. 실험 초기에 불평등한 경쟁을 펼쳤다. 이 프로토콜의 대표적인 경쟁 분석에서는 8종의 성장률을 동시에 비교했습니다. 개별 실험 설계에 추가 또는 더 적은 균주가 필요할 수 있습니다. - 혼합 접종의 100 μL을 4.9 mL 멸균 LB 국물에 옮김. 원하는 시간 또는 원하는 광학 밀도로 37°C에서 배양합니다.
- 1 분 동안 >12,000 x g에서 원심 분리에 의해 접종의 500 μL을 수확하십시오. 세포와 함께 섹션 4로 즉시 진행하십시오.
- 원하는 시점에서 배양 및 수확 세포의 500 μL aliquots를 1 분 동안 >12,000 x g에서 원심 분리하여 제거하십시오.
참고: 여러 시점에서 알리쿼트값을 수집하는 경우, 펠릿을 -20°C에서 동결하거나 각 수집 후 즉시 4.1단계로 진행한다.
4. S에서 gDNA수집 및 정량화 티피무리움(3.5단계 및 3.6단계에서)
- 상업적인 gDNA 정제 키트를 사용하여 세포로부터 gDNA를 수확합니다. 가능한 경우 선택적 RNA 고갈 단계를 수행합니다.
참고: RNA 고갈은 필요하지 않습니다. 그러나 RNA의 존재는 인위적으로 DNA 농도를 증가시켜 후속 단계에서 비정상적인 계산으로 이어집니다. 상업용 gDNA 정제 키트를 사용하는 경우 제조업체의 권장 사항을 따라 컬럼이 DNA로 과부하되지 않도록 하십시오. 샘플이 후속 단계에서 정량화 할 수있는 경우 필요한 최소 DNA 농도가 없습니다. - 분광광도계를 사용하여 각 샘플의 DNA를 정량화합니다.
참고: DNA는 어떤 신뢰할 수 있는 방법을 사용하여 정량화될 수 있습니다. - 다음 방정식을 사용하여 세균 게놈 크기에 기초하여 gDNA 카피 수를 계산합니다: X는 ng에 있는 DNA의 양이고 N은 이중 가닥 DNA 분자의 길이 (게놈 크기)입니다.
참고 : 660 g / 두더지는 1 DNA bp의 평균 질량으로 사용됩니다. 수많은 계산기는 계산을 수행하기 위해 온라인으로 사용할 수 있습니다.
5. dDigital PCR을 통한 DNA 바코드의 정량적 검출을 위한 설계 프라이머 및 프로브
- S. putP의 티피무리움 염색체 다운스트림(도3C 및 표2).
참고: 프라이머 및 프로브 설계는 수많은 온라인프로그램 (재료 표)에 의해 촉진 될 수있다. 바코드가 모두 같은 로시에 삽입되는 경우 모든 바코드에 대해 단일 증폭 프라이머 세트가 보편적입니다. - 각 바코드에 특화된 6-카복플루오레세인(FAM) 기반 및/또는 헥사클로로플루오레세인(HEX) 기반 프로브를 설계합니다(표2 및 S1).
참고: 이 실험에 사용된 액적 리더기는 멀티플렉스 반응에서 FAM 및 HEX 기반 프로브를 동시에 검출할 수 있다. FAM과 1/2를 활용하여 HEX를 활용하는 프로브의 1/2를 설계합니다. 이는 필요한 단계는 아니지만 시약 사용 및 실험 비용을 감소시킬 것이다. - 1) 20 mM의 각 전진 및 역증폭 프라이머, 2) 단일 FAM 프로브의 10 mM, 3) 단일 HEX 프로브의 10 mM을 포함하는 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스(멀티플렉싱하는 경우)를 확인한다.
6. 디지털 PCR을 사용하여 각 게놈 바코드에 대해 설정된 각 Pprimer-프로브세트의 민감도 및 특이성 검증
참고: 이 프로토콜은 8개의 고유한 프로브가 있는 8개의 고유 바코드의 유효성을 검사하는 것을 예로 들 수 있습니다. 다양한 실험 설계를 수용하기 위해 활용되는 바코드 수를 늘리거나 줄이면 됩니다.
- 바코드를 제외한 모든 바코드가 포함된 gDNA 풀을 만듭니다. 이 풀을 희석제로서 사용하여 단일 잔류 바코드를 포함하는 gDNA를 사용하여 희석 계열을 수행한다(샘플 희석 방식은 도4에 제공된다).
참고: 풀링된 gDNA를 희석제로 사용하면 감도를 확인하면서 일관된 배경을 확보할 수 있습니다. 4.3단계에서 결정된 카피 번호를 사용하여 gDNA를 권장 디지털 PCR 범위 내의 카피 번호로 희석합니다(20 μL 반응당 1-100,000부). 범위는 총 gDNA가 아닌 각 고유 대상(바코드)에 대해 설정됩니다. - 프로브 기반 화학용으로 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 중복으로 디지털 PCR에 대한 반응을 준비합니다. 6.1단계에서의 혼합물을 템플릿 DNA로 사용한다. 6.1단계에서 희석된 바코드에 대한 프로브를 포함하는 5.3단계에서 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용하십시오.
- 프로브 기반 화학용으로 설계된 디지털 PCR 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 복제 제어 반응을 준비합니다. 각 프로브 믹스에 대한 제어 반응은 1) 템플릿 컨트롤(NTC), 2) 음성 제어 및 3) 양수 제어로 구성되어야 합니다.
참고: 복제 제어 반응의 최소 수는 2개입니다. 이 예제 프로토콜은 각 바코드에 대해 4개의 NPC, 6개의 네거티브 컨트롤 및 6개의 포지티브 컨트롤을 사용합니다. 네거티브 컨트롤에는 테스트 중인 프로브에 해당하는 바코드를 제외한 각 바코드가 포함된 gDNA가 포함되어야 합니다. 이렇게 하면 각 프로브의 특이성이 확인됩니다. - 6.1-6.3 단계를 반복하여 각 바코드 gDNA 샘플에 대한 디지털 PCR 반응을 생성합니다. 샘플 플레이트 배열은 도5에 제시되어 있다.
참고: 이 단계와 후속 단계는 물방울 및 유량 기반 기술을 활용하는 특정 디지털 PCR 플랫폼을 기반으로 설명합니다. 칩 기반 기술을 활용하는 대체 디지털 PCR 플랫폼은 이 프로토콜을 약간 수정하여 쉽게 대체할 수 있습니다. 6.4단계는 모든 프라이머 세트를 검증하기 위해 하나 이상의 96웰 플레이트가 필요할 수 있다. qPCR과 달리 디지털 PCR로 분석된 별도의 플레이트는 플레이트 간에 표준화된 기준 웰없이 쉽게 비교할 수 있습니다. - 제조업체의 지침에 따라 액적 발생기를 사용하여 각 반응 상태에 대한 액적을 생성합니다.
