Summary
هذا النهج القائم على الجزيئية لتحديد اللياقة البدنية البكتيرية يسهل الكشف الدقيق والدقيق للكائنات الحية الدقيقة باستخدام الباركود الحمض النووي الجينومي فريدة من نوعها التي يتم قياسها كميا عن طريق PCR الرقمية. يصف البروتوكول حساب المؤشر التنافسي لسلالات السالمونيلا; ومع ذلك، فإن التكنولوجيا قابلة للتكيف بسهولة مع البروتوكولات التي تتطلب التحديد الكمي المطلق لأي كائن حي قابل للتطيل وراثياً.
Abstract
مؤشر تنافسي هو وسيلة شائعة تستخدم لتقييم اللياقة البدنية البكتيرية و / أو ضراوة. وتتجلى فائدة هذا النهج في سهولة أدائه وقدرته على توحيد اللياقة البدنية للعديد من السلالات لكائن حي من النوع البري. غير أن هذه التقنية محدودة بعلامات الفينوتيبيك المتاحة وعدد السلالات التي يمكن تقييمها في وقت واحد، مما يخلق الحاجة إلى عدد كبير من التجارب المكررة. بالتزامن مع أعداد كبيرة من التجارب، فإن تكاليف العمالة والمواد لتحديد كمية البكتيريا على أساس علامات الفينوتيبيك ليست ضئيلة. للتغلب على هذه الجوانب السلبية مع الاحتفاظ بالجوانب الإيجابية، قمنا بتطوير نهج قائم على الجزيئية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة بشكل مباشر بعد هندسة العلامات الوراثية على الكروموسومات البكتيرية. فريدة من نوعها، تم إدراج 25 الباركود الحمض النووي زوج قاعدة في موضع حميدة على كروموسوم من نوع البرية وسلالات متحولة من السالمونيلا. وأجريت تجارب المنافسة في المختبر باستخدام الأولوكولا التي تتكون من سلالات مجمعة. وفي أعقاب المنافسة، تم تحديد الأرقام المطلقة لكل سلالة كمياً باستخدام الـ PCR الرقمي، وتم حساب المؤشرات التنافسية لكل سلالة من تلك القيم. تشير بياناتنا إلى أن هذا النهج لتحديد كمية السالمونيلا حساس للغاية، ودقيق، ودقيق للكشف عن كل من الكائنات الحية الدقيقة الوفيرة للغاية (اللياقة البدنية العالية) والنادرة (منخفضة اللياقة البدنية). بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة مع أي كائن حي تقريبا مع كروموسومات قادرة على التعديل، وكذلك لمختلف التصاميم التجريبية التي تتطلب التحديد الكمي المطلق للكائنات الحية الدقيقة.
Introduction
تقييم اللياقة البدنية وضراوة الكائنات المسببة للأمراض هو جانب أساسي من أبحاث علم الأحياء الدقيقة. وهو يمكّن من إجراء مقارنات بين السلالات أو بين الكائنات الحية المتحولة، مما يسمح للباحثين بتحديد أهمية بعض الجينات في ظل ظروف محددة. تقليديا، يستخدم تقييم virulence نموذج حيواني للعدوى باستخدام سلالات بكتيرية مختلفة ومراقبة نتائج الحيوان المصاب (على سبيل المثال الجرعة المعدية50، الجرعة المميتة50، وقت الوفاة ، شدة الأعراض ، عدم وجود الأعراض، وما إلى ذلك). ويقدم هذا الإجراء وصفا قيما للضراوة، ولكنه يتطلب سلالات لإحداث اختلافات كبيرة في النتائج من أجل الكشف عن الاختلافات من النوع البري. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج شبه كمية لأنه في حين يمكن قياس تطور المرض وشدة الأعراض كمياً ذاتياً مع مرور الوقت، فإن تفسير الشراسة مقارنة بالنوع البري هو أكثر نوعية (أي أكثر أو أقل أو بنفس القدر من القسوة). بديل شائع لإجراء اختبار العدوى الحيوانية هو توليد مؤشرات تنافسية (CIs)، وهي قيم تقارن مباشرة اللياقة البدنية أو ضراوة الإجهاد مع نظير من النوع البري في عدوى مختلطة1. ولهذه التقنية مزايا عديدة على النموذج الحيواني التقليدي للعدوى عن طريق توحيد التضوئ إلى سلالة من النوع البري وتحديد قيمة قابلة للقياس الكمي لتعكس درجة التوهين. ويمكن أيضا تكييف هذه التقنية لتحليل التفاعلات الجينية في البكتيريا عن طريق تحديد مؤشر تنافسي ملغى (COI)2. يسمح حساب COI لمجموعة من الكائنات الحية المتحولة للباحثين بتحديد ما إذا كان اثنان من الجينات يساهمان بشكل مستقل في مسببات الأمراض أو ما إذا كانا يشاركان في نفس مسار الشراسة ويعتمدان على بعضهما البعض. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب حساب CI تعداد البكتيريا التي يمكن أن توفر رؤى قيمة في مسببات الأمراض من الكائنات الحية. كما تسمح CIs وCOIs للباحثين لتقييم سلالات avirulent التي لا تسبب المرض السريري ولكن لا تزال لديها اختلافات في اللياقة البدنية. وهذه التقنية محدودة باستخدام علامات مقاومة المضادات الحيوية التقليدية لتحديد السلالات، وبالتالي الحد من عدد سلالات المدخلات إلى واحد أو اثنين فقط في كل مرة. وبسبب هذا القيد، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من المجموعات التجريبية والتكرارات، التي بالإضافة إلى زيادة تكاليف العمالة والمواد، تزيد أيضا من فرص التباين في الظروف التجريبية والنتائج غير الدقيقة. (للاطلاع على مراجعة شاملة لفوائد وتطبيقات استخدام العدوى المختلطة لدراسة التفاعلات بين الشخصيات واللياقة البدنية والجينات، انظر C.R. Beuzón وD.W. Holden 1)
وقد بذلت محاولات للتغلب على هذا القيد، مثل استخدام الخلايا ذات العلامات الفلورية كميا عن طريق قياس التدفق إلى الخلايا3و4و5. هذه التقنية كميا الخلايا باستخدام إما 1) وصفت الأجسام المضادة لعلامات phenotypic أو 2) أنتجت الذاتية البروتينات الفلورية. استخدام الأجسام المضادة المسماة لديه حد للكشف عن 1000 خلية / مل، وبالتالي يتطلب عدد كبير من الخلايا لتحليل3. الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية لديها علم وظائف الأعضاء المتغيرة وعرضة لتغيرات اللياقة البدنية الناجمة عن التعبير البروتين العالي6. كلا الأسلوبين محدودة بعدد علامات الفلورسنت التي يمكن اكتشافها باستخدام قياس التدفق. وقد تحقق تقدم في القياس الكمي الجزيئي من خلال تطوير تقنية الميكرور التي اكتشفت التوهين في 120 سلالات من عدوى مختلطة أولية من أكثر من 1000 سلالات في نموذج مورين7. وقد استخدمت هذه التقنية تحليلاً للRNA من سلالات متحولة، مما يؤدي إلى تباين كبير في النتيجة. ومع ذلك، فقد أثبتت أن مجموعات كبيرة من الإصابات المختلطة يمكن أن تكون أداة مفيدة وأنه باستخدام تقنيات الكشف الحساسة، يمكن تحديد الاختلافات في ضراوة البكتيريا. مع تطور تسلسل الجيل القادم، وسعت Tn-seq فائدة الطفرات transposon، مما يتيح طريقة قوية لتحديد كمية البكتيريا التي تم تغييرها عشوائيا8،9،10، 11. تم مؤخرا وضع بروتوكول بديل يلغي الحاجة إلى transposons وبدلا من ذلك يستخدم الباركود الحمض النووي لتحديد وتتبع التغيرات الجينية ومسارها بسهولة أكبر وتأثيرها على اللياقة البدنية12. هذه التكنولوجيا هي تقدم كبير، ولكن إدراج الباركود الجينوم لا يزال عملية عشوائية. للتغلب على العشوائية من التجارب السابقة، يون وآخرون وضعت طريقة لحساب CIs من سلالات السالمونيلا باستخدام الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها إدراجها في مواقع دقيقة على كروموسومات البكتيريا13. تم الكشف عن سلالات الباركود فريدة من نوعها باستخدام طريقة المستندة إلى qPCR مع الأخضر SYBR والتمهيديات محددة لكل الباركود فريدة من نوعها. وكانت هذه التقنية محدودة بسبب القيود التي تفرضها شركة qPCR، بما في ذلك الاختلافات في كفاءة التمهيدي والحساسية المنخفضة، مما يدل على الحاجة إلى PCR المتداخلة قبل qPCR. ومع ذلك، أظهر هذا النهج أنه يمكن استغلال التعديلات الجينية المستهدفة للكشف عن برك السلالات البكتيرية المتعددة وإمكانية تحديدها كمياً.
في البروتوكول التالي، نقوم بوصف منهجية جديدة لإجراء تجارب المنافسة البكتيرية مع مجموعات كبيرة من الأولوكولا المختلطة تليها كمية دقيقة باستخدام تقنية PCR رقمية حساسة للغاية. ويشمل البروتوكول سلالات بكتيرية تحمل علامات وراثية مع شريط يُدرج على شريط يُدخل من نوع DNA الباركود الفريد على منطقة غير مؤذية من الكروموسوم. يسمح هذا التعديل للسلالات أن تكون كمية بسرعة ودقة باستخدام التكنولوجيا الجزيئية الحديثة بدلاً من التخفيفات التسلسلية التقليدية، والطلاء النسخة المتماثلة، وحساب وحدات تشكيل المستعمرة التي تعتمد على علامات phenotypic (أي مقاومة المضادات الحيوية ). وتسمح التعديلات بإجراء تقييم متزامن للعديد من السلالات في تلقيح واحد مجمع، مما يقلل إلى حد كبير من إمكانية التغير التجريبي لأن جميع السلالات تتعرض لنفس الظروف بالضبط. وعلاوة على ذلك، في حين تم تطوير هذه التقنية في السالمونيلا enterica سيروفار Typhimurium، فإنه قابل للتكيف للغاية مع أي كائن حي طيع وراثيا وتقريبا أي تصميم تجريبي حيث يلزم عدد البكتيريا دقيقة، وتوفير جديد أداة لزيادة الدقة والإنتاجية في مختبرات علم الأحياء الدقيقة دون القيود التي تفرضها الأساليب السابقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إدراج الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها على بلازميد تحتوي على المكونات اللازمة لتبادل Allelic
ملاحظة: تم إنشاء بلازميد جديد، يدعى pSKAP، مع عدد نسخة عالية وزيادة كفاءة التحول مقارنة مع pKD13 بلازميد تبادل allelic القائمة. ويرد وصف ذلك في الخطوات 1-1-1-12 (الشكل1). البلازميدات النهائية التي تحتوي على الباركود الحمض النووي فريدة مننوعها والمكونات لتبادل allelic متوفرة من خلال مستودع بلازميد (جدول المواد).