- 새로 생성된 물방울을 적절한 96웰 플레이트에 옮김을 옮김. 5-50 μL 멀티채널 파이펫에 200 μL 파이펫 팁을 사용하십시오.
참고: 파이펫을 피펫팅 할 때, 피펫을 천천히 매끄럽게! 디지털 PCR 장비 제조업체는 특정 제조업체(예: Ranin)의 파이펫 및 파이펫 팁만 사용하는 것이 좋습니다. 이 파이펫 팁은 물방울을 파괴하거나 액적 리더의 미세 유체를 손상시킬 수있는 미세한 플라스틱 조각이없는 부드러운 개구부를 가지고 있습니다. 팁의 수많은 브랜드를 검사 하 고 제조 품질의 스펙트럼을 관찰 했다. 파이펫 팁 대안을 사용하여 동등한 결과를 얻었습니다. 그러나 제조업체의 권장 사항에서 벗어날 때는 주의해야 합니다. - 모든 물방울이 생성되고 옮겨진 후, 호일 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉합니다.
- 다음 사이클링 조건을 수행하기 위해 제조업체권장 열자전거 를 사용하십시오: 1) 10 분 동안 94 °C; 2) 1 분 동안 94 °C, 1 °C / s로 설정된 램프 속도; 3) 2 분 동안 55 °C, 1 °C / s로 설정된 램프 속도; 4) 2단계와 3단계 49번반복; 5) 10 분 동안 98 °C; 6) 최대 24시간 까지 4°C에서 유지합니다.
참고: 액적 반응의 열 전달은 표준 PCR과 동일하지 않습니다. 반응 조건은 수정이 필요할 수 있습니다. - 열순환이 수행되는 동안 샘플 이름, 실험 유형(절대 정량화), 슈퍼믹스 사용, 대상 1 명(FAM 바코드 이름), 대상 1형(NTC, 포지티브 컨트롤, 음수 제어 또는 알 수 없음), 대상 2 이름(HEX 바코드 이름), 대상 2 유형(빈, 양수 제어, 음수 제어 또는 알 수 없음). 최종 플레이트 설정 정보는 그림5에 나와 있습니다.
- 열순환이 완료되면 완성된 반응을 액적 리더기로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 판독 프로세스를 시작합니다.
7. 경쟁 지수 실험에서 박테리아의 수를 정량화
- 위에서 설명한 바와 같이 gDNA를 단리하고 섹션 4로부터 적절한 농도로 정량화한 희석.
- 적절한 슈퍼믹스를 사용하기 위한 제조업체의 권장 사항에 따라 디지털 PCR에 대한 반응을 준비합니다. 7.1단계의 DNA를 템플릿으로 사용합니다. 실험에 존재하는 가능한 바코드에 대한 프로브(또는 FAM 및 HEX를 모두 검출하는 경우 프로브)가 포함된 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용합니다.
- 실험 설계에 사용되는 모든 바코드가 감지될 때까지 다른 20x 프라이머-프로브 마스터 믹스를 사용하여 7.2 단계에서와 같이 추가 디지털 PCR 반응을 준비합니다.
- 6.3에 설명된 대로 각 조건에 대한 컨트롤을 포함합니다. 여기에는 1) 템플릿 컨트롤(NTC), 2) 음성 컨트롤 및 3) 양수 컨트롤이 포함됩니다.
- 6.5-6.10 단계에 설명된 대로 프로토콜을 계속 합니다.
8. 디지털 PCR 데이터를 분석하고 절대 복사 수를 계산
- 모든 웰을 읽고 실행이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 .qlp 데이터 파일을 엽니다.
참고: 여기에 설명된 파일 형식 및 데이터 분석 절차는 한 디지털 PCR 제조업체에 만해당합니다. 대체 디지털 PCR 플랫폼을 사용하는 경우 파일 형식 및 데이터 분석 절차는 사용되는 플랫폼에 따라 다르며 제조업체의 권장 사양에 따라 수행해야 합니다. - 동일한 프라이머 프로브 마스터 믹스를 사용하는 모든 웰을 선택합니다.
- 액적 탭에서 각 우물에서 분석된 액적 의 수(양수 액적 및 음수 방울 모두)를 검사합니다. 총 액적 수가 10,000개 미만인 우물을 분석에서 제외합니다.
- 1D 진폭 탭으로 이동하여 양수 및 음수 방울의 진폭을 검사합니다. 두 개의 고유한 채우기로 구성되도록 합니다.
- 소프트웨어 내에서 임계값 기능을 사용하여 활용된 각 프로브에 대해 양수 액적과 음수 방울 사이의 컷오프를 만듭니다(그림 6).
참고: 5.3 단계에서 동일한 프라이머 프로브 마스터 믹스를 사용하는 모든 웰은 동일한 임계값을 가져야 합니다. - 모든 웰에 적절한 임계값이 적용되면 소프트웨어는 각 반응의 DNA 사본 수를 계산합니다. 추가 분석을 용이하게 하기 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
참고: 데이터 분석 소프트웨어는 푸아송 분포에 맞는 양수 및 음수 방울수를 사용하여 복사 수를 결정합니다. - 8.6단계의 값을 사용하여 샘플의 각 고유 게놈 바코드의 초기 카피 수를 계산합니다. 음의 대조반응에서 평균 가양성 비율을 결정하고 실험 반응에서 얻은 값에서 이 값을 뺍니다. 각 실험을 설정할 때 수행된 희석에 따라 필요에 따라 값을곱합니다(표 3).
9. 바코드 균주의 디지털 PCR 기반 정량화에서 CI 또는 COI를 계산하여 유기체의 상대적 적합성 결정
- 다음 수식을 사용하여 바코드 균주의 CI를 계산합니다: 출력은 주어진 시점에서 바코드 균주의 절대 정량화이며, WT출력은 바코드형 야생 박테리아의 절대 정량화입니다. 시간 포인트, 입력은 바코드 균주의 입력 접종의 절대 정량화, WT입력은 바코드 야생 형 박테리아의 입력 접종의 절대 정량화, X출력은 모든 균주의 합계입니다 동일한 타임포인트에서 X Input은 모든 바코드 균주의 총 입력 접종을 합산한 것입니다.
참고: 각 수식의 장점, 단점 및 가장 적절한 사용에 대한 토론을 참조하십시오.
- 모든 시점에서 각 바코드 변형률에 대해 9.1 단계를 반복합니다.
- 해당되는 경우 다음 수식을 사용하여 COI를 계산합니다:출력은 주어진 시점에서 돌연변이 유전자 A가 있는 바코드 균주의 절대 정량화이며, AB출력은 바코드형 균주의 절대 정량화입니다. 돌연변이 된 유전자 A와 B를 동시에 동시에 입력하면, A입력은 돌연변이 유전자 A를 가진 바코드 균주의 입력 접종의 절대 정량화이며, AB입력은 입력 접종의 절대 정량화입니다. 돌연변이 유전자 A와 B를 가진 바코드 균주의, B출력은 주어진 시점에서 돌연변이 유전자 B를 가진 바코드 된 긴장의 절대 정량화이고, B입력은 입력의 절대 정량화입니다 돌연변이 유전자 B와 바코드 균주의 접종 .
및/또는
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Representative Results
이 방법론의 사용은 표적 DNA를 확인하기 위하여 이용된 각 탐사기의 감도 그리고 특이성을 확인하기 위하여 적당한 통제 반응이 수행된다는 것을 요구합니다. 이 대표적인 실험에서, 우리는 식별을 위해 8개의 해당 프로브로 8개의 고유 DNA 바코드를 검증했습니다. 모든 8개의 프로브는 NTC 및 음성 대조반응 모두에서 거짓양성의 낮은 비율을 가졌고(표 3), 매우 유사한 DNA 서열 들 사이에서도 그들의 특이성을 강조했다. 각 조건의 감도를 평가하기 위해, 독특한 바코드를 포함하는 gDNA는 7개의 나머지 바코드 서열 각각을 포함하는 gDNA의 일정한 배경에서 연속적으로 희석되었다. 위에서 설명한 접근법으로, 디지털 PCR은 거의 2,000,000개의 유사한 DNA 서열의 배경에있는 gDNA의 2 사본만큼 적게 구별할 수 있었습니다 (표 3).
각 프로브 및 DNA 바코드 서열의 민감도와 특이성을 결정하는 것 외에도 검증 연구에서 수행된 희석을 통해 결과 데이터에서 시뮬레이션된 경쟁 지수를 계산할 수 있었습니다. 이 실험에 대한 실제 입력이나 출력은 없었지만 경쟁 실험이 수행된 것처럼 데이터를 분석할 수 있습니다. 이를 위해, 우리는 희석 된 바코드에 대한 출력(A 출력)으로 직렬 희석의 각 혼합물을 고려하고, 동안 총 출력 (X출력),입력 (A입력),및 각 변형의 총 입력 (X 입력)에서 계산됩니다. 모든 바코드가 포함된 포지티브 컨트롤의 정량화. 각 혼합물에 대한 희석 인자를 사용하여, 이론적 CI를 결정하고 표3에 보고된다. 각 바코드에 대해 수행된 각 희석 계열에서 평균 시뮬레이션된 CI는 각 중복 희석 계열에 대한 표준 편차와 함께 보고됩니다. 모든 경우에 계산된 시뮬레이션된 CI는 이론적 CI와 유사합니다. 계산된 CI의 대부분은 이론적 인 CI에서 25 % 미만으로 이탈합니다. 이론적 인 CD가 낮은 경우 계산 된 값의 편차가 2 배 이상이었습니다. 예를 들어 이론적 CI0.000625에서 계산된 CI 0.001220으로의 변화를 나타냈습니다. 이러한 데이터는 설명된 방법이 매우 정확하고 매우 정확하다는 것을 강조합니다. 높은 감도, 특이성, 정확도 및 정밀도의 조합을 통해 이 시스템은 눈에 띄지 않을 수 있는 체력의 차이를 안정적으로 감지할 수 있습니다.
게놈 바코드가 정확하게 검출되고 정량화될 수 있음을 검증한 후, 시험관내경쟁 실험을 수행하였다(표 4). 첫 번째 경쟁 실험은 8 개의 야생 형 S를 활용했습니다. 각각 독특한 DNA 바코드를 함유한 티피무리움 균주. 각 균주는 하룻밤 재배되었고, 8개의 배양체를 동일한 양으로 혼합하였다. 이 혼합 접종의 100 μL은 멸균 LB 국물의 4.9 mL를 접종하는데 사용되었고, 생성된 배양은 일정한 교반으로 37°C에서 배양하였다. gDNA는 각 균주의 정확한 입력을 계산하기 위해 접종으로부터 수확되었다. 배양의 성장은 600 nm(OD 600)에서흡광도를 측정하여 모니터링하였다. OD600 = 0.5(로그학 상)에서, 각 배양물로부터 샘플을 수집하고 gDNA를 수확하였다. 나머지 배양액은 최종 시료를 수집하고 gDNA를 수확(고정)할 때 접종 후 8시간까지 일정한 교반을 통해 37°C로 되돌아왔다. 풀린 감염에 대해 수정된 CI 수식을 사용하여 결과를 계산하였다. 예상대로 모든 야생형 균주는 CI 값이 1(표4)과 거의 동일합니다. 8개의 돌연변이 S를 사용하여 유사한 경쟁 실험을 수행하였다. 타이피무리움 균주는 각각 단일, 이중 또는 삼중 트랜스케톨라아제 결핍18이외에 고유한 바코드를 가졌다. 앞서 도시된 바와 같이, 균주는 모두 LB 국물에서 유사하게 자랐으며, 삼중 트랜스케톨아제 결핍 균주에서 관찰된 약간의 지연만 있었다. 그러나, 각 균주의 성장을 CI를 분석하여 평가했을 때, 트랜스케탈아제 결핍 균주에 대해 훨씬 더 심오한 결함이 관찰되었다(CI는 쇼 등에서의 성장 곡선과 비교되었다.18). 또한, 이 실험을 통해 우리는 단순히 질적으로 성장 패턴을 설명하는 대신 각 균주의 성장 특성에 정량적 인 값을 할당 할 수 있었습니다. 각 균주에 대한 C는 각 균주가 야생 유형과 비교된 기존의 공식과 모든 입력 균주를 고려한 수정된 수식을 모두 사용하여 계산되었습니다. 변화는 작지만, 삼중 트랜스케탈아제 결핍 균주의 CI는 기존의 포뮬러에서 인위적으로 낮았는데, 이는 모든 것이 거의 야생형의 체력을 나타내는 다른 6개의 경쟁 균주를 고려하지 않기 때문이다.