- باستخدام مجموعة miniprep بلازميد التجارية، تنقية pKD1314 و pPCR كاميرا النصي SK+ من الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاها نمت في لوريا-بيرتاني (LB) مرق تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين أو 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (لpKD13 و pPCR النصي كام SK+، علىالتوالي) (الجدول 1).
- إجراء عمليات الهضم المقيدة على كل من البلازميدات باستخدام إنزيمات التقييد التجاري HindIII وBamHI وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- إزالة الانزيمات المقيدة والحمض النووي المقتطع من PPCR النصي كام SK+ رد فعل وتنقية 3370 قاعدة الزوج (BP) العمود الفقري بلازميد باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي المتاحة تجاريا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- فصل شظايا من pKD13 تقييد الهضم على هلام أجاروز 1٪ باستخدام غرفة الكهربائي.
- تصور العصابات باستخدام مضيء الضوء الأزرق ومكوس 1333 نقطة أساس جزء من هلام (الشكل1C).
ملاحظة: تحتوي هذه القطعة على جين مقاومة الكاناميسين المحاط بـ FRT والمطلوب لاستبدال الأليليك الكروموسومي. - تنقية الحمض النووي المقتطعة من الخطوة 1.5 باستخدام مجموعة استخراج هلام التجارية.
- لإنشاء pSKAP، ligate الجزء النقي من pKD13 (من الخطوة 1.6) إلى pPCR النصي كام SK+ (من الخطوة 1.3) باستخدام ligase الحمض النووي T4 التجارية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- تحويل خلايا DH5α المختصة كيميائيًا مع بلازميد pSKAPالمربط بعد بروتوكول الشركة المصنعة (الجدول 1).
- انتشار التحولات على لوحات أجار LB تكملها 50 ميكروغرام / مل كانامايسين وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- اختيار مستعمرة من لوحة وخط على لوحة أجار LB جديدة تكملها 50 ميكروغرام / مل كانامايسين وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اختيار مستعمرة من هذه اللوحة واستخداملتلقيح مرق LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كانامايسين. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر.
- استخدام مجموعة مصغرة بلازميد التجارية لتنقية pSKAP من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها.
- إجراء عملية هضم تقييد تشخيصي للبلازميد من الخطوة 1.11 باستخدام هند الثالث وبام هاي وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. تصور شظايا على هلام أجاروز 1٪ كما هو الحال في الخطوات 1.4-1.5.
ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي pSKAP 4,703 bp. يجب أن تكون الأجزاء بعد الخطوة 1.12 3,370 و 1,333 bp. - تصميم التمهيديات PCR للإدراج الموقع الموجهة الطفرات (SDM) (الجدول2 و S1)بطريقة لإدراج فريدة من نوعها 25-basepair تسلسل الحمض النووي في موقف 725 من pSKAP (الشكل2).
ملاحظة: يتم إدراج الحمض النووي الباركود في بلازميد خارج الجين المقاومة كاناميسين FRT يحيط، لذلك لا يتم فقدان الباركود أثناء إزالة اللاحقة من كاسيت المقاومة كاناميسين. إذا كان توليد تسلسل الباركود جديدة، واستخدام الأدوات على الانترنت لضمان أن تحقيقات PCR محددة الهدف المسمى الفلورسنت (يشار إليها فيما يلي ببساطة باسم "تحقيقات") سوف ربط بكفاءة إلى تسلسل جديد. وترد في الجدولين 2 و S1تسلسلات الإدراج المصممة حتى الآن، إلى جانب المواد التمهيدية اللازمة لإنشائها. - إعداد ردود الفعل SDM باستخدام بوليميراز الحمض النووي التجارية عاليةالدقة، أزواج التمهيدي المطلوب (الجدول 2)، وpSKAP قالب. تعيين دراجة حرارية لأداء ما يلي: 1) 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 2) 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 56 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 3) كرر الخطوات 2، 24 مرات، 4) 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 5) عقد في 4 درجة مئوية.
- بعد الانتهاء من PCR، واستنزاف قالب pSKAP عن طريق إضافة إنزيم تقييد Dpn I إلى رد الفعل. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: وينبغي تصور المنتجات من PCR على هلام أغاروز للتحقق من حجم ونقاء المنتج. عنصر تحكم Dpn I الهضم تتكون من قالب pSKAP غير المعدلة يمكن تنفيذها واستخدامها في الخطوات اللاحقة لضمان يتم هضم الحمض النووي قالب تماما. - استخدام 5 μL من المنتج من الخطوة 1.15 لتحويل 100 درجة مئوية من الخلايا DH5α المختصة كيميائيا التجارية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
- انتشار التحولات على لوحات أجار LB تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- اختر مستعمرة (أو مستعمرات) من لوحات بين عشية وضحاها وخط على لوحات أجار LB الفردية مع 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول وحضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. حدد مستعمرة من لوحات بين عشية وضحاها واستخدام لتلقيح 5 مل من مرق LB تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول. ثقافة الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر.
- استخدام مجموعة miniprep بلازميد التجارية لتنقية بلازميدات من ثقافة بين عشية وضحاها.)
- سنجر تسلسل البلازميدات النقية باستخدام M13 إلى الأمام تسلسل التمهيدي (الجدول2). قارن المنطقة المتحولة ببلازميد الأصلي وتقييم دقة الإدراج SDM.
- بعد التأكد من إدراج الباركود والدقة، تعيين كل الباركود وplasmid اسم.
ملاحظة: وقد تم تعيين الباركود التي تم إنشاؤها حتى الآن تسمية من حرفين: AA، AB، AC، ...، BA، BB، BC، الخ. يشار إلى بلازميدات الباركود كما pSKAP_AA، pSKAP_AB، pSKAP_AC، ...، pSKAP_BA، pSKAP_BB، pSKAP_BC، الخ. - كرر الخطوات 1.14-1.21 لإنشاء العدد المطلوب من الباركود الحمض النووي.
2. إدخال الباركود الحمض النووي على كروموسوم S. التيفيمواليوم
ملاحظة: إدخال الباركود الحمض النووي على S. يتم تحقيق كروموسوم التيفيميوريوم باستخدام طريقة تبادل الاليليك التي وصفها Datsenko وWanner14 التي تم تعديلها للاستخدام في S. (تيفييوم)
- تحديد موضع على S. جينوم التيفيميوم الذي لإدراج الباركود الحمض النووي (الشكل3).
ملاحظة: حدد منطقة كبيرة مشتركة بين الكروموسوم. تجنب المناطق التي تنتج RNA غير الترميز. واستخدمت هذه الدراسة موضعاً في أسفل المجرى للوضع P بين المخلفات 840 213 1 و861 213 1 (تم تحديدها من تجميع الجينوم GCA_000022165.1). وقد تم التلاعب في هذه المنطقة سابقا وراثيا لفي استكمال عبر الجينات15. بدلا من ذلك، يمكن إدخال الباركود الحمض النووي في حين تعطيل في الوقت نفسه جين من الفائدة. ويتطلب القيام بذلك إجراء تعديلات طفيفة على هذا البروتوكول وتبسيط خلق المتحولين. - تصميم التمهيديات PCR لتضخيم الباركود فريدة من نوعها وFRT--الجناحين كاناماسين الجينات المقاومة من pSKAP المطلوب الباركود التي تحتوي على بلازميد من الخطوة 1.21 (الجدول2). إضافة 40 ملحقات النيوكليوتيد التي هي متجانسة إلى المنطقة المحددة في الخطوة 2.1 إلى نهاية 5 'من كل التمهيدي (الجدول2).
- قم بإجراء التضخيم باستخدام بوليميراز تجاري عالي الدقة، والتمهيديات من الخطوة 2.2، والبلازميد الذي يحتوي على الرمز الشريطي pSKAP المطلوب كقالب. تعيين دراجة حرارية لأداء ما يلي: 1) 98 درجة مئوية لمدة 30 ق، 2) 98 درجة مئوية ل10 ق، 3) 56 درجة مئوية لمدة 15 ق، 4) 72 درجة مئوية لمدة 60 ق، كرر الخطوات 2-4 29 مرات، 5) 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 6) عقد في 4 درجة مئوية.
- بعد الانتهاء من PCR، استنفاد الحمض النووي قالب باستخدام DpnI كما هو موضح في الخطوة 1.15. تنقية وتركيز الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي التجارية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
- الرجوع إلى البروتوكول المنشور سابقا لتوليد المسوخ في S. سلالة Typhimurium 14028s من منتجات PCR14،16،17،18.
ملاحظة: ليس من الضروري أن يتم استئصال جين مقاومة كانامايسين من الكروموسوم. ومع ذلك، فإن استئصال الجين يسبب الحد الأدنى من التعطيل للكروموسوم البكتيري لأنه ينتج عنه ندبة 129 نقطة أساس من شأنها أن تترك الجينات المحتملة في المصب في الإطار. من المستحسن أن يتم الاحتفاظ سلالة تحتوي على جين المقاومة كانامايسين كما يمكن استخدامها لنقل الباركود بين سلالات عن طريق transduction P22 بوساطة. - كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 لإنشاء السلالات المطلوبة مع الرموز الشريطية المناسبة.
ملاحظة: الباركود يمكن إدخالها في البرية من نوع S. يمكن إدخال التبذير الذي يمكن أن يخضع بعد ذلك لمزيد من التلاعب الوراثي، أو الباركود في سلالات التي تم تغييرها وراثيا في السابق.
3. ظروف النمو البكتيري واختبارات المنافسة في المختبر
- من مخزون البكتيريا، خط المطلوب S. سلالات Typhimurium أن كل ميناء الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها على لوحات أجار LB. لوحات الحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- حدد مستعمرة واحدة من كل سلالة وتلقيح 5 مل من مرق LB. حضانة لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر.
ملاحظة: باستخدام ثقافة بين عشية وضحاها، انتقل إلى الخطوة 3.5 لجمع الحمض النووي الجيني النقي (gDNA) من كل سلالة الباركود. وهذا ضروري لتجارب التحقق والمراقبة اللاحقة في الفرع 6. - لكل عملية منافسة، نقل حجم متساو من كل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب معقم الحجم بشكل مناسب. مزيج تماما سلالات معا عن طريق دوامة بقوة لمدة 5 s على الأقل.
ملاحظة: وينبغي أن يكون حجم كل ثقافة بين عشية وضحاها لنقل كافية لكل حالة وتكرار، وكذلك لعزل gDNA لتحديد المدخلات. في حين أنه ليس من الضروري تماما لقياس الكثافات البصرية للثقافات لأن العدد المطلق من الكائنات الحية الدقيقة المدخلات سيتم قياسها كميا باستخدام PCR الرقمية، يجب أن يكون عدد البكتيريا المدخلات لكل سلالة متساوية تقريبا لتجنب الاختناقات أو المنافسة غير المتكافئة في وقت مبكر من التجربة. وقارنت الاختبارات التمثيلية للمنافسة في هذا البروتوكول معدلات النمو التي تبلغ 8 سلالات في وقت واحد. قد تكون هناك سلالات إضافية أو أقل ضرورية للتصاميم التجريبية الفردية. - نقل 100 ميكرولتر من التلقيح المختلط إلى 4.9 مل مرق LB معقمة. حضانة في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب أو إلى الكثافة البصرية المطلوبة.
- حصاد 500 ميكرولتر من التلقيح عن طريق الطرد المركزي في > 12,000 × ز لمدة دقيقة واحدة. انتقل فورا إلى القسم 4 مع الخلايا.
- عند نقطة الوقت المطلوبة، قم بإزالة 500 ميكرولتر من خلايا الثقافة والحصاد عن طريق الطرد المركزي عند > 12,000 × ز لمدة دقيقة واحدة.
ملاحظة: إذا كان جمع aliquots في نقاط زمنية متعددة، تجميد الكريات في -20 درجة مئوية أو المضي قدما على الفور إلى الخطوة 4.1 بعد كل مجموعة.
4. جمع وقياس gDNA من S. التيفيمويوم (من الخطوتين 3.5 و 3.6)
- حصاد gDNA من الخلايا باستخدام مجموعة تنقية gDNA التجارية. إذا كان متوفراً، قم بتنفيذ خطوة استنفاد RNA الاختيارية.
ملاحظة: ليس من الضروري استنفاد الحمض النووي الريبي؛ ومع ذلك، فإن وجود الحمض النووي الريبي زيادة مصطنعة تركيز الحمض النووي، مما يؤدي إلى حسابات شاذة في الخطوات اللاحقة. في حالة استخدام مجموعة تنقية gDNA التجارية، اتبع توصيات الشركة المصنعة للتأكد من أن العمود غير محمل بالحمض النووي. ولا يشترط الحد الأدنى لتركيز الحمض النووي إذا كانت العينة قابلة للقياس الكمي في الخطوات اللاحقة. - استخدام مقياس الطيف الضوئي لتحديد الحمض النووي في كل عينة.
ملاحظة: يمكن تحديد الحمض النووي كمياً باستخدام أي طريقة موثوق بها. - حساب عدد نسخ gDNA استناداً إلى حجم الجينوم البكتيري باستخدام المعادلة التالية حيث: X هو كمية الحمض النووي في نغ وN هو طول جزيء الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (حجم الجينوم).
ملاحظة: يستخدم 660 غرام/مول كمتوسط كتلة 1 ضغط الدم. تتوفر العديد من الآلات الحاسبة عبر الإنترنت لإجراء الحساب.
5. تصميم التمهيديات وتحقيقات للكشف الكمي من الباركود الحمض النووي عن طريق PCR dDigital
- تصميم التمهيديات لتضخيم المنطقة الباركود من S. كروموسوم التيفيمواليوم المصب من putP (الشكل3C والجدول 2).
ملاحظة: التمهيدي وتصاميم التحقيق يمكن تسهيلها منقبل العديد من البرامج على الانترنت (جدول المواد). إذا تم إدراج جميع الباركود في نفس المكان، مجموعة واحدة من التمهيديات تضخيم هو عالمي لجميع الباركود. - تصميم 6-carboxyfluoressin (FAM) القائم على و / أو سداسي كلور فلورسين (HEX) القائم على تحقيقات محددة لكل الباركود (الجدول2 و S1).
ملاحظة: قارئ قطرات المستخدمة في هذه التجربة قادرة على الكشف عن كل من FAM- وHEX القائم على تحقيقات في وقت واحد في رد فعل متعددة. تصميم 1/2 من تحقيقات للاستفادة من FAM و 1/2 للاستفادة من HEX. وهذه ليست خطوة ضرورية ولكنها ستقلل من استخدام الكاشف والتكاليف التجريبية إذا ما نُفذت. - جعل 20X التمهيدي التحقيق يمزج الرئيسية التي تحتوي على 1) 20 mM من كل التمهيدي إلى الأمام وعكس تضخيم، 2) 10 mM من تحقيق FAM واحد، و 3) 10 MM من مسبار HEX واحد (إذا تعدد الإرسال).
6. التحقق من حساسية وخصوصية كل Pprimer-التحقيق مجموعة لكل الباركود الجينوم باستخدام PCR الرقمية
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول التحقق من صحة ثمانية الباركود فريدة من نوعها مع ثمانية تحقيقات فريدة من نوعها كمثال. ويمكن زيادة أو نقصان عدد الرموز الشريطية المستخدمة لاستيعاب مختلف التصاميم التجريبية.
- إنشاء تجمع من gDNA الذي يحتوي على كل الباركود باستثناء واحد. استخدام هذا التجمع كمحد لتنفيذ سلسلة تخفيف مع gDNA تحتوي على الباركود واحد المتبقية (يتم توفير مخطط تخفيف عينة في الشكل 4).
ملاحظة: استخدام gDNA المجمعة كمنحنة يضمن خلفية متسقة مع التأكد من الحساسية. باستخدام أرقام النسخ المحددة في الخطوة 4.3، تمييع gDNA إلى رقم نسخة ضمن نطاق PCR الرقمي الموصى به (1-100,000 نسخة لكل رد فعل 20 ميكرولتر). نضع في اعتبارنا أن يتم تعيين نطاق لكل هدف فريد من نوعه (الباركود)، وليس مجموع gDNA. - إعداد ردود الفعل لPCR الرقمية في مكررة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لاستخدام supermix PCR الرقمية المصممة للكيمياء المستندة إلى التحقيق. استخدم المخاليط من الخطوة 6.1 كقالب DNA. استخدام 20X التمهيدي التحقيق الرئيسي مزيج من الخطوة 5.3 الذي يحتوي على التحقيق لالباركود المخفف في الخطوة 6.1.
- إعداد تكرار ردود الفعل التحكم لPCR الرقمية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لاستخدام supermix PCR الرقمية المصممة للكيمياء المستندة إلى التحقيق. يجب أن تتكون ردود فعل التحكم لكل مزيج مسبار من 1) لا عناصر تحكم قالب (NTCs) و 2) عناصر تحكم سلبية و 3) عناصر تحكم إيجابية.
ملاحظة: الحد الأدنى لعدد ردود فعل التحكم المتماثل هو اثنين. يستخدم هذا البروتوكول المثال أربعة NTCs وستة عناصر تحكم سالبة وستة عناصر تحكم إيجابية لكل الباركود. يجب أن تحتوي الضوابط السلبية gDNA مع كل الباركود باستثناء الباركود المقابلة للمسبار يجري اختبارها. وهذا سوف التحقق من صحة خصوصية كل تحقيق. - كرر الخطوات 6.1-6.3 لإنشاء ردود فعل PCR رقمية لكل عينة gDNA الباركود. وترد في الشكل 5ترتيب لوحة عينة.
ملاحظة: ويرد وصف لهذه الخطوات والخطوات اللاحقة استناداً إلى منصة PCR رقمية محددة تستخدم قطرات وتكنولوجيا قائمة على التدفق. ويمكن بسهولة الاستعاضة عن منصات PCR الرقمية البديلة التي تستخدم التكنولوجيا القائمة على الرقاقة بتعديلات طفيفة على هذا البروتوكول. الخطوة 6.4 قد تتطلب أكثر من لوحة واحدة 96 جيدا للتحقق من صحة جميع مجموعات التمهيدي. وعلى النقيض من qPCR، يمكن مقارنة لوحات منفصلة تم تحليلها بواسطة PCR الرقمية بسهولة دون الحاجة إلى آبار مرجعية موحدة بين اللوحات. - توليد قطرات لكل حالة رد فعل باستخدام مولد قطرات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- نقل قطرات تم إنشاؤها حديثا في لوحة 96 جيدا المناسبة. استخدم 200 ميكرولتر من الماصة على ماصة متعددة القنوات بدرجة 5-50 ميكرولتر.
ملاحظة: عند قطرات الأنابيب، ماصة ببطء وسلاسة! توصي الشركة المصنعة لمعدات PCR الرقمية باستخدام الماصات ونصائح الماصات فقط من شركة مصنعة معينة (على سبيل المثال، Ranin). هذه النصائح ماصة لها فتحة على نحو سلس مع عدم وجود شظايا بلاستيكية مجهرية التي يمكن أن تدمر قطرات أو تلف microfluidics من قارئ قطرات. تم فحص العديد من العلامات التجارية من النصائح ولاحظ أن لديها مجموعة متنوعة من نوعية التصنيع. وقد تحققت نتائج مكافئة باستخدام بدائل طرف الماصات؛ ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند الانحراف عن توصيات الشركة المصنعة. - بعد أن تم إنشاء جميع قطرات ونقلها، ختم لوحة مع السدادة لوحة احباط.
- استخدام الدراجات الحرارية الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لأداء ظروف ركوب الدراجات التالية: 1) 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 2) 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ومعدل منحدر تعيين في 1 درجة مئوية / ث؛ 3) 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ومعدل منحدر تعيين في 1 درجة مئوية / ث؛ 4) كرر الخطوتين 2 و 3 49 مرات؛ 5) 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 6) عقد في 4 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة.
ملاحظة: النقل الحراري في رد فعل قطرات ليست هي نفسها PCR القياسية. قد تتطلب ظروف رد الفعل التعديل. - أثناء إجراء التدوير الحراري، برنامج برنامج تحليل البيانات مع معلومات إعداد اللوحة مثل اسم العينة، نوع التجربة (القياس الكمي المطلق)، supermix المستخدمة، اسم الهدف 1 (اسم الرمز الشريطي FAM)، نوع الهدف 1 (NTC، التحكم الإيجابي، التحكم السلبي، أو غير معروف)، اسم الهدف 2 (اسم الرمز الشريطي HEX)، نوع الهدف 2 (فارغ، التحكم الإيجابي، التحكم السلبي، أو غير معروف). يتم عرض معلومات إعداد اللوحة النهائية في الشكل 5.