| 변종 | 유전자 형 | 소스 또는 참조 |
| S. 티피무리움 ATCC 14028s | 와일드 타입 | ATCC |
| TT22236 | PTP2223을 운반하는 LT2 살모넬라 | (27) |
| DH5α | F– φ80lacZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F)U169 recA1 끝A1 hsdR17 (rK–mK+) phoA supE44 λ–thi-1 gyrA96 릴A1 | (28) |
| JAS18077 | putP::AA::FRT | 이 연구는 |
| JAS18080 | putP::광고::FRT | 이 연구는 |
| JAS18083 | putP::AG::FRT | 이 연구는 |
| JAS18088 | putP::AL::FRT | 이 연구는 |
| JAS18091 | putP::AO::FRT | 이 연구는 |
| JAS18096 | putP::AT::FRT | 이 연구는 |
| JAS18099 | putP::AW::FRT | 이 연구는 |
| JAS18100 | putP::AX::FRT | 이 연구는 |
| JAS18122 | ΔtktA::FRT 풋P::AD::FRT | 이 연구는 |
| JAS18130 | ΔtktB::FRT 풋P::AL::FRT | 이 연구는 |
| JAS18138 | ΔtktC::FRT 풋P::AT::FRT | 이 연구는 |
| JAS18125 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRT 풋P::AG::FRT | 이 연구는 |
| JAS18133 | ΔtktA::FRT ΔtktC::FRT 풋P::AO::FRT | 이 연구는 |
| JAS18141 | ΔtktB::FRT ΔtktC::FRT 풋P::AW::FRT | 이 연구는 |
| JAS18142 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRT ΔtktC::FRT 풋P::AX::FRT | 이 연구는 |
| 플라스 미드 | ||
| pKD13 | 블라 (것)과 FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) |
| pPCR 스크립트 캠 SK + | 콜레1 오리; CmR | 지층/알리젠트 |
| pTP2223 | Plac 라메 내기 엑소 테트R | (16) |
| pCP20 | 블라 고양이 cI857 PR플랩 pSC101 oriTS | (29) |
| pSKAP | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT | 이 연구는 |
| pSKAP_AA | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; AA | 이 연구는 |
| pSKAP_AD | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; 광고 (광고) | 이 연구는 |
| pSKAP_AG | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; AG (주)( | 이 연구는 |
| pSKAP_AL | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; 알 (미국) | 이 연구는 |
| pSKAP_AO | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; AO (주)(주) | 이 연구는 |
| pSKAP_AT | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; 에서 | 이 연구는 |
| pSKAP_AW | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; AW (주) | 이 연구는 |
| pSKAP_AX | 콜레1 오리; CmR; 블라 (것)과 FRT ahp FRT; 도끼 (주) | 이 연구는 |
표 1: 본 연구에 사용된 균주 및 플라스미드.
| 이름 | 시퀀스(5' - 3')1,2,3 |
| pSKAP SDM AA - F | 아가그CTCTTGCTGCTTGAGT 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AA - R | ACTCAAGCACCAGCAGAGACTTCT CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AD - F | 아가그그그그그그가타그 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AD - R | CCTACTATCTCACGCTCTTTCtTTTTTTTTTT CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AG - F | AGTAGGTCCTGGAGGAGCATGA 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AG - R | TCACATGCTCCCCACACACT CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - F | 아카카카트카그카그카그타그CT CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AL - R | 아그크타그트GCTCGGTGGT 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AO - F | GT카아카카카카그카그가트가트 CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AO - R | 아그타크크가그GTGTGGGGGGGGAC 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AT - F | ACCAGTCCGTGACATGGGGTAGAC 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AT - R | GT타카트카카각택트 CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AW - F | 아그액트가트가트GTGTGGACG 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AW - R | CGTCACATCCACATCACTCAGTCGT CTCAACGTGTAATGCTG |
| pSKAP SDM AX - F | 액타트CGGTTACGACAGGCTG 가트GT그타그그그그그그그그그그그그그 |
| pSKAP SDM AX - R | 카GCCTGTCGTTACACCACGATAGT CTCAACGTGTAATGCTG |
| M13 - F | GTAAACGACGGCCAG |
| putP 재결합 - F |
타그가가가가가카카GT타타타타 TGCAGCATTACACC |
| putP 재결합 - R |
택트GCGTATATT가아카카타카카카트 CCTGCAGTTCGAAGTTCC |
| qPCR 바코드 영역 증폭 - F1 | TGCAGCATTACACGTCTTG |
| qPCR 바코드 영역 증폭 - R2 | 타가액트CGAAGCAGC |
| 바코드 AA 프로브 - FAM | 6-FAM/아가아GTCTC/젠/CTGCTGCTTGC/IBFQ |
| 바코드 AD 프로브 - FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGTAGGC/IBFQ |
| 바코드 AG 프로브 - FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ |
| 바코드 AL 프로브 - FAM | 6-FAM/아그크태그/젠/GCCTTCGATGTGGTC/IBFQ |
| 바코드 AO 프로브 - HEX | 헥스/아그타크랙트/젠/가그GTGTGTGGGACC/IBFQ |
| 프로브에서 바코드 - HEX | 헥스/ACCAGTC/젠/CGTGACATGGTTAGACC/IBFQ |
| 바코드 AW 프로브 - HEX | 헥스/아CGACTGAG/젠/TGATGTGTGACGC/IBFQ |
| 바코드 AX 프로브 - HEX | 헥스/액타CGTG/젠/GTGTACGACAGGCTGC/IBFQ |
|
1개 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 SDM 후에 pSKAP에 삽입되는 각 DNA 바코드에 대한 상보적인 서열을 나타낸다. 2개 이중 밑줄이 그어진 뉴클레오티드는 S. 말기 보충을 위해 사용된 티피무리움 염색체. 3개 PrimeTime qPCR 프로브는 5' 형광 염료, 6-카박스플루오레세인(6-FAM) 또는 헥사클로로플루오레세인(HEX), 내부 퀴시커(ZEN), 3' 퀴커 아이오와 블랙® FQ(IBFQ)로 표시된 혼성화 올리고입니다. |
|
표 2: 본 연구에 사용된 프라이머 및 프로브.
| 정량화 (사본 / 20μL 반응) | ||||||||
| 설명 | Aa | 광고 | Ag | 알 | 아오 | 에 | 아 | 도끼 |
| Ntc | 해당/A | 0.000 | 0.000 | 3.510 | 해당/A | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.600 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 3.510 | 0.000 | 1.280 | 1.180 | 2.340 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| Ntc | 2.290 | 0.000 | 0.000 | 1.200 | 1.150 | 1.160 | 0.000 | 0.000 |
| 의미 | 3.133 | 0.000 | 0.320 | 1.473 | 1.163 | 0.290 | 0.000 | 0.000 |
| 부정적인 | 5.130 | 1.156 | 0.000 | 1.124 | 3.745 | 1.281 | 7.354 | 7.142 |
| 부정적인 | 5.270 | 0.000 | 0.000 | 1.087 | 1.666 | 1.643 | 7.746 | 2.269 |
| 부정적인 | 2.660 | 0.000 | 1.361 | 1.451 | 8.974 | 0.000 | 해당/A | 0.000 |
| 부정적인 | 6.090 | 0.000 | 0.000 | 2.251 | 0.000 | 2.531 | 8.700 | 3.495 |
| 부정적인 | 1.740 | 0.000 | 1.086 | 2.130 | 4.171 | 0.000 | 7.113 | 5.522 |
| 부정적인 | 6.220 | 3.581 | 0.000 | 4.022 | 1.175 | 1.341 | 해당/A | 5.950 |
| 의미 | 4.518 | 0.789 | 0.408 | 2.011 | 3.288 | 1.133 | 7.728 | 4.063 |
| 긍정적인 | 22281.540 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
| 긍정적인 | 23989.676 | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660 | 47456.973 | 15096.601 | 47929.840 | 22455.234 |
| 긍정적인 | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820 | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270 | 21467.840 |
| 긍정적인 | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473 |
| 긍정적인 | 20218.238.02.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.938 |
| 긍정적인 | 18531.740 | 41620.801 | 해당/A | 48082.313 | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992 | 21117.559 |
| 의미 | 20652.601 | 42116.824 | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827 | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
| 빈 뺄셈 | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
| 원액 A | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305 | 62844.068 | 27567.828 |