- بعد اكتمال التدوير الحراري، نقل ردود الفعل المكتملة إلى قارئ قطرات وبدء عملية القراءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
7. تحديد عدد البكتيريا في تجربة مؤشر تنافسي
- تخفيف gDNA معزولة وكمية من القسم 4 إلى تركيز مناسب على النحو المبين أعلاه.
- إعداد ردود الفعل لPCR الرقمية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة لاستخدام supermix المناسبة. استخدم DNA من الخطوة 7.1 كقالب. استخدام واحد 20X التمهيدي التحقيق الرئيسي المزيج الذي يحتوي على التحقيق (أو تحقيقات إذا الكشف عن كل من FAM وHEX) لالباركود المحتملة الموجودة في التجربة.
- إعداد ردود فعل PCR الرقمية إضافية كما هو الحال في الخطوة 7.2 باستخدام مختلف 20X التمهيدي التحقيق الرئيسي يمزج حتى يمكن الكشف عن جميع الباركود المستخدمة في التصميم التجريبي.
- تضمين عناصر التحكم لكل شرط كما هو موضح في 6.3. يتضمن هذا 1) لا عناصر تحكم قالب (NTCs) عناصر تحكم سالبة و 3) عناصر التحكم الموجبة.
- متابعة البروتوكول كما هو موضح في الخطوات 6.5 إلى 6.10.
8. تحليل البيانات PCR الرقمية وحساب أرقام النسخ المطلق
- عند قراءة كافة الآبار واكتمال التشغيل، افتح ملف بيانات .qlp باستخدام برنامج تحليل البيانات.
ملاحظة: أنواع الملفات وإجراءات تحليل البيانات الموضحة هنا خاصة بإحدى الشركات المصنعة الرقمية PCR. إذا كان استخدام منصات PCR الرقمية البديلة، فإن أنواع الملفات وإجراءات تحليل البيانات ستكون خاصة بالمنصة المستخدمة وينبغي تنفيذها وفقًا للمواصفات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. - حدد جميع الآبار التي تستخدم نفس المزيج الرئيسي التمهيدي التحقيق.
- في علامة التبويب قطرات، فحص عدد قطرات تحليلها في كل بئر (قطرات إيجابية وسلبية على حد سواء). استبعاد من التحليل أي بئر لديها أقل من 10،000 قطرات مجموع.
- الانتقال إلى علامة التبويب سعة 1D ودراسة السعة من قطرات إيجابية وسلبية. ضمان أن تكون تتألف من اثنين من السكان متميزة.
- داخل البرنامج، استخدم ميزة العتبات لجعل قطع بين قطرات إيجابية وسلبية لكلمسبار تم استخدامه (الشكل 6).
ملاحظة: جميع الآبار التي تستخدم نفس التمهيدي التحقيق الرئيسي مزيج من الخطوة 5.3 يجب أن يكون نفس العتبات. - وبمجرد تطبيق العتبات المناسبة على جميع الآبار، سيقوم البرنامج بحساب عدد نسخ الحمض النووي في كل رد فعل. تصدير البيانات إلى جدول بيانات لتسهيل المزيد من التحليل.
ملاحظة: يستخدم برنامج تحليل البيانات عدد القطرات الإيجابية والسلبية التي تناسب توزيع Poisson لتحديد رقم النسخة. - باستخدام القيم من الخطوة 8.6، حساب رقم النسخة الأولي لكل الباركود الجينوم يتفرد في العينة. تحديد متوسط معدل إيجابية كاذبة من ردود الفعل التحكم السلبية وطرح هذه القيمة من القيم التي تم الحصول عليها في ردود الفعل التجريبية. اضرب القيم حسب الضرورة استنادًا إلى التخفيفات التيتم إجراؤها عند إعداد كل تجربة (الجدول 3).
9. تحديد اللياقة النسبية للكائن الحي عن طريق حساب CI أو COI من القياس الكمي المستندإلى PCR الرقمية من سلالات الباركود
- حساب CI من سلالة الباركود باستخدام الصيغ التالية حيث:A الإخراج هو التحديد الكمي المطلق للسلالة الباركود في نقطة زمنية معينة، WTالإخراج هو التحديد الكمي المطلق للبكتيريا من نوع البرية الباركود في نفس timepoint،A الإدخال هو الكم المطلق من inoculum المدخلات من سلالة الباركود، WTالإدخال هو الكم المطلق من التلقيح المدخلات من البكتيريا من نوع البرية الباركود، Xالإخراج هو جمع جميع السلالات في نفس الوقت، Xالإدخال هو خلاصة التلقيح الإدخال الكلي لجميع سلالات الباركود.
ملاحظة: راجع المناقشة للحصول على المزايا والعيوب والاستخدام الأنسب لكل صيغة.
- كرر الخطوة 9.1 لكل سلالة الباركود في جميع نقاط الوقت.
- إذا كان ذلك ممكناً، حساب COI باستخدام الصيغ التالية حيث:A الإخراج هو التحديد الكمي المطلق لسلالة الباركود مع الجينات المتحولة A في نقطة زمنية معينة،AB الإخراج هو التحديد الكمي المطلق لسلالة الباركود مع الجينات المتحولة A و B في نفس الوقت،A Input هو التحديد الكمي المطلق للإدخال inoculum من سلالة الباركود مع الجينات المتحولة A،ABInput هو التحديد الكمي المطلق لتلقيح المدخلات من سلالة الباركود مع الجينات المتحولة A و B، Bالإخراج هو التحديد الكمي المطلق لسلالة الباركود مع الجينات المتحولة B في نقطة زمنية معينة ، وBالإدخال هو التحديد الكمي المطلق للمدخلات inoculum من سلالة الباركود مع الجينات المتحولة B.
و/أو
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتطلب استخدام هذه المنهجية إجراء ردود فعل مراقبة مناسبة للتحقق من حساسية وخصوصية كل مسبار يستخدم لتحديد الحمض النووي المستهدف. في هذه التجربة التمثيلية، قمنا بالتحقق من صحة ثمانية الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها مع تحقيقات المقابلة الثمانية لتحديد الهوية. وكان لجميع التحقيقات الثمانية معدل منخفض من الإيجابيات الكاذبةفي كل من المجلس الوطني الانتقالي وردود الفعل السلبية للسيطرة (الجدول 3)، مما يبرز خصوصيتها حتى بين تسلسلات الحمض النووي المتشابهة للغاية. لتقييم حساسية كل حالة، تم تخفيف gDNA التي تحتوي على الباركود فريدة من نوعها بشكل تسلسلي في خلفية ثابتة من gDNA تحتوي على كل من تسلسل الباركود السبعة المتبقية. ومع النهج المبين أعلاه، يمكن أن يميز PCR الرقمي بين نسختين من gDNA في خلفية تبلغ حوالي 2,000,000 تسلسل اتّصال اتّصال اتّصال اتّصال اتّجاهات مماثلة [دنا] (الجدول3).
بالإضافة إلى تحديد حساسية وخصوصية كل مسبار وتسلسل الباركود الحمض النووي، والتخفيفات التي أجريت في دراسة التحقق من الصحة سمح لنا لحساب مؤشر تنافسية محاكاة من البيانات الناتجة. وفي حين لم يكن هناك إدخال أو إخراج حقيقي لهذه التجربة، يمكن تحليل البيانات كما لو كانت تجربة منافسة قد أجريت. للقيام بذلك، ونحن نعتبر كل خليط في التخفيف التسلسليكمخرج (إخراج) للالباركود المخفف، في حين أن الناتج الإجمالي (Xالإخراج)،والمدخلات (إدخال)، والمدخلات الإجمالية (Xالإدخال)من كل سلالة يتم حسابها من القياس الكمي في الضوابط الإيجابية حيث يتم تضمين جميع الباركود. وباستخدام عامل التخفيف لكل خليط، تم تحديد CI النظرية والمبلغ عنها في الجدول3. في كل من سلسلة التخفيف التي أجريت لكل الباركود، يتم الإبلاغ عن متوسط CI محاكاة جنبا إلى جنب مع الانحرافات المعيارية لكل سلسلة تخفيف مكررة. في جميع الحالات، CI محاكاة التي تم حسابها مشابهة لCI النظرية. وتحيد غالبية الـ CIs المحسوبة عن الـ CIs النظرية بنسبة تقل عن 25%. في حالات انخفاض CIs النظرية، كان انحراف القيمة المحسوبة أعلى من 2 أضعاف. على سبيل المثال، يمثل هذا تغييرًا من CI نظري ة 0.000625 إلى CI محسوبة من 0.001220. وتبرز هذه البيانات أن الطريقة الموصوفة دقيقة للغاية ودقيقة للغاية. مزيج من الحساسية العالية، والخصوصية، والدقة، والدقة تمكن هذا النظام للكشف بشكل موثوق الاختلافات في اللياقة البدنية التي قد تذهب خلاف ذلك دون أن يلاحظها أحد.
بعد التحقق من أن الباركود الجينوم يمكن الكشف عنها بدقة وكميا،قمنا بإجراء تجارب المنافسة في المختبر (الجدول 4). استخدمت تجربة المنافسة الأولى ثمانية من نوع البرية S. سلالات التيفيمواليوم أن كل تحتوي على الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها. وقد نمت كل سلالة بين عشية وضحاها، واختلطت الثقافات الثمانية معا بكميات متساوية. 100 تم استخدام 100 ميكرولتر من هذا التلقيح المختلط لتلقيح 4.9 مل من مرق LB العقيم والثقافة الناتجة عن ذلك تم احتضانها في 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر. تم حصاد gDNA من التلقيح لحساب المدخلات الدقيقة لكل سلالة. تم رصد نمو الثقافة من خلال قياس امتصاص في 600 نانومتر (OD600). في OD600 = 0.5 (المرحلة اللوغاريتمية)، تم جمع عينة من كل ثقافة وتم حصاد gDNA. تم إرجاع الثقافة المتبقية إلى 37 درجة مئوية مع التحريض المستمر حتى 8 ساعات بعد التلقيح عندما تم جمع عينة نهائية وحصاد gDNA (ثابتة). تم حساب النتائج باستخدام صيغة CI المعدلة للعدوى المجمعة. وكما هو متوقع، فإن جميع السلالات البريةكانت لها قيم CI تساوي تقريباً 1 (الجدول 4). تم إجراء تجربة منافسة مماثلة باستخدام ثمانية متحولة S. سلالات Typhimurium أن كل الباركود فريدة من نوعها بالإضافة إلى نقص واحد، مزدوج، أو ثلاثي transketolase18. كما هو مبين سابقا، نمت جميع سلالات بالمثل في مرق LB، مع تأخر طفيف فقط لوحظ في سلالة ثلاثية الانترالكية ناقص. ومع ذلك، عندما تم تقييم نمو كل سلالة عن طريق تحليل CI، لوحظ عيب أكثر عمقا للسلالة التي تعاني من نقص في التراوكيتولاز (تمت مقارنة CI مع منحنيات النمو في شو وآخرون18). وعلاوة على ذلك، أتاحت لنا هذه التجربة أن نمنح قيمة قابلة للقياس الكمي لخصائص نمو كل سلالة بدلا من مجرد وصف نوعي لأنماط النمو. وقد تم حساب CIs لكل سلالة باستخدام كل من الصيغة التقليدية حيث تم مقارنة كل سلالة فقط إلى النوع البري والصيغة المعدلة حيث تم النظر في جميع سلالات الإدخال. وفي حين كانت التغييرات صغيرة، فإن درجة اللياقة البدنية للسلالة التي تعاني من نقص ثلاثي في الترانسكيتولاز كانت منخفضة بشكل مصطنع في الصيغة التقليدية لأنها لا تأخذ في الاعتبار السلالات الستة الأخرى المتنافسة التي أظهرت جميعها اللياقة البدنية شبه البرية.
| سلالات | الجيني | المصدر أو المرجع |
| S. Typhimurium ATCC 14028s | البرية من نوع | فى الانمازى |
| TT22236 | LT2 السالمونيلا تحمل pTP2223 | (27) |
| درهم DH5α | F– φ80لاكZΔM15 Δ (لاك ZYA-argF) U169 recA1 نهايةA1 hsdR17 (صK–, مK+) فوA supE44 י–ثي-1 gyrA96 relA1 | (28) |
| JAS18077 | putP::AA::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18080 | بوتب::AD:: FRT | هذه الدراسة |
| JAS18083 | بوتب::إيه جي:: FRT | هذه الدراسة |
| JAS18088 | بوتب::AL:: FRT | هذه الدراسة |
| JAS18091 | putP::AO::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18096 | بوتب::AT::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18099 | بوتب::AW::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18100 | بوتب::AX::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18122 | ΔtktA::FRT putP::AD::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18130 | ΔtktB::FRT putP::AL::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18138 | ΔtktC::FRT putP::AT::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18125 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRT putP::AG::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18133 | ΔtktA::FRT ΔtktC::FRT putP::AO::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18141 | ΔtktB::FRT ΔtktC::FRT putP::AW::FRT | هذه الدراسة |
| JAS18142 | ΔtktA::FRT ΔtktB::FRT ΔtktC::FRT putP::AX::FRT | هذه الدراسة |
| البلازميدات | ||
| PKD13 | محمد محمد FRT ahp FRT PS1 PS4 oriR6K | (14) |
| pPCR النصي كام SK + | ColE1 ori; سمR | ستراتاجين/أليجنت |
| محمد الدوسري | بلاك لام الرهان exo tetR | (16) |
| محمد الدوسري | بلا القط cI857 PRflp pSC101 oriTS | (29) |
| محمد الكان | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AA | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AD | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AG | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AL | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AO | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AT | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AW | هذه الدراسة |
| محمد الدوسري | ColE1 ori; سمR; محمد محمد FRT ahp FRT; AX | هذه الدراسة |
الجدول 1: السلالات والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة.
| اسم | تسلسل (5' - 3')1,2,3 |
| pSKAP SDM AA - F | أغاجيتكت جي تي جي جي جي جي تي جي جي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جي تي جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AA - R | ACTCAAGCACCAGGAGACTTCT المركز |
| pSKAP SDM AD - F | AAGAGCACGGTGAGGTGGTAGTAGG جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AD - R | CCTACTCACCTCACCGTGTTTTT المركز |
| pSKAP SDM AG - F | AGTAGTCCTGGAGGAGCATGTGT جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AG - R | TCACATGCTCCAGGACACTACT المركز |
| pSKAP SDM AL - F | ACCACACATCGAAGGCACTAGCTCTT المركز |
| pSKAP SDM AL - R | أغاكتاغتGCCTTGTGTGTGT جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AO - F | GTCCACAACACACCAGTGTATACT المركز |
| pSKAP SDM AO - R | AGTATCACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AT - F | ACCAGTGTCCGTGTATGGCTAGAC جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AT - R | GTCTAGCCGTGTGGACACTGGT المركز |
| pSKAP SDM AW - F | في هذا الـ15 جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AW - R | CGTCACATCATCACTCAGTCGT المركز |
| pSKAP SDM AX - F | ACTATCGTGTAACGACAGGCTG جغاتغتج جتاججي جي جي جي جي |
| pSKAP SDM AX - R | في الفرنسيّة المركز |
| M13 - F | GTAAAACGACGGCCAG |
| عرض الأوّل 100 إعادة التركيب - F |
TAGCGGTGGGAGAACACGTTAATATCCATTTTAA TGCAGCATTACACGTC |
| عرض الأوّل 100 إعادة التركيب - R |
TACTGCGTGTATATGCGTGAAAACATCCATAACCCATTG CCTGCAGTGAAGTTCC |
| qPCR منطقة الباركود تضخيم - F1 | TGCAGCATTACACGTTG |
| qPCR منطقة الباركود تضخيم - R2 | TAGGAACTCGAAGC |
| الباركود AA التحقيق - FAM | 6-FAM/AGAAGTCTC/ZEN/CTGCTGGTGTGTGTGTGTTC/IBFQ |
| الباركود AD التحقيق - FAM | 6-FAM/AAGAGCACG/ZEN/GTGAGGTGATAGGC/IBFQ |
| الباركود AG التحقيق - FAM | 6-FAM/AGTAGTGTC/ZEN/CTGGAGGAGCATGTGAC/IBFQ |
| الباركود AL التحقيق - FAM | 6-فام / أغاكتاغت / زين / GCCTTCGGTGTGTTC / IBFQ |
| الباركود AO التحقيق - HEX | HEX/AGTATCACT/ZEN/GAGTGTGTGTGTGTGTACC/IBFQ |
| الباركود في التحقيق - HEX | HEX/ACCAGTGTC/ZEN/CGTGACATGGCTAGACC/IBFQ |
| الباركود AW التحقيق - HEX | HEX/ACGACTGAG/ZEN/TGGTGTGTGTGACGC/IBFQ |
| الباركود AX التحقيق - HEX | HEX/ACTATCGTG/ZEN/GTGTAACGACAGGCTGC/IBFQ |
|
1 تشير النيوكليوتيدات المسطرة إلى تسلسلات تكميلية لكل شريط ية للحمض النووي يتم إدراجها على pSKAP بعد SDM. 2 النيوكليوتيدات المسطرة المزدوجة تشير إلى منطقة متكاملة على S. كروموسوم التيفيميوريوم يستخدم لاستبدال الأليليك. 3 تحقيقات كيوبيآر PrimeTime هي oligos التهجين المسمى بصبغة فلورسنت 5'، إما 6-carboxyfluoressin (6-FAM) أو سداسي كلورفلورسين (HEX)، وquencher داخلي (ZEN)، و3 ' quencer أيوا الأسود® FQ (IBFQ). |
|
الجدول 2: المواد التمهيدية والمسبارات المستخدمة في هذه الدراسة.