| 원액 B | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
| 1/50 A | 521.670 | 755.035 | 1066.898 | 1287.187 | 1053.339 | 181.324 | 1278.336 | 580.961 |
| 1/50 B | 435.326 | 634.215 | 1168.087 | 1383.537 | 991.040 | 165.443 | 1180.445 | 596.461 |
| 1/100 A | 228.028 | 598.848 | 603.911 | 631.116 | 507.956 | 258.405 | 665.647 | 331.590 |
| 1/100 B | 256.330 | 585.834 | 583.325 | 670.875 | 459.325 | 289.207 | 638.916 | 307.948 |
| 1/200 A | 121.283 | 305.293 | 258.247 | 346.965 | 234.774 | 114.163 | 169.055 | 172.553 |
| 1/200 B | 114.638 | 313.040 | 253.685 | 297.216 | 191.637 | 179.895 | 280.989 | 147.297 |
| 1/400 A | 42.829 | 141.343 | 127.337 | 163.605 | 해당/A | 71.241 | 157.697 | 85.976 |
| 1/400 B | 59.544 | 180.543 | 162.080 | 162.108 | 115.508 | 104.682 | 151.141 | 87.804 |
| 1/800 A | 34.304 | 67.934 | 65.939 | 83.857 | 66.134 | 31.784 | 82.722 | 45.616 |
| 1/800 B | 20.390 | 80.222 | 81.453 | 85.325 | 53.102 | 38.034 | 55.460 | 29.660 |
| 1/1600 A | 15.405 | 44.505 | 47.672 | 39.613 | 33.027 | 18.006 | 37.655 | 20.988 |
| 1/1600 B | 22.091 | 48.828 | 46.781 | 37.388 | 30.245 | 30.138 | 34.553 | 19.795 |
| 1/3200 A | 12.333 | 22.104 | 16.850 | 18.403 | 11.460 | 10.535 | 21.245 | 9.218 |
| 1/3200 B | 6.796 | 32.555 | 15.742 | 26.249 | 15.111 | 9.908 | 23.393 | 10.175 |
| 빈 뺄셈 | ||||||||
| 원액 A | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
| 원액 B | 18273.655 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860 | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
| 1/50 A | 517.152 | 754.246 | 1066.490 | 1285.176 | 1050.051 | 180.192 | 1270.607 | 576.898 |
| 1/50 B | 430.808 | 633.426 | 1167.679 | 1381.526 | 987.751 | 164.311 | 1172.717 | 592.398 |
| 1/100 A | 223.509 | 598.059 | 603.503 | 629.105 | 504.668 | 257.272 | 657.918 | 327.527 |
| 1/100 B | 251.812 | 585.044 | 582.918 | 668.864 | 456.036 | 288.074 | 631.187 | 303.885 |
| 1/200 A | 116.765 | 304.503 | 257.840 | 344.954 | 231.486 | 113.030 | 161.327 | 168.490 |
| 1/200 B | 110.120 | 312.251 | 253.277 | 295.205 | 188.348 | 178.762 | 273.261 | 143.234 |
| 1/400 A | 38.310 | 140.554 | 126.929 | 161.594 | 해당/A | 70.108 | 149.968 | 81.913 |
| 1/400 B | 55.026 | 179.753 | 161.672 | 160.097 | 112.219 | 103.549 | 143.413 | 83.741 |
| 1/800 A | 29.786 | 67.145 | 65.531 | 81.847 | 62.846 | 30.651 | 74.994 | 41.553 |
| 1/800 B | 15.872 | 79.433 | 81.045 | 83.314 | 49.813 | 36.901 | 47.732 | 25.596 |
| 1/1600 A | 10.886 | 43.716 | 47.264 | 37.602 | 29.739 | 16.874 | 29.927 | 16.925 |
| 1/1600 B | 17.573 | 48.039 | 46.373 | 35.377 | 26.957 | 29.005 | 26.825 | 15.732 |
| 1/3200 A | 7.815 | 21.314 | 16.442 | 16.392 | 8.172 | 9.402 | 13.517 | 5.155 |
| 1/3200 B | 2.278 | 31.765 | 15.334 | 24.238 | 11.822 | 8.776 | 15.664 | 6.112 |
| 시뮬레이션된 CI | ||||||||
| 원액 A | 1.114895 | 1.055372 | 1.321619 | 1.114419 | 1.285650 | 1.176251 | 1.316329 | 1.294932 |
| 원액 B | 0.885005 | 0.837016 | 1.220911 | 1.439279 | 0.999312 | 1.019279 | 1.272698 | 1.248618 |
| 1/50 A | 0.025046 | 0.017909 | 0.023931 | 0.028018 | 0.024348 | 0.011675 | 0.026617 | 0.027102 |
| 1/50 B | 0.020864 | 0.015040 | 0.026202 | 0.030118 | 0.022903 | 0.010646 | 0.024567 | 0.027831 |
| 1/100 A | 0.010825 | 0.014200 | 0.013542 | 0.013715 | 0.011702 | 0.016669 | 0.013782 | 0.015387 |
| 1/100 B | 0.012195 | 0.013891 | 0.013080 | 0.014582 | 0.010574 | 0.018665 | 0.013222 | 0.014276 |
| 1/200 A | 0.005655 | 0.007230 | 0.005786 | 0.007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
| 1/200 B | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0.011582 | 0.005724 | 0.006729 |
| 1/400 A | 0.001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | 해당/A | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
| 1/400 B | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
| 1/800 A | 0.001443 | 0.001594 | 0.001470 | 0.001784 | 0.001457 | 0.001986 | 0.001571 | 0.001952 |
| 1/800 B | 0.000769 | 0.001886 | 0.001819 | 0.001816 | 0.001155 | 0.002391 | 0.001000 | 0.001203 |
| 1/1,600 A | 0.000527 | 0.001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
| 1/1,600 B | 0.000851 | 0.001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0.001879 | 0.000562 | 0.000739 |
| 1/3,200 A | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 |
| 1/3,200 B | 0.000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
| 평균 CI(이론적) | ||||||||
| 원액 (1) | 0.999950 | 0.946194 | 1.271265 | 1.276849 | 1.142481 | 1.097765 | 1.294514 | 1.271775 |
| 1/50 (0.02) | 0.022955 | 0.016474 | 0.025067 | 0.029068 | 0.023625 | 0.011161 | 0.025592 | 0.027466 |
| 1/100 (0.01) | 0.011510 | 0.014046 | 0.013311 | 0.014148 | 0.011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0.014832 |
| 1/200 (0.005) | 0.005494 | 0.007322 | 0.005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
| 1/400 (0.0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0.00260* | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
| 1/800 (0.00125) | 0.001106 | 0.001740 | 0.001645 | 0.001800 | 0.001306 | 0.002188 | 0.001285 | 0.001577 |
| 1/1,600 (0.000625) | 0.000689 | 0.001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0.001486 | 0.000594 | 0.000767 |
| 1/3,200 (0.000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
| 표준 편차 | ||||||||
| Undiluted | 0.11494 | 0.10918 | 0.05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0.02182 | 0.02316 |
| 1/50 | 0.00209 | 0.00143 | 0.00114 | 0.00105 | 0.00072 | 0.00051 | 0.00103 | 0.00036 |
| 1/100 | 0.00069 | 0.00015 | 0.00023 | 0.00043 | 0.00056 | 0.00100 | 0.00028 | 0.00056 |
| 1/200 | 0.00016 | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0.00213 | 0.00117 | 0.00059 |
| 1/400 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 | 0.00002 | 0* | 0.00108 | 0.00007 | 0.00004 |
| 1/800 | 0.00034 | 0.00015 | 0.00017 | 0.00002 | 0.00015 | 0.00020 | 0.00029 | 0.00037 |
| 1/1,600 | 0.00016 | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 | 0.00003 | 0.00039 | 0.00003 | 0.00003 |
| 1/3,200 | 0.00013 | 0.00012 | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 | 0.00002 | 0.00002 |
| *단일 실험의 결과를 나타냅니다. | ||||||||
표 3: 절대 정량화 및 시뮬레이션된 CI 계산.