| القياس الكمي (نسخ/20 درجة مئوية) | ||||||||
| وصف | Aa | الاعلان | Ag | AL | AO | في | AW | Ax |
| المجلس الوطني الانتقالي | غير مأبو | 0.000 | 0.000 | 3.510 | غير مأبو | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| المجلس الوطني الانتقالي | 3.600 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| المجلس الوطني الانتقالي | 3.510 | 0.000 | 1.280 | 1.180 | 2.340 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| المجلس الوطني الانتقالي | 2.290 | 0.000 | 0.000 | 1.200 1 | 1.150 | 1.160 | 0.000 | 0.000 |
| يعني | 3.133 | 0.000 | 0.320 | 1.473 1.473 | 1.163 | 0.290 | 0.000 | 0.000 |
| السلبيه | 5.130 | 1.156 1.156 | 0.000 | 1.124 | 3.745 | 1.281 | 7.354 | 7.142 |
| السلبيه | 5.270 | 0.000 | 0.000 | 1.087 1.087 | 1.666 | 1.643 | 7.746 | 2.269 |
| السلبيه | 2.660 | 0.000 | 1.361 | 1.451 | 8.974 | 0.000 | غير مأبو | 0.000 |
| السلبيه | 6.090 | 0.000 | 0.000 | 2.251 | 0.000 | 2.531 | 8.700 | 3.495 |
| السلبيه | 1.740 جنيه | 0.000 | 1.086 كلم/س | 2.130 | 4.171 | 0.000 | 7.113 | 5.522 |
| السلبيه | 6.220 | 3.581 | 0.000 | 4.022 | 1.175 1.175 | 1.341 | غير مأبو | 5.950 |
| يعني | 4.518 | 0.789 | 0.408 | 2.011 | 3.288 | 1.133 | 7.728 | 4.063 |
| ايجابيه | 22281.540 | 42673.039 | 46442.242 | 45359.180 | 47885.625 | 15708.027 | 45325.906 | 20810.559 |
| ايجابيه | 23989.676 | 44625.523 | 47356.438 | 45790.660 | 47456.973 | 15096.601 | 47929.840 | 22455.234 |
| ايجابيه | 17846.824 | 38980.133 | 45633.809 | 44174.820 | 33875.039 | 15156.063 | 42536.270 | 21467.840 |
| ايجابيه | 21047.588 | 40140.848 | 41672.648 | 46028.496 | 47426.527 | 16718.000 | 46978.664 | 19876.473 |
| ايجابيه | 20218.238 | 44660.602 | 41718.707 | 45799.375 | 46495.602 | 14590.264 | 54741.023 | 22011.938 |
| ايجابيه | 18531.740 | 41620.801 | غير مأبو | 48082.313 | 35645.199 | 15341.382 | 48950.992 | 21117.559 |
| يعني | 20652.601 | 42116.824 | 44564.769 | 45872.474 | 43130.827 | 15435.056 | 47743.783 | 21289.934 |
| طرح فارغ | 20648.083 | 42116.035 | 44564.361 | 45870.463 | 43127.539 | 15433.923 | 47736.054 | 21285.871 |
| A غير مخفف | 23024.961 | 44448.875 | 58897.510 | 51120.948 | 55450.191 | 18155.305 | 62844.068 | 27567.828 |
| B غير المخفف | 18278.174 | 35252.586 | 54409.510 | 66022.396 | 43101.148 | 15732.609 | 60761.328 | 26581.979 |
| 1/50 ألف | 521.670 | 755.035 | 1066.898 | 1287.187 | 1053.339 | 181.324 | 1278.336 | 580.961 |
| 1/50 باء | 435.326 | 634.215 | 1168.087 | 1383.537 | 991.040 | 165.443 | 1180.445 | 596.461 |
| 1/100 ألف | 228.028 | 598.848 | 603.911 | 631.116 | 507.956 | 258.405 | 665.647 | 331.590 |
| 1/100 باء | 256.330 | 585.834 | 583.325 | 670.875 | 459.325 | 289.207 | 638.916 | 307.948 |
| 1/200 ألف | 121.283 | 300.293 | 258.247 | 346.965 | 234.774 | 114.163 | 169.055 | 1,553.100 |
| 1/200 باء | 114.638 | 313.040 | 253.685 | 297.216 | 191.637 | 179.895 | 280.989 | 147.297 |
| 1/400 ألف | 42.829 | 141.343 | 127.337 | 163.605 | غير مأبو | 71.241 | 157.697 | 85.976 |
| 1/400 باء | 59.544 | 180.543 | 162.080 | 162.108 | 115.508 | 104.682 | 151.141 151 | 87.804 |
| 1/800 ألف | 34.304 | 67.934 | 65.939 | 83.857 | 66.134 | 31.784 | 82.722 | 45.616 |
| 1/800 باء | 20.390 | 80.222 | 81.453 | 85.325 | 53.102 | 38.034 | 55.460 | 29.660 |
| 1/1600 A | 15.405 | 44.505 | 47.672 | 39.613 | 33.027 | 18.006 | 37.655 | 20.988 |
| 1/1600 B | 22.091 | 48.828 | 46.781 | 37.388 | 30.245 | 30.138 | 34.553 | 19.795 |
| 1/3200 A | 12.333 | 22.104 | 16.850 | 18.403 | 11.460 | 10.535 جنيه | 21.245 | 9.218 |
| 1/3200 باء | 6.796 | 32.555 سنة | 15.742 | 26.249 | 15.111 | 9.908 | 23.393 | 10.175 |
| طرح فارغ | ||||||||
| A غير مخفف | 23020.443 | 44448.086 | 58897.103 | 51118.937 | 55446.903 | 18154.172 | 62836.339 | 27563.765 |
| B غير المخفف | 18273.655 | 35251.797 | 54409.103 | 66020.385 | 43097.860 | 15731.477 | 60753.600 | 26577.916 |
| 1/50 ألف | 517.152 | 754.246 | 1066.490 | 1285.176 | 1050.051 | 180.192 | 1270.607 | 576.898 |
| 1/50 باء | 430.808 | 633.426 | 1167.679 | 1381.526 | 987.751 | 164.311 | 1172.717 | 592.398 |
| 1/100 ألف | 223.509 | 598.059 | 603.503 | 629.105 | 504.668 | 257.272 | 657.918 | 327.527 |
| 1/100 باء | 251.812 | 585.044 | 582.918 | 668.864 | 456.036 | 288.074 | 631.187 | 303.885 |
| 1/200 ألف | 116.765 | 304.503 | 257.840 | 344.954 | 231.486 | 113.030 | 161.327 | 168.490 |
| 1/200 باء | 110.120 | 312.251 | 253.277 | 295.205 | 188.348 | 178.762 | 273.261 | 143.234 |
| 1/400 ألف | 38.310 | 140.554 | 126.929 | 161.594 | غير مأبو | 70.108 | 149.968 | 81.913 |
| 1/400 باء | 55.026 | 179.753 | 161.672 | 160.097 | 112.219 | 103.549 | 143.413 | 83.741 |
| 1/800 ألف | 29.786 | 67.145 | 65.531 | 81.847 | 62.846 | 30.651 | 74.994 | 41.553 سنة |
| 1/800 باء | 15.872 | 79.433 | 81.045 | 83.314 | 49.813 | 36.901 | 47.732 | 25.596 |
| 1/1600 A | 10.886 جنيه | 43.716 | 47.264 | 37.602 | 29.739 | 16.874 | 29.927 | 16.925 |
| 1/1600 B | 17.573 | 48.039 | 46.373 | 35.377 | 26.957 | 29.005 | 26.825 | 15.732 |
| 1/3200 A | 7.815 | 21.314 | 16-442 | 16.392 | 8.172 | 9.402 | 13.517 | 5.155 |
| 1/3200 باء | 2.278 | 31.765 | 15.334 | 24.238 | 11.822 | 8.776 | 15.664 | 6.112 |
| محاكاة CI | ||||||||
| A غير مخفف | 1.114895 | 1.055372 1.05 | 1.321619 | 1.114419 | 1.285650 | 1.176251 | 1.316329 | 1.294932 |
| B غير المخفف | 0.885005 | 0.837016 | 1.220911 | 1.439279 | 0.999312 | 1.019279 | 1.272698 | 1.248618 |
| 1/50 ألف | 0.025046 | 0.017909 | 0.023931 | 0.028018 | 0.024348 | 0.011675 | 0.026617 | 0.027102 |
| 1/50 باء | 0.020864 | 0.015040 | 0.026202 | 0.030118 | 0.022903 | 0.010646 | 0.024567 | 0.027831 |
| 1/100 ألف | 0.010825 | 0.014200 | 0.013542 | 0.013715 | 0.011702 | 0.016669 | 0.013782 | 0.015387 |
| 1/100 باء | 0.012195 | 0.013891 | 0.013080 | 0.014582 | 0.010574 | 0.018665 | 0.013222 | 0.014276 |
| 1/200 ألف | 0.005655 | 0.007230 | 0.005786 | 0.007520 | 0.005367 | 0.007323 | 0.003380 | 0.007916 |
| 1/200 باء | 0.005333 | 0.007414 | 0.005683 | 0.006436 | 0.004367 | 0.011582 | 0.005724 | 0.006729 |
| 1/400 ألف | 0.001855 | 0.003337 | 0.002848 | 0.003523 | غير مأبو | 0.004542 | 0.003142 | 0.003848 |
| 1/400 باء | 0.002665 | 0.004268 | 0.003628 | 0.003490 | 0.002602 | 0.006709 | 0.003004 | 0.003934 |
| 1/800 ألف | 0.001443 | 0.001594 | 0.001470 | 0.001784 | 0.001457 | 0.001986 | 0.001571 | 0.001952 |
| 1/800 باء | 0.000769 | 0.001886 | 0.001819 | 0.001816 | 0.001155 | 0.002391 | 0.001000 | 0.001203 |
| 1/1,600 ألف | 0.000527 | 0.001038 | 0.001061 | 0.000820 | 0.000690 | 0.001093 | 0.000627 | 0.000795 |
| 1/1,600 باء | 0.000851 | 0.001141 | 0.001041 | 0.000771 | 0.000625 | 0.001879 | 0.000562 | 0.000739 |
| 1/3200 ألف | 0.000378 | 0.000506 | 0.000369 | 0.000357 | 0.000189 | 0.000609 | 0.000283 | 0.000242 |
| 1/3,200 باء | 0.000110 | 0.000754 | 0.000344 | 0.000528 | 0.000274 | 0.000569 | 0.000328 | 0.000287 |
| متوسط CI (النظري) | ||||||||
| غير مخفف (1) | 0.999950 | 0.946194 | 1.271265 | 1.276849 | 1.142481 | 1.097765 | 1.294514 12 | 1.271775 |
| 1/50 (0.02) | 0.022955 | 0.016474 | 0.025067 | 0.029068 | 0.023625 | 0.011161 | 0.025592 | 0.027466 |
| 1/100 (0.01) | 0.011510 | 0.014046 | 0.013311 | 0.014148 | 0.011138 | 0.017667 | 0.013502 | 0.014832 |
| 1/200 (0.005) | 0.005494 | 0.007322 | 0.005735 | 0.006978 | 0.004867 | 0.009453 | 0.004552 | 0.007322 |
| 1/400 (0.0025) | 0.002260 | 0.003803 | 0.003238 | 0.003507 | 0.00260* | 0.005626 | 0.003073 | 0.003891 |
| 1/800 (0.00125) | 0.001106 | 0.001740 | 0.001645 | 0.001800 | 0.001306 | 0.002188 | 0.001285 | 0.001577 |
| 1/1,600 (0.000625) | 0.000689 | 0.001089 | 0.001051 | 0.000795 | 0.000657 | 0.001486 | 0.000594 | 0.000767 |
| 1/3,200 (0.000313) | 0.000244 | 0.000630 | 0.000357 | 0.000443 | 0.000232 | 0.000589 | 0.000306 | 0.000265 |
| الانحراف المعياري | ||||||||
| مخفف | 0.11494 | 0.10918 | 0.05035 | 0.16243 | 0.14317 | 0.07849 | 0.02182 | 0.02316 |
| 1/50 | 0.00209 | 0.00143 | 0.00114 | 0.00105 | 0.00072 | 0.00051 | 0.00103 | 0.00036 |
| 1/100 | 0.00069 | 0.00015 | 0.00023 | 0.00043 | 0.00056 | 0.00100 | 0.00028 | 0.00056 |
| 1/200 | 0.00016 | 0.00009 | 0.00005 | 0.00054 | 0.00050 | 0.00213 | 0.00117 | 0.00059 |
| 1/400 | 0.00040 | 0.00047 | 0.00039 | 0.00002 | 0* | 0.00108 | 0.00007 | 0.00004 |
| 1/800 | 0.00034 | 0.00015 | 0.00017 | 0.00002 | 0.00015 | 0.00020 | 0.00029 | 0.00037 |
| 1/1,600 | 0.00016 | 0.00005 | 0.00001 | 0.00002 | 0.00003 | 0.00039 | 0.00003 | 0.00003 |
| 1/3,200 | 0.00013 | 0.00012 | 0.00001 | 0.00009 | 0.00004 | 0.00002 | 0.00002 | 0.00002 |
| * يمثل نتائج تجربة واحدة. | ||||||||
الجدول 3: القياس الكمي المطلق وحساب CI المحاكاة.