| 조건 | 경쟁 지수1 | |||||||
| 실험 1 | ||||||||
| WTAA | WTAD | WTAG | WT알 | WTAO | WTAT | WTAW | WT도끼 | |
| 로그 | 0.927 ± 0.033 | 0.992 ± 0.031 | 1.068 ± 0.025 | 0.921 ± 0.02 | 1.044 ± 0.03 | 1.051 ± 0.057 | 1.094 ± 0.027 | 0.929 ± 0.005 |
| 고정 | 1.1 ± 0.021 | 1.071 ± 0.053 | 1.079 ± 0.065 | 0.948 ± 0.02 | 0.98 ± 0.02 | 0.873 ± 0.044 | 0.97 ± 0.056 | 1.021 ± 0.007 |
| 실험 2 | ||||||||
| CI(전통) | WTAA | ΔA광고 | ΔBAL | ΔCAT | ΔABAG | ΔACAO | ΔBCAW | ΔABCAX |
| 로그 | 1 ± 0 | 0.802 ± 0.084 | 0.957 ± 0.02 | 0.989 ± 0.073 | 0.581 ± 0.153 | 0.86 ± 0.053 | 0.995 ± 0.011 | 0.695 ± 0.061 |
| 고정 | 1 ± 0 | 0.97 ± 0.063 | 1.043 ± 0.058 | 0.99 ± 0.036 | 1.625 ± 0.589 | 0.835 ± 0.051 | 0.912 ± 0.047 | 0.477 ± 0.049 |
| CI (풀드 접종) | ||||||||
| 로그 | 1.114 ± 0.039 | 0.864 ± 0.074 | 1.073 ± 0.032 | 1.1 ± 0.068 | 0.633 ± 0.152 | 0.938 ± 0.056 | 1.111 ± 0.043 | 0.746 ± 0.06 |
| 고정 | 1.078 ± 0.039 | 1.039 ± 0.049 | 1.166 ± 0.093 | 1.066 ± 0.01 | 1.735 ± 0.613 | 0.876 ± 0.035 | 0.97 ± 0.045 | 0.49 ± 0.047 |
| 1개 값은 3개 또는 4개의 복제 실험에 대한 평균 CI± 표준 편차를 나타냅니다. | ||||||||
표 4: S.사이의 체외 내 경쟁에서 대표적인 결과. 티피무륨 균주.
표 S1. 추가 바코드 시퀀스와 검출을 위한 해당 형광 프로브를 생성하기 위한 옵션 프라이머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1. pSKAP 의 생성. (A) 정제된 pKD13은 힌드III 및 밤히와 함께 제한 소화를 행하였다. (B, C) FRT-측면 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 관심의 1,333 bp 단편을 정제하였다. (D) pPCR 스크립트캠 SK+는 또한 HindIII 및 BamHI로 소화되었고 pKD13(B)로부터의 단편을 생성하기 위해 (E) pSKAP를 생성하기 위해 결찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: pSKAP에 삽입 부위 지시 돌연변이 발생. (a) 위치 725에서 25 bp DNA 바코드를 삽입하여 PCR을 사용하여 수행하였다. 그 위치에 특이적인 전진 및 역방향 프라이머는 상보적인 25-뉴클레오티드 5' 확장으로 설계되었다(소문자 "a"로 프라이머에 표시). (B) SDM에서 유래한 일반적인 pSKAP_Barcode 플라스미드는 삽입된 DNA 바코드의 위치와 함께 주황색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: putP의하류 염색체 재배열. (a) λ-Red 매개 재조합 후, FRT 부위(회색)에 의해 측면에 있는 선택 가능한 카나마이신 내성 유전자(진한 보라색)가 지시된 로시 사이의 염색체 상에 삽입된다(염색체 재조합 부위, 적색). 독특한 DNA 바코드(주황색)는 FRT 부위 바로 바깥에 삽입된다. (B) 카나마이신 내성 유전자는 FRT 매개 절제에 의해 제거되고, DNA 바코드와 FRT 흉터로 구성된 염색체(총 삽입 DNA, 파란색)에 삽입된 DNA의 잔재를 남긴다. (C) 삽입된 DNA를 둘러싼 변형된 염색체 DNA 서열이 디지털 PCR에 사용되는 증폭 프라이밍 부위(라이트 퍼플)와 함께 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 형광 프로브 감도 및 특이성을 검증하기 위한 희석 방식. (A) 7개의 바코드 균주로부터 정제된 gDNA는 생략된 바코드화된 gDNA(AX)를 희석시키기 위한 희석제를 생성하기 위해 동일한 양으로 함께 혼합된다(상기 예에서 AX). (b) 앞서 설명한 제조된 희석제를 사용하여 생략된 바코드gDNA(위의 예에서 AX)의 직렬 희석을 수행한다. 다음 튜브로 옮기기 전에 각 튜브의 내용물기를 철저히 혼합하십시오. 그림 4는 BioRender로 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 프라이머 프로브 세트 1 및 2의 민감도 및 특이성을 분석하기 위한 플레이트 레이아웃. 디지털 PCR 실험에는 테스트된 각 바코드에 대한 NtC, 포지티브 컨트롤, 네거티브 컨트롤 및 희석 방식이 포함됩니다. 프라이머 프로브 세트 3 및 4의 유효성을 검증하기 위한 플레이트는 적절한 바코드된 gDNA를 사용하여 동일한 패턴으로 배치된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 희석된 AA 바코드 gDNA의 대표적인 디지털 PCR 결과. AA 바코드를 함유하는 gDNA는 도4에 기재된 바와 같이 다른 모든 바코드gDNA의 배경으로 희석되었다. 채널 1은 AA 바코드(상단 패널)에 대한 FAM 프로브를 나타내고 채널 2는 AO 바코드(하단 패널)에 대한 HEX 프로브를 나타냅니다. 각 프로브의 결과는 선택된 웰(오른쪽 패널)에서 모든 액적의 형광 강도 의 주파수를 나타내는 개별 액적 형광 진폭(왼쪽 패널)과 히스토그램으로 제시된다. 각 조건에 대해, 양성 (높은 형광) 및 부정적인 (낮은 형광) 작은 물방울은 두 개의 별개의 인구를 형성해야합니다. 희석되고 대부분의 물방울이 음수인 AA의 경우 히스토그램(오른쪽 상단 패널)은 단일 인구만 을 묘사하는 것으로 보입니다. 이것은 양수 액적이 음수 액자에 의해 실질적으로 열세이기 때문입니다. 그러나 왼쪽 패널에서 방울 형광 진폭을 조사하여 두 개의 뚜렷한 모집단이 여전히 볼 수 있습니다. 모집단은 임계값 기능을 사용하여 양수 및 음수 방울을 정의하여 분리해야 합니다(분홍색 선으로 시각화). 임계값은 사용된 프로브에 따라 달라지지만 동일한 프로브 조합을 사용하는 모든 웰은 동일한 임계값을 가져야 합니다. AA 바코드 gDNA가 희석됨에 따라 양성(높은 형광) 액적의 감소가 있고 양수 AO 방울의 수는 백그라운드에서 일정하게 유지됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미생물을 정확하게 정량화하는 능력은 미생물학 연구에 가장 중요하며, 초기 혼합 인구에서 독특한 균주를 열거하는 능력은 적합성 및 독성 특성을 평가하기위한 귀중한 도구임이 입증되었습니다. 박테리아. 그러나, 이것을 달성하기 위한 기술은 분자 생물학에 있는 현대 발달과 보조를 맞추지 않았습니다. 이 기술은 S를 포함한 많은 박테리아의 염색체를 용이하게 수정할 수 있다. Typhimurium, 거의 2 년 동안 사용할 수 있다14,아직이 능력은 거의 독특한 DNA 서열분자 태깅 균주에 대 한 활용 되었습니다. 세균 염색체에 삽입된 독특하고 최소한의 파괴력의 DNA 바코드를 기반으로 쉽게 식별할 수 있는 균주를 생성할 수 있는 능력을 활용하여 이러한 분자 식별자를 감지하고 정량화하는 최첨단 기술과 결합하여 ( 즉, 디지털 PCR), 우리는 박테리아의 다양한 인구 내에서 쉽게 개별 균주를 정량화하기 위한 절묘한 감도, 특이성, 정확도 및 정밀도를 제공하는 시스템을 만들었습니다.
위에서 설명한 바와 같이 COI 및 COI를 계산하는 것은 세균 염색체에 대한 적절한 수정을 정확하게 하는 능력에 의존합니다. 모든 수정은 임의의 돌연변이가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱에 의해 검증되어야 합니다. 고충실도 폴리머라제의 사용은 이러한 오류를 최소화하지만, 이러한 돌연변이가 발생하면 이 프로토콜의 또 다른 중요한 측면인 균주를 검출하는 능력을 손상시킬 수 있습니다. 우리는 디지털 PCR이 거의 2 백만의 백그라운드에서 2 개의 gDNA 사본을 검출할 수 있다는 것을 입증했지만,이 범위를 벗어난 균주는 정확한 정량화를 위해 추가 희석이 필요할 수 있습니다. 또한 DNA 바코드 서열은 고품질 프로브 서열의 사용을 용이하게 하도록 설계되어야 합니다. 프로브 서열은 자체 이이머지, 헤어핀 형성 또는 대상을 비효율적으로 결합하는 경향에 대해 분석되어야 합니다. 품질 시퀀스와 프로브를 사용하는 것의 중요성은 최소화할 수 없으며, 각 프로브에서 수행해야 하는 신중한 검증 실험에 의해 입증됩니다. 최적의 DNA 바코드를 생성하기 위한 노력은 최적의 디지털 PCR 정량화 결과를 생성합니다.
신중하게 설계된 분자 태그는 품질 결과를 얻기 위해 중요하지만 결과를 해석하는 것은 이 프로토콜의 또 다른 중요한 측면입니다. CI는입력1,19,20에서두 균주의 비율로 나눈 출력에서 돌연변이 균주와 야생형 균주 사이의 비율로 정의된다. 섹션 9에 제시된 이 전통적인 CI는 혼합 된 감염이 야생 형대 하나의 변형으로 구성 될 때 유용합니다. 그러나, 매체 또는 동물을 접종하기 위해 균주의 큰 풀을 사용하는 경우, 균주는 야생 유형에 대한 경쟁뿐만 아니라, 접종에 존재하는 다른 모든 변형에 대해뿐만 아니라 경쟁한다. 다중 감염 균주를 사용하여 경쟁 실험을 수행 한 이전 연구는 계산7,13에서이것을 고려하지 못했습니다. 혼합 감염의 이 기능을 설명하기 위해 풀화된 감염에 대해 수정된 CI를 계산하는 수식을 도입했습니다. 그것은 모든 균주가 야생 형 변형 것 경쟁의 동일한 수준을 제공 할 가능성이 높습니다. 그러나, 대부분의 세균성 유전자는 독성에 거의 영향을 미치지 때문에, 경쟁 적인 색인 실험에 이용된 긴장의 수가 증가함에 따라, 전반적인 독성이 야생형 긴장을 향해 경향이 있을 가능성이 증가합니다. 이것은 반드시 알려진 독성 결함을 가진 많은 균주의 풀을 사용하여 특정 실험 설계의 경우는 아닐 수 있습니다. 그러나, 이것은 결과에서 덜 풍부한 균주 (덜 적합)가 X 출력에 작은영향을 미치기 때문에 수정 된 방정식에서 설명된다. 특정 실험 설계에 따라 하나 또는 다른 수식이 바람직한 경우가 있을 수 있습니다. 풀린 된 감염을 관련시키는 대부분의 경우에, 그러나, 혼합된 감염에서, 모든 긴장이 야생 형에 대하여 뿐만 아니라 서로 경쟁한다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 결과를 분석할 때, 각 수식뒤에 있는 근거는 긴장 적당의 가장 정확한 해석을 만들기 위하여 잘 이해된다는 것이 중요합니다. 결과를 보고할 때는 데이터를 분석하는 방법을 정확하게 공개하는 것이 똑같이 중요합니다.