| حاله | مؤشر تنافسي1 | |||||||
| التجربة 1 | ||||||||
| WTAA | WTAD | WTAG | WTAL | WTAO | WTAT | WTAW | WTAX | |
| لوغاريتمي | 0.927 ± 0.033 | 0.992 ± 0.031 | 1.068 ± 0.025 | 0.921 ± 0.02 | 1.044 ± 0.03 | 1.051 ± 0.057 | 1.094 ± 0.027 | 0.929 ± 0.005 |
| ثابته | 1.1 ± 0.021 | 1.071 ± 0.053 | 1.079 ± 0.065 | 0.948 ± 0.02 | 0.98 ± 0.02 | 0.873 ± 0.044 | 0.97 ± 0.056 | 1.021 ± 0.007 |
| التجربة 2 | ||||||||
| CI (التقليدية) | WTAA | ΔAAD | ΔBAL | ΔCAT | ΔABAG | ΔACAO | ΔBCAW | ΔABCAX |
| لوغاريتمي | 1 ± 0 | 0.802 ± 0.084 | 0.957 ± 0.02 | 0.989 ± 0.073 | 0.581 ± 0.153 | 0.86 ± 0.053 | 0.995 ± 0.011 | 0.695 ± 0.061 |
| ثابته | 1 ± 0 | 0.97 ± 0.063 | 1.043 ± 0.058 | 0.99 ± 0.036 | 1.625 ± 0.589 | 0.835 ± 0.051 | 0.912 ± 0.047 | 0.477 ± 0.049 |
| CI (التلقيح المجمع) | ||||||||
| لوغاريتمي | 1.114 ± 0.039 | 0.864 ± 0.074 | 1.073 ± 0.032 | 1.1 ± 0.068 | 0.633 ± 0.152 | 0.938 ± 0.056 | 1.111 ± 0.043 | 0.746 ± 0.06 |
| ثابته | 1.078 ± 0.039 | 1.039 ± 0.049 | 1.166 ± 0.093 | 1.066 ± 0.01 | 1.735 ± 0.613 | 0.876 ± 0.035 | 0.97 ± 0.045 | 0.49 ± 0.047 |
| 1 القيم تمثل يعني CI ± الانحراف المعياري لثلاث أو أربع تجارب تكرار. | ||||||||
الجدول 4: النتائج التمثيلية للمنافسة في المختبر بين S. سلالات التيفيمواليوم.
الجدول S1 التمهيديات الاختيارية لخلق تسلسل الباركود إضافية وتحقيقات الفلورسنت المقابلة للكشف عنها. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل 1 جيل من pSKAP. (أ) تعرضت تنقية pKD13 لقيود الهضم مع HindIII وBamHI. (باء، جيم) تم تنقية جزء 1333 نقطة أساس من الاهتمام الذي يحتوي على جين مقاومة كاناماسين محاط بـ FRT. (D) pPCR النصي كام SK + كما تم هضمها مع HindIII وBamHI وجزءا من pKD13 (B) كان مربط في لتوليد (E) pSKAP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الطفرات الموجهة إلى الموقع الإلحاقي إلى pSKAP. (أ) تم إدخال 25 نقطة في الثانية من الرموز الشريطية للحمض النووي في الموقع 725 باستخدام PCR. تم تصميم التمهيديات الأمامية والعكسية الخاصة بهذا الموقع مع ملحقات تكميلية من 25-nucleotide 5' (يشار إليها في التمهيدي على أنها صغيرة "أ"). (B) يظهر pSKAP_Barcode بلازميد عام الناتجة عن SDM مع موقع الباركود الحمض النووي المدرجة أبرز البرتقال. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إعادة ترتيب الكروموسومات في أسفل مجرى البوت. (A) بعد إعادة تركيب ة حمراء، يتم إدخال جين مقاومة الكاناميسين القابل للتحديد (الأرجواني الداكن) الذي تحيط به مواقع FRT (رمادي) على الكروموسوم بين الموقع المشار إليه (موقع إعادة تركيب الكروموسومات، أحمر). يتم إدراج الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها (البرتقالي) خارج موقع FRT. (ب) تتم إزالة جين مقاومة كانامايسين عن طريق الختان بوساطة FRT، وترك بقايا الحمض النووي المدرج على الكروموسوم (مجموع الحمض النووي المدرج، الأزرق) تتكون من الباركود الحمض النووي وندبة FRT. (C) يظهر تسلسل الحمض النووي الكروموسومي المعدل المحيط بالحمض النووي المدرج، جنبا إلى جنب مع مواقع فتيلة التضخيم (الأرجواني الفاتح) المستخدمة في PCR الرقمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخطط التخفيف للتحقق من حساسية مسبار الفلورسنت وخصوصيته. (أ) يتم خلط gDNA النقية من سبع سلالات الباركود معا بكميات متساوية لخلق مخفف لتمييع gDNA الباركود حذف (AX في المثال أعلاه). (B) إجراء تخفيف تسلسلي من gDNA الباركود حذف (AX في المثال أعلاه) باستخدام مخفف أعدت المذكورة سابقا. خلط محتويات كل أنبوب جيدا قبل نقل إلى الأنبوب التالي. تم إنشاء الشكل 4 مع BioRender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تخطيط لوحة لتحليل حساسية وخصوصية التمهيدي التحقيق مجموعات 1 و 2. تتضمن تجربة PCR الرقمية NTCs، والضوابط الإيجابية، والضوابط السلبية، ومخططات التخفيف لكل من الباركود التي تم اختبارها. لوحة للتحقق من صحة التمهيدي التحقيق مجموعات 3 و 4 وضعت في نفس النمط باستخدام gDNA الباركود المناسبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج PCR الرقمية التمثيلية للحمض النووي الريبي المخفف. تم تخفيف gDNA التي تحتوي على الباركود AA في خلفية من جميع gDNA الباركود الأخرى كما هو موضح في الشكل 4. تمثل القناة 1 مسبار FAM لالباركود AA (اللوحات العلوية) بينما تمثل القناة 2 مسبار HEX لالباركود AO (لوحات أسفل). يتم عرض نتائج كل مسبار على حد سواء السعة الفلورية قطرات الفردية (الألواح اليسرى) والرسم البياني الذي يمثل تواتر كثافة الفلورسنت من جميع قطرات في الآبار المختارة (الألواح اليمنى). لكل حالة، يجب أن تشكل قطرات إيجابية (الفلورة العالية) والسلبية (انخفاض الفلورة) اثنين من السكان متميزة. في حالة AA التي تم تخفيفها، ومعظم قطرات كانت سلبية، الرسم البياني (أعلى لوحة اليمين) يبدو أن تصور فقط عدد واحد من السكان. ويرجع ذلك إلى أن عدد القطرات الإيجابية يفوق إلى حد كبير عدد قطرات سالبة؛ ومع ذلك، اثنين من السكان متميزة لا تزال مرئية عن طريق فحص السعة الفلورية قطرات في الألواح اليسرى. وينبغي فصل السكان باستخدام ميزة العتبة لتعريف قطرات إيجابية وسلبية (تصورها الخط الوردي). وسوف تختلف قيم العتبة تبعاً للتحقيقات التي استخدمت، ولكن جميع الآبار التي تستخدم نفس مزيج المسبار ينبغي أن تكون لها عتبات متطابقة. كما تم تخفيف gDNA AA-الباركود، وهناك انخفاض في قطرات إيجابية (الفلورسنت عالية) في حين أن عدد قطرات AO إيجابية لا تزال ثابتة في الخلفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة على تحديد بدقة الكائنات الحية الدقيقة هي ذات أهمية قصوى لبحوث علم الأحياء الدقيقة، والقدرة على تعداد سلالات فريدة من نوعها من السكان مختلطة الأولية ثبت أن تكون أداة لا تقدر بثمن لتقييم اللياقة البدنية والصفات الشرسة في البكتيريا. ومع ذلك، فإن تقنيات تحقيق ذلك لم تتقدم في وتيرة التطورات الحديثة في البيولوجيا الجزيئية. التكنولوجيا لتعديل بسهولة كروموسومات العديد من البكتيريا، بما في ذلك S. Typhimurium، كانت متاحة لما يقرب من عقدين14، ولكن نادرا ما استخدمت هذه القدرة لسلالات وضع العلامات جزيئيا مع تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها. من خلال استغلال القدرة على خلق سلالات يمكن التعرف عليها بسهولة على أساس الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها، الحد الأدنى من التخريب إدراجها على الكروموسوم البكتيري، إلى جانب أكثر من أحدث التقنيات للكشف عن وقياس هذه المعرفات الجزيئية ( أي PCR الرقمية)، أنشأنا نظام يوفر حساسية رائعة، وخصوصية، والدقة، والدقة لتحديد كمية السلالات الفردية بسهولة ضمن مجموعة متنوعة من البكتيريا.
يعتمد حساب CIs وCOIs كما هو موضح أعلاه على القدرة على إجراء التعديلات المناسبة بدقة على الكروموسومات البكتيرية. وينبغي التحقق من جميع التعديلات عن طريق تسلسل Sanger للتأكد من عدم حدوث طفرات عشوائية. استخدام البوليمر عالية الدقة سوف يقلل من هذه الأخطاء، ولكن أي مثل هذه الطفرات التي تحدث سوف تضعف القدرة على الكشف عن سلالة، وهو جانب آخر حاسم من هذا البروتوكول. على الرغم من أننا أثبتنا أن PCR الرقمية يمكن الكشف عن عدد قليل من نسختين gDNA في خلفية ما يقرب من 2 مليون، سلالات خارج هذا النطاق قد تتطلب تخفيف إضافية لتحديد ها دقيقة. وعلاوة على ذلك، يجب تصميم تسلسل الباركود الحمض النووي لتسهيل استخدام تسلسلات التحقيق عالية الجودة. وينبغي تحليل تسلسل التحقيق للنزعات إلى التمتمة الذاتية، وتشكيل دبابيس الشعر، أو ربط أهدافها بشكل غير فعال. لا يمكن الحد من أهمية استخدام تسلسلات الجودة وتحقيقاتها، وهي حقيقة تتجلى في تجارب التحقق الدقيق التي يجب إجراؤها مع كل مسبار. الجهود الرامية إلى إنشاء الباركود الحمض النووي الأمثل خلق نتائج القياس الكمي PCR الرقمية المثلى.