프로토콜의 섹션 9는 또한 COI를 사용하여 유전자 상호 작용을 결정하는 데 도움이 되는 수식을 포함한다. 이 분석을 통해, 예측은 2개의 독성 유전자가 독립적으로 또는 함께 작동하는지 결정하기 위하여 만들어질 수 있습니다. COI는 입력1에서두 균주의 비율로 나눈 출력에서 이중 돌연변이균주에 대한 이중 돌연변이균의 비율로 정의된다. 이 포뮬러는 유전자 파괴의 자형질 첨가성을 검출하도록 설계되었습니다. 유전자가 독성을 향상시키기 위해 독립적으로 기능하는 경우, 두 유전자의 중단은 혼자 어느 유전자의 단일 중단에 비해 체력에 큰 감소를 야기한다. 유전자가 독성을 향상시키기 위해 함께 작동하는 경우 (통로에 두 개의 효소를 코딩하는 유전자 등), 어느 유전자의 중단은 두 유전자를 방해하는 것과 같은 독성에 동일한 영향을 가져야한다. 표현형 첨가도를 검출하는 것은 단 하나 유전자에 기인한 감쇠의 수준이 아주 높거나 아주 낮은 경우에 어려울 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 동일한 동물 시스템 내의 균주의 직접 비교는 유전자 사이의 기능적 관계에 대한 보다 신뢰할 수 있는 가변성과 보다 신뢰할 수 있는 계정을 제공하며, 이 계산은 더 큰 혼합 집단 내의 두 균주에서 수행될 수 있다.
결과 해석을 위한 마지막 중요한 측면은 인구 역학의 영향을 고려하는 것입니다. 다중 긴장이 있는 몇몇 혼합한 감염에서는, 단 하나 긴장은 무작위 인구 드리프트 때문에 더 지배적이거나 더 적게 적합으로 나타날 수 있습니다. 이 현상은 병목 현상이 발생할 때 증폭될 수 있습니다. 이는 매우 많은 수의 입력 균주, 접종내의 매우 적은 수의 총 박테리아 또는 둘 다의 조합을 사용하여 발생할 수 있습니다. 혼합 된 감염에서 발생하는 또 다른 방해 측면은 트랜스 보완의 가능성입니다. 이것은 와일드 타입과 같은 맞춤 변형이 인위적으로 덜 맞는 변형의 독성을 향상시킬 때 발생합니다. 이것의 가상예는 S의 적합성을 비교하는 것입니다. 티피무리움 병원성 섬 2(SPI2)-녹아웃 균주 야생형 균주에 공동 감염된다. SPI2를 사용하면 S. 타이피무리움은 대식세포 내에서 식종을 변형시키는 숙주 시토솔내로 이펙터를 분비함으로써 세포내에서 생존한다. 이 시스템의 중단은 S. 세포내 사멸에 취약한 티피무리움. 그러나, 대식세포는 한 번에 2개 이상의 박테리아를 삼킬 수 있기 때문에, SPI2-녹아웃은 야생형 S와 동일한 대식세포에 거주하는 경우 체력이 상당히 증가할 수 있다. 숙주 시토졸내로 이펙터를 분비하는 티피무리움. 임의 의 인구 역학 및 트랜스 보완의 가능성은 모든 경쟁 실험의 한계이다. 트랜스 보완에서 의심되는 경우, 표현형은 적합성을 평가하기 위해 다른 보완 방법을 사용하여 확인해야합니다. 임의 의 인구 역학을 극복하기 위해 복제 실험 수를 늘리면 결과에서 이상값을 식별할 가능성이 높아집니다. 다행히도 위에서 설명한 프로토콜은 실험 조건의 수가 크게 감소하기 때문에 더 많은 수의 동일한 복제 실험을 더 쉽게 가질 수 있게 합니다.
위에서 설명한 CI 기술의 핵심 요소는 미생물의 정확한 정량화가 필요한 거의 모든 유기체및 모든 실험 설계에 적응할 수 있는 능력입니다. 그러나 염색체에 독특한 DNA 서열을 통합하기 위해 유기체의 유전 적 조작이 필요합니다. 기술의 적응성은 종을 유전적으로 가단성으로 요구하고 게놈을 수정하기 위한 대체 프로토콜의 생성에 의존할 것이다(단계 1 및 2). 표 2와 S1에 나열된 DNA 바코드는 대부분의 박테리아에 충분해야 합니다. 그러나, 모든 정량적 PCR 실험에서와 같이, 간단한 BLAST 분석에 의하여 프라이머 와 프로브의 오프 타겟 결합을 위한 최소한의 잠재력을 보장하기 위하여 세균 게놈을 분석하는 것이 관련있습니다. 본 연구에서 사용된 DNA 바코드 서열은 경우에 따라 3-4염에 의해서만 다르며, 비특이적 결합 가능성을 최소화하는 프로브의 절묘한 특이성을 강조합니다. 형광 프로브의 특이성에 관계없이 모든 새로운 바코드 시퀀스는 6단계에서 설명한 대로 감도 및 특이성을 위해 적절하게 검증되어야 합니다. 바코드 균주를 생성한 후, 전술한 바와 같이 시험관내 경쟁 분석법 외에 많은 유형의 실험에 이 프로토콜을 적용할 수 있다. 상기 균주는 마우스 또는 다른 동물 모델 시스템에서 생체 내 경쟁 실험에 적합하다. 동물 기관 및 조직에서 gDNA를 추출하기 위해서는 최소한의 수정만 필요하며 이러한 변형은 그러한 목적을 위해 키트 제조업체에서 잘 설명합니다. 또한, 생체 내 경쟁을위한 혼합 감염의 큰 풀은성공적으로 이러한 실험의 비용을 감소뿐만 아니라 하나의 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수있는 잠재력을 제공, 이전에 활용7 뿐만 아니라 동물 대 동물 의 가변성에 대한 잠재력을 감소시다. 유사하게, 바코드된 긴장은 각종 처리 조건에 긴장의 감수성을 검토하는 그밖 시험관 내 분석법에서 사용될 수 있었습니다 (예를 들면 항생제, 산 감수성, 반응성 산소 또는 질소 종에 의하여 살해, 등등). 이러한 실험에 대해, 성장 억제를 평가하는 것은 3.4단계에서 성장 배지에 원하는 화학물질을 첨가하고 설명된 대로 진행함으로써 달성될 수 있었다. 세균성 죽음을 평가하기 위하여는, 긴장의 큰 풀은 혼합될 수 있고, 입력은 전술한 것과 같이 정량화될 수 있었다. 원하는 치료에 노출 된 후, 라이브 세포는 생존 PCR과 디지털 PCR 정량화 절차를 결합하여 선택적으로 정량화 할 수 있었다21,22,23 , 24세 , 25개 , 26. 이러한 실험에 대한 처리량은 각 균주에 대한 희석 및 복제 판이 보다 간소화 된 분자 기술로 대체되기 때문에 극적으로 증가 할 것입니다. 마지막으로, 진화 생물학 및 인구 유전학을 분석하는 것은 이 논문의 범위를 벗어났지만, 바코드된 유기체는 그러한 연구에 매우 적응력이 있습니다. 궁극적으로, 이 프로토콜의 목적은 많은 다양한 종과 많은 종류의 실험에서 사용하기에 매우 적합한 박테리아를 정량화하기위한 강력한 기술을 개발하는 것이었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구는 조지 F. Haddix 대통령의 교수 연구 기금과 국립 보건원의 일반 의학 연구소에 의해 지원 되었다 (NIH) 수상 번호 GM103427. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
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