في حين أن العلامات الجزيئية المصممة بعناية مهمة للحصول على نتائج جيدة، فإن تفسير النتائج هو جانب حاسم آخر من جوانب هذا البروتوكول. يتم تعريف CI على أنها النسبة بين سلالة متحولة وسلالة من النوع البري فيالإخراج مقسومة على نسبة السلالات اثنين في المدخلات 1،19،20. وهذه الCI التقليدية المعروضة في القسم 9 مفيدة عندما تتكون العدوى المختلطة من سلالة واحدة فقط مقابل من النوع البري. ومع ذلك، عند استخدام برك كبيرة من السلالات لتلقيح وسائل الإعلام أو الحيوانات، سلالات لا تتنافس فقط ضد نوع البرية، ولكن أيضا ضد كل سلالة أخرى موجودة في الأوعجة. وقد فشلت الدراسات السابقة التي أجريت تجارب المنافسة باستخدام سلالات متعددة تصيب فيأخذ ذلك في الاعتبار في حساباتها 7،13. لحساب هذه الميزة من العدوى المختلطة، قدمنا صيغة لحساب CIs التي تم تعديلها للعدوى المجمعة. ومن غير المرجح أن توفر جميع السلالات نفس المستوى من المنافسة التي يمكن أن توفرها سلالة من النوع البري. ومع ذلك، لأن معظم الجينات البكتيرية لها تأثير ضئيل على ضراوة، مع زيادة عدد السلالات المستخدمة في تجربة مؤشر تنافسية، فإن احتمال أن الشراسة عموما سوف تميل نحو زيادة سلالة من النوع البري. قد لا يكون هذا هو الحال بالضرورة لبعض التصاميم التجريبية باستخدام برك من سلالات كثيرة مع جميع العيوب الضراوة المعروفة. ومع ذلك، يتم حساب هذا في المعادلة المعدلة لأن سلالات أقل وفرة (أقل ملاءمة) في النتيجة سيكون لها تأثير أصغر علىالناتجX . اعتمادا على التصميم التجريبي المحدد، قد تكون هناك حالات يتم فيها تفضيل صيغة واحدة أو أخرى. ومع ذلك، فمن المهم في معظم الحالات التي تنطوي على حالات عدوى مجمعة، أن نعتبر أنه في حالة العدوى المختلطة، تتنافس جميع السلالات ضد بعضها البعض، وليس فقط ضد النوع البري. عند تحليل النتائج، من الأهمية بمكان أن يكون الأساس المنطقي وراء كل صيغة مفهومًا جيدًا لجعل التفسيرات الأكثر دقة للياقة البدنية للإجهاد. عند الإبلاغ عن النتائج، من المهم بنفس القدر الكشف بدقة عن كيفية تحليل البيانات.
ويتضمن القسم 9 من البروتوكول أيضا صيغا للمساعدة في تحديد التفاعلات الجينية باستخدام ثاني أكسيد الكربون. مع هذا التحليل، يمكن إجراء التنبؤات لتحديد ما إذا كان اثنين من الجينات ضراوة تعمل بشكل مستقل أو معا. يتم تعريف COI على أنها نسبة متحولة مزدوجة إلى سلالة متحولة واحدة في الإخراج مقسوما على نسبة سلالات اثنين في المدخلات1. تم تصميم هذه الصيغة للكشف عن الإضافة الفينوتية لاضطرابات الجينات. إذا كانت الجينات تعمل بشكل مستقل لتعزيز ضراوة، فإن تعطيل كلا النوعين من الجينات ينبغي أن يسبب انخفاضا أكبر في اللياقة البدنية مقارنة باضطراب واحد في أي من الجينات وحدها. إذا كانت الجينات تعمل معا لتعزيز ضراوة (مثل الجينات ترميز اثنين من الإنزيمات في مسار)، واضطراب أي من الجينات ينبغي أن يكون لها نفس التأثير على ضراوة كما تعطيل كلا الجينات. يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن الإضافة الفينوتية في الحالات التي يكون فيها مستوى التوهين الناجم عن جين واحد إما مرتفع ًا جدًا أو منخفضًا جدًا. ومع ذلك، فإن المقارنة المباشرة للسلالات داخل نفس النظام الحيواني توفر تبايناً أقل وسرداً أكثر موثوقية للعلاقة الوظيفية بين الجينات، ويمكن إجراء هذا الحساب من سلالات اثنين ضمن عدد أكبر من السكان المختلطين.
ويتمثل أحد الجوانب الحاسمة النهائية لتفسير النتائج في النظر في آثار الديناميات السكانية. في بعض الإصابات المختلطة التي لديها سلالات متعددة، قد تظهر سلالة واحدة إما أكثر هيمنة أو أقل ملاءمة بسبب الانجراف السكاني العشوائي. ويمكن تضخيم هذه الظاهرة عند حدوث أحداث الاختناق. يمكن أن يحدث هذا من استخدام عدد كبير جدا من سلالات الإدخال، وعدد صغير جدا من مجموع البكتيريا في الأوميت، أو مزيج من كليهما. جانب آخر التدخل الذي ينشأ من العدوى المختلطة هو إمكانية في التكامل عبر. يحدث هذا عندما سلالة تناسب، مثل من النوع البري، يعزز بشكل مصطنع ضراوة سلالة أقل ملاءمة. ومن الأمثلة الافتراضية على ذلك مقارنة اللياقة البدنية لS. جزيرة الإميمتر 2 (SPI2) - سلالة الضربة القاضية المصابة بسلالة من النوع البري. SPI2 تمكن S. Typhimurium البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا عن طريق إفراز العوامل في cytosol المضيف الذي يعدل phagosome داخل الضامة. تعطيل هذا النظام يجعل S. التيفيمواليوم عرضة للقتل داخل الخلايا. ومع ذلك، لأن الضامة قادرة على غمر اثنين أو أكثر من البكتيريا في وقت واحد، يمكن أن تتلقى SPI2-خروج المغلوب زيادة كبيرة في اللياقة البدنية إذا كان يقيم في نفس الضامة مثل Sمن النوع البري . التيفيموريوم التي تفرز المفعول في السيتوسول المضيف. والديناميات السكانية العشوائية وإمكانية التكوّن العابر هي قيد على أي تجربة منافسة. إذا كان يشتبه في التكامل عبر, ينبغي تأكيد الأنماط الظاهرية باستخدام أساليب تكميلية أخرى لتقييم اللياقة البدنية. وللتغلب على الديناميات السكانية العشوائية، فإن زيادة عدد التجارب المكررة تزيد من احتمال تحديد القيم الخارجية في النتائج. ولحسن الحظ، فإن البروتوكول الوارد وصفه أعلاه يجعل من الأسهل إجراء عدد أكبر من التجارب المتماثلة المتطابقة لأن عدد الظروف التجريبية ينخفض بشكل كبير.
والعنصر الرئيسي لتقنية CI الموصوفة أعلاه هو قدرتها على التكيف مع أي كائن حي تقريبا وأي تصميم تجريبي يتطلب تحديد دقيق للكائنات الدقيقة الدقيقة. ومع ذلك، فإنه يتطلب التلاعب الوراثي للكائن الحي لدمج تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها على الكروموسوم. وتتطلب قدرة هذه التقنية على التكيف أن تكون الأنواع قابلة للتدقيقت ينوب وراثيا، وستعتمد على وضع بروتوكولات بديلة لتعديل الجينوم (الخطوتان 1 و 2). وينبغي أن تكون الباركود الحمض النووي المدرجة في الجدولين 2 و S1 كافية لمعظم البكتيريا. ومع ذلك، كما هو الحال في جميع التجارب الكمية PCR، فمن المناسب لتحليل الجينوم البكتيري لضمان الحد الأدنى من الإمكانات لربط خارج الهدف من التمهيديات وتحقيقات من خلال تحليل BLAST بسيطة. تسلسل الباركود الحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة تختلف من قبل قواعد 3-4 فقط في بعض الحالات، وتسليط الضوء على خصوصية رائعة من تحقيقات أن يقلل من إمكانية ربط غير محددة. بغض النظر عن خصوصية تحقيقات الفلورسنت، يجب التحقق من صحة كافة تسلسلات الباركود الجديدة بشكل مناسب للحساسية والخصوصية كما هو موضح في الخطوة 6. بعد إنشاء سلالات الباركود، فمن الممكن لتكييف هذا البروتوكول إلى العديد من أنواع التجارب إلى جانب في اختبارات المنافسة في المختبر كما هو موضح أعلاه. السلالات هي مناسبة لاختبارات المنافسة في الجسم الحي في الفئران أو غيرها من النظم نموذج الحيوان. فقط التعديلات الدنيا مطلوبة لاستخراج gDNA من الأعضاء والأنسجة الحيوانية، وهذه التعديلات هي وصف جيد من قبل الشركات المصنعة لمجموعات لهذه الأغراض. وعلاوة على ذلك، تم استخدام مجموعات كبيرة من الإصابات المختلطة للمنافسة في الجسم الحي بنجاحفيالسابق 7، مما يتيح إمكانية خفض عدد الحيوانات اللازمة لتجربة واحدة، والتي لا تقلل فقط من تكاليف تلك التجارب ولكنه يقلل أيضا من إمكانية التغير بين الحيوان والحيوان. وبالمثل، يمكن استخدام سلالات الباركود في اختبارات أخرى في المختبر التي تفحص قابلية السلالات لظروف العلاج المختلفة (مثل المضادات الحيوية، وحساسية الحمض، والقتل عن طريق الأكسجين التفاعلي أو أنواع النيتروجين، وما إلى ذلك). وبالنسبة لهذه التجارب، يمكن تقييم تثبيط النمو بإضافة المادة الكيميائية المطلوبة إلى وسط النمو في الخطوة 3-4 والمضي قدماً كما هو موضح. ولتقييم الوفيات البكتيرية، يمكن أن تكون مجموعة كبيرة من السلالات مختلطة، كما يمكن تحديد المدخلات كمياً على النحو المبين أعلاه. بعد التعرض للعلاج المطلوب، يمكن تحديد الخلايا الحية بشكل انتقائي عن طريق ربط إجراء القياس الكمي الرقمي PCR مع PCR القابلة للحياة للتمييز بين الخلايا الحية والميتة21،22،23 , 24 , 25 , 26- وسيزداد الإنتاجية لمثل هذه التجارب زيادة كبيرة لأن التمييع ولوحات النسخ المتماثلة لكل سلالة يتم استبدالها بتقنيات جزيئية أكثر تبسيطا. وأخيرا، على الرغم من أن تحليل البيولوجيا التطورية وعلم الوراثة السكانية هو خارج نطاق هذه الورقة، والكائنات الباركود قابلة للتكيف للغاية لمثل هذه الدراسات. وفي نهاية المطاف، كان الغرض من هذا البروتوكول هو تطوير تقنية قوية لقياس البكتيريا التي يمكن تكييفها إلى حد كبير لاستخدامها في العديد من الأنواع المتنوعة وفي العديد من أنواع التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم البحوث التي وردت في هذا المنشور من قبل جورج ف. هاديكس رئيس صندوق بحوث الكلية والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة GM103427. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Salmonella typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
